细胞自噬是对细胞内长寿命蛋白质和受损细胞器进行自我消化的现象，是真核生物中普遍存在的一种保守的细胞行为^[1]。自噬过程中出现由双层膜形成的泡状结构，其中包裹着细胞器和部分细胞浆，最终和溶酶体融合使其内容物降解，这一完整的过程称为自噬流(autophagic flux)。自噬在生命体的绝大多数细胞中都存在一个基础水平，以调节长寿命蛋白的周转和处理损伤的细胞结构，在饥饿、雷帕霉素等刺激因素下，自噬水平会激发到一个比较高的水平，而在巴佛洛霉素 A1 存在的条件下，自噬流会被抑制^[2]。大量研究已经表明，细胞自噬在真核生物的生长发育、各种生理和病理变化中发挥着重要作用，在机体各种疾病的发生发展中起着重要作用 ^{[1, 2]}。虽然目前对自噬发生的过程和机制有了较深入的认识^{[3, 4, 5, 6]}，但是对自噬过程中的很多细节依然缺乏足够了解，如自噬体膜来源、自噬体膜如何扩展、选择性自噬的调控机制和参与自噬的协同调控的分子等^{[1, 7]}。其中一个限制性因素是缺乏有效的细胞内自噬水平的检测方法。

以前认为自噬降解过程对其底物没有特异性，现在已经证明自噬对其底物有一定选择性，这种选择性主要是通过选择性自噬来实现的^{[8, 9]}。选择性自噬过程中需要接头分子(也称为自噬受体)，目前发现的这类接头主要有p62/SQSTM1、NDP52、NBR1、Nix等。接头分子一般都含有LC3相互作用结构域和泛素结合结构域，通过LC3相互作用结构域与LC3相互作用，在自噬体形成过程中被自噬体包裹，最终通过溶酶体降解，其泛素结合结构域结合的目标分子也被溶酶体降解。由于这类接头分子的细胞内含量受到自噬水平的明显调控，因而接头分子在细胞内的蛋白质水平可以反映细胞内的自噬流。这类接头分子中研究得最多的是SQSTM1蛋白，它在细胞内的水平已经被证明受到细胞内自噬水平的调控，其蛋白质水平与细胞自噬流呈负相关^{[8, 10, 11, 12]}。

本研究将SQSTM1与萤火虫荧光素酶基因融合形成一个融合基因SQSTM1-luc(SQSTM1-luciferase)，利用SQSTM1-luc被自噬选择性降解的特点，通过检测细胞内的荧光素酶活性，可以反映细胞内的自噬流水平，使检测细胞内的自噬流水平变得简单，使该方法适用于通量化及工程化筛选。使用该方法进行的初步筛选成功地获得了新的自噬和凋亡相关基因。

DMEM培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)、Opti-MEM购自美国 Life Technologies 公司；转染试剂 Megatran 1.0 为 Origene 公司产品；新霉素类似物G418购自Promega公司；胎牛血清购自美国 Hyclone 公司；BCA Protein Assay 蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所；硝酸纤维素膜(NC 膜)购自 Whatman 公司；蛋白酶抑制剂 Cocktail 购自罗氏诊断公司；Superscript II cDNA 第一链合成试剂盒、TRIzol、DEPC 均购自 Invitrogen 公司；SQSTM1 抗体购自 MBL International公司；抗 β-actin、EBSS(Earles’s Blanced salts solution)、雷帕霉素(Rapamycin)及巴佛洛霉素 A1(Bafilomycin A1) 购自 Sigma 公司； 抗荧光素酶抗体来自 Promega 公司；DyLight 800及DyLight 680 标记的二抗购自 Rockland 公司；FITC、TRITC 标记的二抗购自 Rockland 公司；荧光素酶报告系统(Dual Luciferase Reporter System)购自 Promega公司。

Heal Force 生物安全柜(力康生物公司)，Labcycler PCR仪(Sensquest公司)，Polystat 恒温水浴箱(Cole Parmer公司)，垂直蛋白质电泳装置及蛋白质湿式电转移装置(Bio-Rad公司)，Odyssey Infrared Imager(Licor Bioscience公司)，共聚焦显微镜(LEICA，SP5)，倒置荧光显微镜(Olympus公司)，GS-15R 离心机(Beckman公司)，UV-640 分光光度计(Beckman公司)，GENE Snap 凝胶成像系统(Olympus公司)，恒温摇床 Gyrotory Water Bath Shaker G76(NBS公司)，Veritas^TM Microplate Luminometer(Turner Biosystems公司)。

PolyQ80-luciferase表达质粒由华盛顿大学 Conrad C. Weihl 博士惠赠。萤火虫荧光素酶编码基因从 PolyQ80-luciferase 表达质粒上扩增获得并用限制性内切核酸酶和T4连接酶重组到 pcDNA3.1 载体的多克隆位点，得到 pcDNA3.1-luciferase 重组质粒，表达 luciferase 蛋白；SQSTM1 编码基因从 HeLa 细胞的 cDNA 文库扩增获得，并插入 pcDNA3.1-luciferase 质粒的多克隆位点，使之形成 pcDNA3.1-SQSTM1-luciferase 重组质粒，表达 SQSTM1-luciferease 融合蛋白。其它质粒为本实验室库存，所有质粒均经过测序确认。

实验中所用质粒均使用Axygen公司的AxyPrep 质粒大提试剂盒和北京康为世纪生物科技有限公司的去内毒素质粒抽提试剂盒提取，提取过程按试剂盒说明书进行。质量浓度使用分光光度计定量测定。

HeLa 细胞培养于含 10%胎牛血清的 DMEM 完全培养基中，常规传代。利用 Megatran 1.0 进行转染实验，按产品说明书所述进行。在转染前 24h将 HeLa 细胞铺于适当培养板中，将质粒用 Opti-MEM 稀释至合适浓度，每 μg 质粒加入 3μl Megatran 1.0 转染质粒，加入后迅速剧烈混匀，室温放置 10min，将 DNA-Megatran 1.0 复合物缓慢加入细胞培养板中，摇匀，在 5%CO₂、37℃的培养箱中培养 4h后换液，继续培养直至后续实验。

为构建稳定表达 SQSTM1-luciferase (SQSTM1-luc)的 HeLa 细胞系，转染 SQSTM1-luc 表达质粒(该质粒中还含有可在真核细胞中表达的新霉素抗性基因) 24h后加入 1mg/ml 浓度 的 G418 继续培养，G418是新霉素类似物，可特异性筛选出表达新霉素抗性蛋白(成功转入SQSTM1-luc质粒)的细胞，每三天换一次含同样浓度 G418 的培养基，部分成功转入SQSTM1-luc质粒的细胞中会发生质粒DNA整合至细胞核内染色体DNA中的事件，形成可以遗传至子代细胞的G418抗性表型的细胞克隆。G418通过干扰核糖体功能抑制蛋白质合成，从而对细胞产生毒性，未发生DNA整合的细胞由于不能产生具有G418抗性的子代细胞逐渐死去，培养皿中形成肉眼可见的细胞单克隆后进行单克隆挑选并扩增，之后用EBSS检测其荧光素酶活性对饥饿诱导的自噬的敏感性，以相对光单位(relative light unit，RLU)表示测量值。

HeLa 细胞总蛋白质的提取:将细胞用冰预冷的1×PBS 洗两遍，加入细胞裂解液(20mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，150mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，1mmol/L EGTA，1% Triton X-100，蛋白酶抑制剂 Cocktail)，吹吸混匀，冰上放置 20min，4℃，12 000g 离 心 10min，上清液转入新管，按照 BCA 蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白质定量。每个样品取 30μg，加入蛋白质上样缓冲液，于 98℃金属浴变性 5min，12.5%PAGE 电泳；100V电转1~2h；5%牛奶(TBS 配制)室温封闭 1h；一抗 4℃孵育过夜；用 TBS 充分洗膜3次，每次8min；然后加入相应的 DyLight 680/800标记的二抗，室温避光孵育1h；TBS 洗膜后使用 Odyssey Infrared Imager 检测。

HeLa细胞铺入共聚焦小皿中长至70%~90%密度，使用Megatran1.0转染 SQSTM1-luciferase表达质粒，转染24min后，细胞用4% 多聚甲醛固定，室温15min，然后用0.2%的Triton X-100透膜处理，室温15min，10%胎牛血清室温封闭1h，然后加入2%胎牛血清稀释的抗SQSTM1和抗luciferase抗体，室温孵育1h，PBS洗3次后，再加入FITC/TRITC标记的二抗室温孵育1h，PBS洗3次后使用共聚焦显微镜观察。

数据的标准差代表实验中不同分组之间的差异；Student’s T检验分析各组之间是否存在显著性差异，P<0.05认为具有统计学差异。

SQSTM1蛋白在细胞内以可溶性及与其它分子一起形成蛋白聚集体的形式存在，形成颗粒样聚集体是SQSTM1作为自噬受体的重要体现。利用SQSTM1-luc作为自噬检测工具，则SQSTM1-luc在细胞内的分布必须要与SQSTM1一样，才能提示两者在细胞内有相同功能。为此，我们将SQSTM1-luc表达质粒转染HeLa细胞，利用luc抗体及SQSTM1抗体进行免疫荧光染色，发现SQSTM1-luc与SQSTM1在细胞内的定位完全一致(图 1)，证明两者在细胞内有类似亚细胞分布，提示SQSTM1-luc与SQSTM1在细胞内具有相似功能。

图 1 细胞内源SQSTM1与SQSTM1-luc融合蛋白共定位 Fig. 1 Co-localization of cellular endogenous SQSTM1 protein and SQSTM1-luc protein (a) SQSTM1 (b)SQSTM1-lnc (c) Merge SQSTM1-luc expressing plasmid was transfected into HeLa cells. 24h later,cells were fixed and stained with fluorescent-labeled antibodies through SQSTM1 antibody and luc antibody. Images were taken under confocal microscope

图选项

为了证明自噬在SQSTM1-luc降解过程中的重要性，SQSTM1-luc和luc表达质粒分别转染HeLa细胞，48h后加入雷帕霉素(RAPA)和巴佛洛霉素A1(Baf.A1)，或将培养基换成饥饿培养基EBSS，发现EBSS和RAPA能够显著降低 SQSTM1-luc 质粒转染细胞中荧光素酶的活性[图 2(b)]；Baf.A1 处理则升高细胞中荧光素酶的活性[图 2(b)]。Baf.A1是细胞中囊泡 H⁺-ATPase 的抑制剂，可抑制溶酶体的酸化，进而阻碍自噬体与溶酶体的融合，导致自噬流下降或消失。而luc质粒转染的细胞中的荧光素酶活性在 EBSS、雷帕霉素、Baf.A1 的处理下并无显著变化[图 2(a)]。EBSS 和雷帕霉素都是经典的自噬诱导因子，Baf.A1 则是常用的自噬抑制剂^{[10, 11]}。这些结果证明了自噬在 SQSTM1-luc 降解过程中发挥了关键作用，也说明细胞内SQSTM1-luc荧光素酶活性可以用来体现细胞内的自噬流水平。

图 2 SQSTM1-luc融合蛋白通过自噬途径降解 Fig. 2 SQSTM1-luc fusion protein was degraded through autophagy (a)HeLa cells were transfected with luciferase expressing plasmid for 48h Rapamycin and bafilomycin A1 were added separately into media for 6h,or medium was replaced by EBSS for 6h. Then cellular luciferase activity was assayed (b) Cell treatment was as same as (a) except the plasmid transfected was SQSTM1-luc expressing plasmid The fold changes of readouts were normalized to control group. ** P<0.01; n.s: no significant difference

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由于细胞转染会在筛选过程中增加步骤及对筛选结果稳定性有一定影响，因此，构建稳定表达细胞系以避免转染步骤，将提高SQSTM1-luc应用的方便性及适用性。我们将 SQSTM1-luc 表达质粒转染 HeLa 细胞并利用 G418 筛选得到稳定具有荧光素酶的单细胞克隆(图 3)。由于在质粒整合到细胞基因组的过程中，整合位点及整合位点附近基因组序列的影响，并不是每一个稳定克隆都是我们所期待的细胞克隆，因此需要对这些单细胞克隆的荧光素酶活性进行检测。从这些细胞克隆中初步得到三个对EBSS处理较敏感的细胞克隆(图 3；克隆 5、6、11)，利用相对最敏感的细胞克隆11进行后续验证及筛选。

图 3 稳定表达SQSTM1-luc融合蛋白的HeLa细胞克隆筛选 Fig. 3 The construction of stable SQSTM1-luc expressing HeLa cell lines SQSTM1-luc expressing plasmid was transfected into HeLa cell for 24h. G418 was added into medium and survival cell clones were plated into 96-well plate for EBSS starvation for 6h. Then cellular luciferase activities were assayed. RLU: relative light unit

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为了确定上述稳定表达SQSTM1-luc的细胞系(细胞克隆11)能够用于检测细胞内自噬流水平，我们对该细胞系进行相应处理，在 EBSS 和雷帕霉素处理6h后细胞内荧光素酶活性显著降低[图 4(a)]，在 Baf.A1 处理6h后使荧光素酶活性显著升高[图 4(a)]。利用luc抗体通过免疫印迹的方法检测了细胞内SQSTM1-luc的蛋白质水平，结果显示SQSTM1-luc的蛋白质水平的变化与荧光素酶活性检测的变化一致[图 4(b)]。

图 4 稳定表达SQSTM1-luc的HeLa细胞对自噬诱导剂的的反应 Fig. 4 Responses of stable SQSTM1-luc expressing HeLa cell to autophagy inducers (a) Stable SQSTM1-luc expressing HeLa cells were treated with EBSS,rapamycin or bafilomycin A1,respectively 6h later,cellular luciferase activities were assayed (b) Cell treatment was as same as (a) except the cells were assayed by immunoblot with lucifrase antibody RLU: Relative light unit; ** P<0.01

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为了进一步确定可以利用该SQSTM1-luc表达细胞系来进行基因筛选，将该细胞系转染自噬过程中的关键分子 Beclin1、ATG5 和 ATG4B 表达质粒，48h后收集细胞，进行荧光素酶活性检测，结果证明，转染 Beclin1 和 ATG5 的细胞中，荧光素酶活性显著下降[图 5(a)]，提示过表达 Beclin1 和 ATG5 诱导的自噬促进了细胞内 SQSTM1-luc 的降解，ATG4B 在细胞中的高表达对荧光素酶活性变化影响不明显[图 5(a)]，虽然ATG4B可以控制LC3-II的形成，但该过程是可逆过程，该结果与文献报道过表达 ATG4B 对自噬的诱导作用并不明显的结果类似^{[13, 14]}。利用luc抗体进行的免疫印迹实验证明，SQSTM1-luc 的蛋白质水平变化与荧光素酶活性变化一致[图 5(b)]。

图 5 稳定表达SQSTM1-luc的HeLa细胞对自噬调控基因的反应 Fig. 5 Responses of stable SQSTM1-luc expressing HeLa cell to autophagy-related genes (a) Beclin 1,ATG5 and ATG4B expressing plasmids were separately transfected into stable SQSTM1-luc expressing HeLa cells for 48h Cellular luciferase activity were assayed (b) Treatments were the same with (a) except the cells were assayed by immunoblot with lucifrase antibody RLU:Relative light unit

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这些结果证明了该稳定表达 SQSTM1-luc 细胞系中的荧光素酶活性可以作为反映细胞内自噬流水平的指标，并提示该方法可以用来进行高通量筛选。

虽然目前对自噬的发生过程及其机制有了较深入的了解，但是这个过程中有多个环节并不清楚^{[1, 2, 4, 7, 15]}，这主要是因为目前研究自噬的方法和工具有限，通过可行的方法将参与自噬调控的相关分子挖掘出来显得非常重要。近年自噬检测技术的进步给深入探索自噬各个过程的机制和调控提供了可能，并出现了在基因组规模水平进行筛选的文献报道^{[16, 17]}。

目前常用的筛选方法主要有基于自噬降解底物、Atg4 酶促活性和LC3(GFP-LC3)的方法，而LC3 分子是经典的自噬 marker。细胞内的 LC3 在翻译后通常被 Atg4 切掉羧基端的精氨酸残基变成胞质LC3-I，在自噬发生过程中，细胞内的 LC3-I 被脂化为膜结合形式的 LC3-II，因此可以通过检测细胞内 LC3-II 的蛋白质水平的变化来反映细胞内的自噬水平，也可以将GFP与LC3形成融合蛋白(GFP-LC3)，通过观察其在细胞内的点状分布变化来反映细胞内的自噬水平^{[10, 11, 18, 19, 20]}。2010 年和 2012 年分别有两篇文章报道了利用 GFP-LC3 在细胞内的点状分布变化，进行自噬分子的筛选。第一篇通过全基因组范围的 siRNA 筛选发现了大量在营养状态下调控细胞内自噬水平的基因^[16]；第二篇结合 EBSS 诱导的全基因组范围的 siRNA 筛选也发现了一些对自噬调控起重要作用的基因^[17]。本实验室也曾报道利用共转染 GFP-LC3 和人类编码基因，通量筛选诱导自噬的基因 ^[21]。另有一种利用 LC3 的方法是将海肾荧光素酶基因与 LC3 融合(RLuc-LC3)并在细胞内表达，通过检测海肾荧光素酶活性的变化来反映细胞内的自噬水平^[22]。Atg4 是 LC3/Atg8 加工成LC3-I/II中的关键蛋白酶，将 CFP 和 YFP 分别与 LC3(或GATE-16)的氨基端和羧基端融合，通过检测细胞中的荧光共振能量转移来反映 CFP-LC3-YFP 的加工情况，从而反映 Atg4 的酶活性变化^[23]；另有一种检测 Atg4 酶活性的方法是将 LC3 与可检测的酶融合，只有 LC3 发生切割并与该酶分离后该酶才会有活性，通过检测与 LC3 融合的酶的活性来反映 Atg4活性^[24]。这两种方法都通过检测自噬调节小分子化合物库得到了检验。自噬降解底物有多种，一种是利用细胞内形成的蛋白聚集体只能通过自噬体途径降解的方法。例如，将致病性亨廷顿蛋白的80个串联谷氨酰胺(形成不溶蛋白聚集体)与荧光素酶形成融合蛋白 (polyQ80-luc)，同时将编码胞质可溶蛋白的正常长度的19个串联谷氨酰胺也与荧光素酶形成融合蛋白(polyQ19-luc)，通过检测平行转染细胞内 polyQ80/polyQ19 荧光素酶的活性比值来反映细胞内自噬流的水平^[25]。另一种是利用自噬接头蛋白通过选择性自噬途径降解的特点，如将 SQSTM1 与 GFP 蛋白形成融合蛋白，可以通过流式细胞仪、荧光显微镜等检测细胞内 GFP-SQSTM1 的荧光水平来反映细胞内的自噬流^[12]。

在本研究中我们将 SQSTM1 与萤火虫荧光素酶编码基因融合形成表达 SQSTM1-luc 蛋白的融合基因，通过测试发现其可用作自噬筛选的工具(图 1、图 2)。通过构建稳定表达 SQSTM1-luc 蛋白的细胞系，该方法得到了优化，更适于进行通量化筛选。与 GFP-LC3 方法相比，本方法可以直接检测细胞内的自噬流水平。单独统计GFP-LC3 斑点分布不能区分是由于自噬体与溶酶体的融合受到抑制还是自噬流本身水平发生变化导致的 GFP-LC3 分布变化(需要结合自噬流抑制剂才能确定)，而 SQSTM1 蛋白的变化反映的是自噬流水平，无需借助自噬流抑制剂。与 RLuc-LC3 方法相比，由于 LC3-II 在自噬体膜内外两侧都有分布，而且Atg4还可以催化其由LC3-II 变成 LC3-I 而脱离自噬体，所以 RLuc-LC3 的降解水平不能完全反映细胞内的自噬水平，使检测结果可能偏低；而 SQSTM1-luc 一旦被自噬体包裹就被送到溶酶体降解，检测结果更准确。与检测 Atg4 酶活性的方法相比较，由于过表达Atg4 对细胞内的自噬水平影响不大^{[13, 14]}，所以仅有Atg4 酶活性的变化并不一定意味着细胞内自噬水平发生了很大变化，而SQSTM1-luc的降解直接和自噬流相关，检测结果所反映的细胞内自噬水平更可信。与 polyQ80-luc方法相比，该方法通常需要平行转染 polyQ80-luc 和 polyQ19-luc，不便于实验操作，而稳定表达 SQSTM1-luc 细胞系的建立，只需转染过表达质粒或 siRNA 即可检测细胞内自噬水平，如果是筛选化合物分子则无需转染，便于通量化筛选。SQSTM1-luc 只需要普通发光检测仪即可进行通量化检测，不必像 GFP-SQSTM1 那样借助高配的荧光显微镜(或高内涵成像技术)或流式细胞仪进行量化检测。

利用稳定表达 SQSTM1-luc 细胞系作为自噬检测方法也有其不足之处，但这些不足之处可以通过后续验证克服。以筛选基因为例，最主要的一点就是细胞内荧光素酶活性的变化可能由三种因素导致:①调节自噬的基因：自噬水平变化导致SQSTM1-luc 蛋白降解程度变化(这是我们预期的)，荧光素酶活性降低即表示促进自噬，升高即表示抑制自噬。②调节SQSTM1表达水平的基因：内源 SQSTM1 表达水平变化干扰自噬对 SQSTM1-luc 蛋白的特异降解。例如，上调 SQSTM1 表达的基因可能因 SQSTM1 竞争性地与 LC3 结合而导致 SQSTM1-luc 蛋白降解减少，引起荧光素酶活性增高，反之则降低。③调节细胞增殖或死亡的基因：稳定表达 SQSTM1-luc 细胞中荧光素酶活性与细胞数量成正比关系，促增殖基因可以导致荧光素酶活性上升，诱导死亡或抑制增殖基因会导致荧光素酶活性降低。另外，由于 SQSTM1 参与诸如信号转导及细胞凋亡等许多细胞内的过程^{[8, 26, 27, 28, 29, 30]}，其表达水平与自噬的关系可能会受到许多其他因素的影响，特别是在我们目前还不完全清楚自噬各个调控过程的情况下。

通过一个较小规模的基因库的筛选，我们得到多个潜在自噬和凋亡调控基因，部分已进行了进一步的研究并发表，如TMEM208^[31]和RNF121^[32]。丰富了对自噬和凋亡的了解，并为该方法进一步应用于自噬调控分子的筛选工作打下了基础。