随着以转基因技术为代表的现代农业生物技术的快速发展和转基因作物的商业化推广，对全球现有的农作物种植和生产结构产生了重要影响。自1996年首例转基因农作物产业化应用以来，全球转基因技术研究与产业化应用得到了快速发展，2014年全球转基因作物的种植面积为1.815亿hm²，比1996年的1 700万hm²增加了100多倍^[1]。转基因技术不仅通过改良农作物的产量、品质、抗病虫性等在粮食安全和农业可持续性发展中起作用，还将在生物医药领域，尤其是分子医药农业方面发挥重要作用。分子医药农业技术是通过基因工程的方法，利用植物细胞作为生物反应器来表达和生产重组蛋白质或多肽的技术，包括工业用、医药用的重组蛋白，整个生产过程涵盖了基因克隆、表达，原料种植、收获、运输、储藏，蛋白质提取、纯化、加工等技术。分子医药农业的核心是重组蛋白的表达技术，即生物反应器技术。植物生物反应器是以农业的形式完成原料生产，而加工过程和最终产品又以医药的形式完成，其将农业和制药业有机整合，因此又称为植物分子医药农业(plant molecular pharming)，其产品被称为植物源重组药物(plant made pharmaceutical,PMP)。据预测，未来5~10年植物可能成为临床治疗或诊断药品的主要生产系统。

本文针对植物生物反应器载体的构建、常用的植物受体种类和植物高效外源蛋白表达系统类型进行了综述，并对植物生物反应器在分子医药农业中的应用前景进行了展望。

生物反应器是指利用生物系统大规模生产用于医疗保健和科学研究的有重要商业价值的外源蛋白。植物生物反应器就是利用植物这个系统，包括植物细胞、组织器官及整株植物为工厂，来生产具有商业价值和医用价值的生物制品，包括疫苗、抗体、药用蛋白等。许多研究证实植物系统具有表达活性哺乳动物蛋白的能力，在产品质量、成本和安全方面已显现出优势，并很快得到科学家和生物制药业的认可。

1986年Barta等^[2]首次在烟草中表达人类生长激素蛋白并获得了成功，随后陆续有多种人类相关蛋白在不同的植物种类中得到表达。1989年Hiatt等^[3]首次利用转基因烟草将两个重组基因产物正确折叠和装配，产生具有与哺乳动物产物相同功能的抗体，证实了植物作为生物反应器的可行性。目前，在植物中已成功表达的医药有抗体类、酶类、激素类、白细胞介素、血浆蛋白和疫苗等(表 1)。

植物作为生物反应器有以下优点：①植物具有和动物细胞相似的蛋白质合成途径，唯有蛋白质糖基化方面存在差异；②植物生产外源蛋白的表达量很高；③植物生产外源蛋白更安全。植物体只表达部分免疫蛋白，不含致病微生物，没有其他病原菌污染；④生产成本低，生长周期短，微生物生产外源蛋白容易产生包涵体，增加了生产成本，动物细胞培养需要复杂的设备和昂贵的培养基。而植物的生长只需要水、土壤、养分和阳光；⑤可大规模种植，易于保存、运输；⑥干扰作用小。例如，维生素B₁₂几乎不存在于植物中，利用植物生产人类维生素结合重组内源因子(recombinant human internal factor,rhIF)，不会有干扰维生素B₁₂物质的污染，但在动物中表达rhIF会有与维生素B₁₂相互作用的咕啉结合蛋白的存在，从而干扰rhIF的表达。

随着植物生物反应器外源蛋白表达水平的提高和纯化加工技术的配套，该技术在许多发达国家已经由研究阶段转入应用阶段，一些疾病的诊断试剂、科研用试剂和动物疫苗已经获得美国农业部批准投入市场。目前生产的一些人类用医药产品已经进入临床Ⅲ期应用试验(表 1)。

一些植物生物反应器生产的蛋白质产品已经或即将投入市场，但植物反应器实际表现出来的潜力远远小于期望值，主要原因是功能性蛋白质的最终产量仍不乐观。对此，可以通过对转基因元件进行优化，从而调控外源基因的表达，增加外源蛋白的表达量。

为提高分子医药农业的目标外源蛋白的表达量，主要采用以下几种方法对目的基因及植物表达载体进行改造。①选择适当的启动子是重要的改进策略之一。目前在双子叶植物中较为常用的是来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子，而在单子叶植物中活性比较低，在单子叶植物中，玉米的ubi启动子受到亲睐。对于有些外源基因而言，使用组织特异性启动子，可使其特异性地表达于植株的目标部位。比较成功的组织特异性启动子有种子特异性启动子7S^[4]、花药绒毡层特异性启动子TA29^[5]、果实特异性启动子2A1I^[6]、马铃薯块茎启动子Patatin^[7]、番茄果实特异性启动子E82.2^[8]、香蕉果实特异性启动子ACO1^[9]等。②采用植物偏好的密码子重新合成基因全长，同时引入标签蛋白利于目的蛋白的纯化。③加入增强子序列。④降低目的基因与植物基因组或载体骨架的同源性，从而避免由于载体骨架或植物基因组的同源序列与目的基因形成发夹结构或双链RNA引起的基因沉默。⑤添加内质网滞留信号以避免植物特有的糖基化修饰。例如，H/KDELC-末端四价肽标签使植物细胞内质网膜中的抗体表达水平增加了2~10倍^[10]。⑥目的蛋白转录后修饰的“人源化”。例如，蛋白质合成途径中聚糖链的结构“人源化”，使在植物中表达的外源蛋白的糖基化修饰更接近于人，从而改变外源蛋白的分配，增加其活性和半衰期^[11]。⑦添加蛋白酶抑制剂。植物生物反应器表达的重组蛋白在植物细胞中易受蛋白水解酶的降解，从而降低了重组蛋白的产量。例如，Kim等^[12]利用丝氨酸蛋白酶抑制剂sPIⅡ，有效地降低了水稻细胞悬浮培养基中蛋白酶的活性，比没有转导sPIII基因的水稻细胞悬浮培养基中的蛋白酶活性降低了大约77%。

目前，已有多种植物成为分子医药农业的生物反应器受体系统(表 2)，包括烟草、苜蓿、生菜、玉米、小麦、水稻、番茄、苹果、马铃薯、浮萍、拟南芥、胡萝卜、油菜、菠菜、大豆等，但对于一个特定的目标蛋白，选用何种受体植物更有利于外源蛋白的高效稳定表达和经济快捷的提纯，是一个需要重点考虑的问题。

转基因植物作为反应器，目标产物可导向到叶片、种子、根系、果实和块茎。此外，目标产物还可导向到叶片的亚细胞区，如细胞间区、叶绿体、内质网膜和细胞质。在种子或块茎中表达外源蛋白稳定性高，可长期保存。例如，在室温条件下储存5个月的水稻种子中，一种单链抗体的含量和活性无明显损失；4℃条件下储存18个月的马铃薯仍有50%的活性抗体。1992年Mason等^[17]首次提出植物可食性疫苗的概念。一些果实和蔬菜可直接食用，用于可食疫苗的生产。例如，苜蓿的生物产量高，且有与动物相同的N-糖基化机制，可用于生产动物疫苗。

常用的高效植物外源蛋白表达系统类型包括生物总量表达系统、叶绿体表达系统、果实/蔬菜表达系统、悬浮细胞/发根培养系统、种子/油体表达系统、体细胞胚表达系统等(表 3)，其具有不同的优势和不足之处，详述如下。

生物总量表达系统包括瞬时表达和稳定表达。瞬时表达就是携带目的基因编码序列的植物病毒载体侵染植物的特定部位，使病毒最大限度的将目的基因在植物细胞中复制、表达。瞬时表达并不是植物表达外源蛋白，而是病毒自身表达外源蛋白。一般侵染后1~2周可提取外源蛋白，病毒蛋白的表达量很高^[18]。表达载体的载量也由最初表达少于25个氨基酸的小肽增至80kDa的重组蛋白，但是这种外源蛋白表达方式不能遗传给植物的后代。

例如，烟草花叶病毒(TMV)在烟草叶片中的生产量达到60mg/g干重，TMV衣壳蛋白占叶片总蛋白质含量的10%~40%^[19]。尽管病毒会干扰外源蛋白的正常折叠、包装、运输和复制过程，但外源蛋白的表达量还是很高，1g植物组织能产生1~3mg的外源蛋白。Márquez-Escobar等^[20]利用烟草瞬时表达系统表达的HRA2pl肽段能抑制人偏肺病毒HEp-2细胞的生长，从而能有效地预防人偏肺病毒感染。美国BioSource Technologies公司利用烟草花叶病毒Geneware载体生产的肝炎表面抗原Hepatitis B、单链抗体scFvs和其他一些重组蛋白已经进入大田试验阶段。

稳定表达是指通过农杆菌介导或微粒子轰击等方式将外源基因整合到植物核基因组中，从而获得外源基因编码的蛋白质。此方法能使外源基因稳定的遗传给植物后代。但是由于缺乏稳定的细胞内环境，编码的外源蛋白在细胞质中容易降解，导致外源蛋白表达量低，约占可溶性蛋白总量的0.5%~2.0%^[21]。Zhang等^[22]通过农杆菌介导法将HIV病毒p24衣壳蛋白转入烟草中，并能特异结合其抗体且保持免疫原性。每克叶片蛋白的p24蛋白表达量为3.5mg，可用于生产HIV疫苗和诊断试剂。

叶绿体基因工程是以叶绿体基因组为平台对植物进行的遗传操作，通过一定方法使外源基因穿过细胞膜和叶绿体双层膜进入叶绿体，在同源重组片段的介导下与叶绿体基因组之间发生同源重组,以定点整合方式进入叶绿体基因组。

叶绿体表达系统有如下优势：①拷贝数大，能使外源基因高效表达；②原核基因无需改造即可在叶绿体中表达，原核启动子也能在叶绿体中正常行使功能；③无位置效应和基因沉默现象；④环境安全性好；⑤基因产物对植物的影响小，与传统的细胞核转基因技术相比，其基因产物积累在细胞质中产生较小的负面影响。

目的基因转入叶绿体的基因组中能得到高表达的外源蛋白^[23]。例如，人生长激素表达量是总可溶性蛋白(total soluble protein,TSP)的8%^[24]，人血清白蛋白的表达量超过了TSP的11%^[25]，霍乱和破伤风毒素区段的表达量达到TSP的25%^{[26, 27]}，热稳定的木聚糖酶表达量达到TSP的6%^[28]。但是由于叶绿体表达系统不能进行转录后修饰，如糖基化，而且外源基因能从叶绿体基因组转移到细菌中，降低了其生物安全性而限制了其应用^[29]。

核基因组中表达的外源蛋白加入叶绿体靶向序列，将生产的重链抗体转移至叶绿体中，能抑制支链淀粉酶的降解^[30]。Albarracin等^[31]发现在利用烟草叶绿体转化系统生产刚地弓形虫疫苗过程中，添加了90kDa的利什曼虫热激蛋白LiHsp83作为SAG1抗原的载体，能使SAG1表面抗原的表达量提高500倍。Schillberg等^[32]利用单链抗体ScFv24，通过与哺乳动物的信号肽和膜受体跨膜区域(如人血小板源生长因子受体PDGFR或T细胞受体跨膜区TcRβ)的整合，将其蛋白质从内质网中转移到了烟草细胞的质膜中。结果发现，此融合蛋白能抵抗烟草花叶病毒的侵染，并定位在植物细胞的细胞膜上。Maldaner等^[33]利用生菜叶绿体系统生产的登革热诊断试剂，敏感度能达到71.7%，特异性达到100%。

果实/蔬菜表达系统一般用于食用疫苗的生产，作为食用疫苗必须能诱导黏膜免疫系统，因为人体和动物致病菌开始感染，首先接触的是消化道、呼吸道、泌尿生殖道的黏膜。黏膜免疫反应的诱导起始于M细胞识别抗体，再经过复杂过程形成免疫球蛋白(IgA)，经与膜上分泌组分结合，形成分泌IgA(SIgA)，输入到腔道，SIgA 与专一性抗体表位作用，从而中和入侵的病原体。

大肠杆菌热不稳定毒素B亚基(Escherichia coli B-subunit heat-labile toxin，LTB)可用于疫苗分子内佐剂，是目前人们发现的最有效的黏膜免疫原和黏膜免疫佐剂之一。将抗原基因与LTB基因融合表达，是提高转基因植物口服疫苗免疫反应性的可行策略。转基因马铃薯表达的细菌腹泻疫苗原LTB，对志愿者进行口服临床试验，发现表达LTB的马铃薯块茎在黏膜和全身的免疫反应，与接受109个产肠毒素大肠杆菌志愿者的反应相似。这是食用疫苗第一个人体临床报道，结果证明植物产生的重组LTB，通过口服可防止消化作用，并能诱导人体免疫反应。

Chen等^[34]利用农杆菌转化法将猪繁殖与呼吸道综合征病毒抗原gp5基因导入到马铃薯中，并将转基因马铃薯饲喂小鼠，在其血清和内脏中都产生了黏膜特异性抗体，为生产猪繁殖与呼吸道综合征疫苗提供了新方法。

作为食用疫苗的转基因材料，不需经过复杂的纯化过程，并且在营养器官中表达外源蛋白能阻止花粉的释放从而消除了基因漂移的危险。作为口服医疗药物，其生产、加工、储藏等都应按医疗卫生部门的要求，采用《生产质量管理规范》、《药品非临床研究质量管理规范》类似的加工过程。但是，此表达系统的缺点是表达的外源蛋白稳定性差、产量低。

外源蛋白产生的毒素对环境安全造成影响，或虫害、病害这些难以控制的外界环境影响外源蛋白表达的情况下，可采用植物细胞培养系统或发根培养系统。

植物细胞或发根培养系统的优势：植物细胞培养的培养基成分简单、不易受到微生物的污染、生产成本低、易操作、安全性高，大部分的植物病原菌不会感染人或动物；发根培养则通过发根农杆菌侵染植物根系，使植物根系自行产生激素形成发根。

20~30kDa的蛋白质能通过植物细胞壁分泌到培养基中，但是分子质量大的蛋白质则会滞留在细胞内。通过外源蛋白添加滞留信号C端H/KDEL序列会导致培养的悬浮细胞中外源蛋白的高水平聚集，然后需要通过额外其他的步骤来使细胞裂解，释放出目标蛋白。

De等^[35]将编码大肠杆菌热不稳定毒素B亚基(LTB)的基因分别转入烟草、番茄和矮牵牛发根中，在烟草和矮牵牛中每克发根中能生产出65~70μg LTB，在番茄中每克发根中能生产出10μg LTB。

SemBioSys Genetics公司开发的油体表达系统，在油类作物中将目标蛋白和油体融合在一起形成融合蛋白，此蛋白质能通过简单的抽提将其分离出来，然后再通过内切酶酶切将外源蛋白和油体分离开来^[14]。

玉米被Prodigene公司作为第一种植物应用在商业化分子医药农业中，具有生物产量高、转化体系成熟等优点。已经得到商业化生产的外源蛋白有亲和素、GUS^{[36, 37]}等，还可用于生产抗体^[38]和一些酶类(如漆酶、胰岛素和抑肽酶)^[39]。

Guerrero等^[40]报道了利用玉米表达载体生产的新城病毒抗原F融合蛋白，在玉米籽粒中能得到富集，饲喂鸡后能使其体内产生抗体，为鸡瘟疫苗的生产奠定了基础。

Stger等^[41]将编码ScFvT抗体的基因转入水稻和小麦的叶片和种子中，并使此蛋白质定位在植物细胞的非原质体和内质网上，表达量能达到30μg /g。此研究是首次利用谷类作物进行外源基因的表达。但是，目前一些谷类作物的种子表达系统还不成熟，外源蛋白表达量低，限制了该系统的广泛应用^[15]。

Fu等^[42]以转基因苜蓿的体细胞胚表达系统生产的外源蛋白量是营养器官(如根、茎、叶片等)表达量的2倍，为生产外源蛋白建立了新的高效表达系统。

医药蛋白约80%的生产成本来源于下游的加工和纯化。植物源医药产品有明显的成本优势，利用转基因植物生产药用重组蛋白的成本仅为利用大肠杆菌发酵生产成本的2%~10%，是哺乳动物细胞培养体系生产成本的0.1%^[43]。

随着现代生物技术的快速发展，生物制药占有越来越多的医药市场份额，截至2015年，全球有40种获批的植物源医药市场供应量能达到400亿美元，全球医药市场的需求量在2020年预计能达到1.3万亿美元^[44]。植物生物反应器技术以其蛋白质产量高且成本低等优势，对满足医药产品需求量的迅速增加，具有极大的商业价值和市场前景。

然而，需要指出的是，植物生物反应器生产药用蛋白还存在一些问题。例如，安全性方面，利用植物细胞作为生物反应器来表达和生产重组蛋白质或肽段不仅需要考虑转基因植物的释放所带来的生态安全问题，还需考虑在生产过程中环境对产品的影响，如病毒、致病原或杀虫剂等。