L-天冬酰胺(L-asparagine，L-Asn)，又名天冬酰胺、天门冬素、α-氨基丁二酸一酰胺，是常见的20种氨基酸之一，在食品、医药、化工合成、微生物培养等领域广泛应用^[1]。1806年，L-天冬酰胺作为第一个被分离的氨基酸，分别由法国化学家Louis和Pierre从芦笋汁中分离获得。随后陆续在各种动物和植物体内发现并分离。

L-天冬酰胺作为添加剂，与糖共热进行氨基-羰基反应，能形成特殊香味物质，用于清凉饮料。L-天冬酰胺对大脑的发育和功能是必需的，同时在肿瘤治疗及蛋白质糖基化中扮演重要角色。据报道，L-天冬酰胺能解除高谷氨酰胺抑制引发的细胞凋亡，进而实现肿瘤的治疗^[2]。L-天冬酰胺常用于氨基酸输液，以及具有降压、平喘、抗消化性溃疡、胃功能障碍等功能，并可用于治疗心肌梗死、心肌代谢障碍、心力衰竭、心脏传导阻滞、疲劳症等。此外，L-天冬酰胺能够在寡糖转移酶的作用下，与N-乙酰氨基葡糖在内质网内结合，该作用是蛋白质糖基化的重要形式，对蛋白质的结构与功能至关重要^{[3, 4, 5]}。L-天冬酰胺也是微生物培养和动物细胞培养重要的添加剂^[6]。

目前，L-天冬酰胺的制备方法主要是直接提取法和化学合成法。直接提取法是指从L-天冬酰胺含量高的天然材料中分离。例如，以白羽扇豆为原料，经发芽、成浆、加热处理等流程，在pH小于6的条件下，经硅藻土过滤、离心，获得粗品，随后经过浓缩、结晶获得成品。詹谷宇等^[7]从草木樨中成功提取获得L-天冬酰胺。直接提取法受原材料质量因素影响大，工艺复杂不易控制，且污染严重。化学合成法主要通过L-天冬氨酸与氨水进行酰胺化而得^[8]，该方法也普遍存在污染大、副反应多等缺陷。

生物合成法主要通过天冬酰胺合成酶催化铵离子或谷氨酰胺的氨基进行转移，该过程为耗能过程，需要ATP参与(图 1)^{[9, 10, 11]}。虽然该方法由于生产成本高国内外鲜有报道，但该方法具有反应条件温和、生产效率高、副产物少等优点，同时具有对设备的要求低、投资小、生产过程简单、易于操作控制等优势，具有一定的开发前景。尽管天冬酰胺合成酶能催化L-天冬氨酸合成L-天冬酰胺，但由于在转化过程中需要ATP的参与，导致成本过高，因此采用该酶进行生物转化法生产L-天冬酰胺鲜有报道，而L-天冬酰胺的制备方法也一直只有化学合成法和直接提取法。

图 1 L-天冬酰胺生物合成 Fig. 1 Bio-synthesis pathway of L-asparagine

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天冬酰胺合成酶是由负责水解谷氨酰胺活性部位的N端的两个反平行β折叠片层以及C端负责结合Mg²⁺、ATP和L-天冬氨酸的区域两部分组成。天冬酰胺合成酶可分为天冬酰胺合成酶A和天冬酰胺合成酶B，前者只可以利用铵离子进行L-天冬氨酸的酰胺化，后者的氨基既可来源于谷氨酰胺，也可以来源于铵离子。天冬酰胺合成酶A主要存在于微生物中，目前科研人员已经克隆并表达了多种微生物来源的天冬酰胺合成酶A基因^[11]。天冬酰胺合成酶B广泛存在于植物中，因单萜化合物有抑制天冬酰胺合成酶的功能，该酶常被作为除草剂靶标应用于农业生产^[12]。

利用分子生物学手段，PCR扩增来源于大肠埃希氏菌E.coli JM109的天冬酰胺合成酶A基因(asparagine synthetase A,asnA)，诱导表达后，利用菌体自身糖酵解功能合成的ATP进行全细胞催化，实现从L-天冬氨酸向L-天冬酰胺的生物转化合成，有效解决了L-天冬酰胺生产过程中消耗ATP的高成本问题，为L-天冬酰胺制备提供了一条新的绿色生产途径。

Escherichia coli JM109、E.coli BL21(DE3)、pET28a(+)为实验室保藏；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)、硫酸卡那霉素(Kan)、DNA Marker、蛋白质Marker、分子生物学试剂盒购于天根(北京)；异硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate,PITC)、ATP购于生工(上海)；培养基购于陆桥(北京)；其他化学试剂均为国产分析纯或色谱纯。

采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取E.coli JM109基因组DNA，以此为模板，以AsnAU(5′-GCC GAA TTC ATG AAA ACC GCT TAC-3′，携带EcoRI酶切位点)和AsnAD(5′-GTT AAGCTT TTA CAG CAG AGA AGG GAC-3′，携带Hind III酶切位点)为引物PCR扩增asnA，经EcoRI和Hind III酶切后连接至相同酶切后的pET28a(+)，转化E.coli BL21(DE3)后筛选转化子进行PCR及酶切鉴定，选取阳性克隆测序分析。

将构建的基因工程菌于LB/Kan(含50μg/ml Kan的LB培养基)中37℃过夜培养后，1%转接LB/Kan培养液3h后加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG 25℃诱导6h，收集菌体，超声破碎后离心收集上清液进行SDS-PAGE分析。

酶活力定义：在200mmol/L L-天冬氨酸、10mmol/L MgCl₂、10mmol/L NH₄Cl、10mmol/L ATP、100mmol/L Tris-HCl (pH8.0)、菌体湿重20mg/ml体系下，37℃催化反应30min，以每分钟催化L-天冬氨酸产生1μmol L-天冬酰胺所需的酶量定义为1个酶活单位 (U)。

以正丁醇∶冰乙酸∶水= 6∶5∶2为展层剂对L-天冬氨酸和L-天冬酰胺标准品混合物(各10mmol/L)、酶催化反应产物[以BL21(DE3)/pET28a(+)-asnA菌体裂解上清液为酶原]、细胞催化反应产物[以BL21(DE3)/pET28a(+)-asnA全细胞为酶原]、空白对照催化产物[以BL21(DE3)/pET28a(+)菌体裂解上清液为酶原]进行薄层层析(TLC)定性分析，其中反应体系为酶活力测定反应体系。

定量分析采用PITC柱前衍生-高效液相(HPLC)方法^[13]，将200μl 0.1mol/L的PITC乙腈溶液分别加入400μl 1mg/ml的L-天冬氨酸和L-天冬酰胺水溶液中，随后加入200μl 1mol/L的三乙胺乙腈溶液，室温衍生1h后加入800μl正己烷充分振荡混匀，室温静置萃取10min，吸取下层液体，随后对衍生后的不同浓度L-天冬氨酸、L-天冬酰胺混合物(各0.25mg/ml、0.2mg/ml、0.15mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml和0.025mg/ml)进行色谱分离，分离条件为：色谱柱：Shim-Pack VP-ODS 250min× 4.6mm，5μm；流动相：A(0.1mol/L 乙酸铵∶乙腈=97∶3)，B(乙腈)；流速：0.6mL/min，柱温：38℃；以UV254检测，并绘制标准曲线。

配制全细胞催化反应体系，其中含有1mol/L L-天冬氨酸(以氨水调pH至8.0)，0.02mol/L葡萄糖、2mmol/L氯化镁。离心发酵液，收集菌体，无菌水清洗后，将菌体加入转化体系中，使菌体浓度至OD_600nm=10。37℃、50r/min催化反应10h，定时取样以PITC-HPLC法检测不同时间L-天冬氨酸和L-天冬酰胺，根据标准曲线计算对应浓度。

底物和产物的标准曲线绘制，以及催化反应体系监测数据均采用Origin Pro 8进行分析。

目的基因asnA采用常规基因工程方法获得，经PCR扩增、连接、转化、鉴定获得阳性克隆，结果如图 2所示，经PCR扩增，可于1 000bp处观察到明显的条带，回收后酶切、连接至表达载体，转化E.coli BL21(DE3)，筛选转化子，进行PCR和酶切鉴定，于1 000bp处可见明显的目的基因PCR扩增条带和酶切条带。经测序分析，获得的目的基因与已知序列同源性为99.9%，仅一个碱基差异；蛋白质序列同源性为100%。表明已成功构建基因工程菌株，命名为E.coli BL21/pET28a(+)-asnA。

图 2 asnA基因克隆及转化子鉴定 Fig. 2 Identification of the transformants M: Marker; 1: PCR product; 2: Identification by PCR; 3: Identification by enzyme digestion

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将诱导表达的工程菌裂解液进行SDS-PAGE分析，结果如图 3所示，与不含目的基因的菌株E.coli BL21/pET28a(+)菌体裂解液相比，于约37kDa处可见一明显条带，与预期大小36.6kDa相符。

图 3 蛋白质电泳SDS-PAGE Fig. 3 SDS-PAGE analysis M：Marker；1：Lysate of BL21(DE3)/pET28a(+)-asnA；2：Lysate of BL21(DE3)/pET28a(+)

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以菌体细胞为酶原按酶活力定义方法测定表达的天冬酰胺合成酶A的活力，其比酶活力为1 786.6U/g。

以TLC方法对ASNA催化L-天冬氨酸转化生产L-天冬酰胺进行分析，结果如图 4所示，细胞裂解上清液和全细胞催化反应后，均可于L-天冬酰胺对应位置出现阳性条带，并且上清液和细胞的催化效率几乎没有差异。

图 4 L-天冬氨酸和L-天冬酰胺定性分析 Fig. 4 Qualitative analysis of L-aspartic acid and L-asparagine Asp: L-aspartic acid; Asn: L-asparagine; Ctrl: Control; Enzyme: The catalytic reaction by the supernatant of cells lysate; Cell: The catalytic reaction by cells

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通过PITC-HPLC对不同浓度的L-天冬酰胺和L-天冬氨酸进行分析，L-天冬氨酸保留时间为5.39min，L-天冬酰胺保留时间为6.40min[图 5(a)]。通过峰面积与浓度绘制标准曲线图[5(b)、(c)]，拟合方程分别为：L-天冬氨酸，Y=313.053 60X+0.557 85，R²=0.999 96；L-天冬酰胺，Y=287.072 31X+0.512 33，R²=0.999 97。

图 5 PITC-HPLC分析及标准曲线 Fig. 5 PITC-HPLC detection and the standard curves of the samples

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如何解决ATP的来源在该研究中至关重要。糖酵解是指将葡萄糖或糖原分解为丙酮酸的过程，此过程中伴有少量ATP生成，该过程在细胞质中进行，无需耗氧，每一反应步骤都由特异的酶催化；随后，在有氧条件下，丙酮酸可进一步氧化分解生成乙酰-CoA，并产生ATP；最后，乙酰-CoA进入三羧酸循环，生成CO₂和H₂O，并伴有ATP产生^{[14, 15]}。上述糖酵解及三羧酸循环的整个过程，每分子葡萄糖可产生不低于30个ATP分子，为L-天冬氨酸转化生产L-天冬酰胺提供必需的ATP，成功解决了ATP成本过高的生产难题。

以全细胞为酶原催化L-天冬氨酸转化生产L-天冬酰胺，每小时取样一次，以PITC-HPLC法测定L-天冬氨酸和L-天冬酰胺，根据标准曲线计算L-天冬氨酸和L-天冬酰胺浓度，结果如图 6所示。随着时间的延长，反应体系中L-天冬氨酸含量降低，L-天冬酰胺含量上升，8h时，L-天冬酰胺含量达高点，产量为126.5g/L，此时L-天冬氨酸的转化率达95.8%，生产速率达15.81g/(L·h)。

图 6 转化过程中底物与产物含量分析 Fig. 6 Measuring of product and substrate content

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本研究建立了一套L-天冬酰胺生物转化生产工艺，通过克隆天冬酰胺合成酶A基因并构建高效表达该酶的基因工程菌株，实现从L-天冬氨酸到L-天冬酰胺的生物酶法催化合成。以全细胞为酶原催化该反应，以葡萄糖替代ATP，通过菌体细胞自身的葡萄糖酵解体系和三羧酸循环，实现ATP的合成与再生，进而成功解决了L-天冬酰胺生物转化生产工艺中ATP成本过高的难题。该研究对L-天冬酰胺产品绿色生产及现有技术改造与升级具有指导意义。