独行菜(Lepidium apetalum Willd)为十字花科独行菜属植物，分布非常广泛，具有药用和食用等价值^[1]。独行菜干燥成熟的种子被称为北葶苈子，始载于《神农本草经》，是中医临床上常用的泻肺平喘、利水消肿药^[2]。目前，还发现独行菜种子在调血脂、抗癌、抗菌、强心等方面具有显著的药理活性^[3]。通过研究其药效物质基础及作用机制，现已从独行菜种子中分离出芥子苷、强心苷类、生物碱类、黄酮类、类萜类等多种成分^[4]。对其转录组的研究，可能发现一些与其药效活性成分生物合成相关的候选基因，为独行菜药效资源的充分利用奠定基础。

简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)又称为微卫星(microsatellite)，是由少数几个核苷酸组成的串联重复序列，广泛分布于各类真核生物、原核生物以及病毒基因组中^[5]。SSR标记因其多态性高、重复性高、覆盖面广等优点，广泛运用于遗传图谱绘制、遗传多样性分析和分子标记辅助育种等方面^{[6, 7]}。目前药用植物中已有人参^[8]、连翘^[9]和黄芩^[10]等借助现有测序数据开发了SSR标记。研究主要集中于遗传多样性评价、种质鉴定、标记通用性等方面。因而对独行菜转录组中的SSR位点进行分析，可为独行菜遗传多样性研究和分子标记开发提供参考和借鉴。

目前，独行菜虽然具有重要的药用价值和经济价值，但有关研究多集中在有效成分提取、鉴定及药理学方面，对其分子遗传和转录组的研究仍十分缺乏。近年来转录组高通量测序技术的快速发展极大地促进了植物基因表达研究^{[11, 12, 13]}。利用与研究独行菜的药用价值，迫切需要它的遗传信息。前期研究中，我们发现低温层积后的独行菜种子，经高温处理后，萌发势和萌发率均显著提高^[14]。由于种子萌发过程与其成熟过程有很大的相似^{[15, 16, 17]}，因此以上述处理前后的独行菜种子为研究对象，进行转录组的测序，以期分析独行菜种子转录组的特性及SSR位点分布特征。这将为发掘和鉴定独行菜种子次级代谢物生物合成相关基因和开发SSR分子标记提供研究基础。

供试材料独行菜种子采集于新疆乌鲁木齐鲤鱼山。挑选出饱满的独行菜种子，用98％浓硫酸处理45s后，用滤纸先将浓硫酸吸净干燥独行菜种子，再放入蒸馏水中清洗2次或3次。

将4℃条件下层积9天的种子作为萌发初期Ⅰ，将4℃条件下层积9天后又在25℃黑暗萌发55min的种子作为萌发初期Ⅱ，每组实验重复两次。采用Trizol Reagent方法分别提取以上样品的总RNA，并用DNaseⅠ进行DNA消化处理，随后检测总RNA完整性和质量(1.2%琼脂糖凝胶电泳)、RNA的纯度(OD_260/280比值)，最后用Agilent 2100精确检测RNA的完整性。

样品检测合格后，为了减少实验操作误差使样品更具代表性，将各个样品的总RNA进行等量混合后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，随后将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，进行测序文库的构建和Illumina HiSeq^TM 2000的测序。

测序得到的原始reads，去除带接头的reads、N(N表示无法确定碱基信息)的比例大于10%的reads和低质量reads后，得到clean reads。采用Trinity^[18]对clean reads进行拼接。过滤和组装以后得到高质量的unigene，对这些从头组装的unigene进行后续的分析。用NCBI蛋白质数据库(NCBI non-redundant protein sequences，Nr)、非冗余核苷酸数据库(NCBI nucleotide sequences，Nt)、Swiss-Prot(a manually annotated and reviewed protein sequence database,Swiss-Prot)基因本体论(gene ontology，GO)、直系同源基因簇(eukaryotic ortholog groups，KOG)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)数据库做参考，得到unigene的功能注释信息。根据Nr注释的信息，使用Blast2GO^[19]和WEGO^[20]进行注释和功能分类。用ESTScan软件预测无法注释到蛋白质库的unigene编码区。

利用MISA软件对独行菜转录组中的unigene进行SSR位点搜索，搜索参数设置为单碱基、二碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基的最短重复分别为10、6、4、3、3、2。复合SSR序列两个位点最大间隔碱基数位：100。 SSR位点出现的频率fc=c/n×100%，c表示搜索到的SSR 数量，n表示总搜索unigene数量。

独行菜转录种子组测序总产出35 735 388条reads，去除低质量的和含有接头的reads以后，得到35 177 252条clean reads，共计4.4G个核苷酸(nucleotide，nt)。G+C含量为43.6%，Q30(测序错误率≤0.1%)为93.70%(表 1)。说明测序结果较好。

利用Trinity软件对这些reads进行组装，得到平均长度为1 262nt(N50=2 053nt)的拼接转录本序列67 045条。取每条基因中最长的转录本作为unigene，平均长度为955nt，N50为1 729nt。Unigene的长度分布显示(表 2)，长度大于1 000nt的unigene有12 962条，占全部unigene的32.16%。说明本研究中转录组文库的测序和组装结果都较好，能够进行后续生物信息学分析。

通过blastx将unigene序列比对到NCBI上的蛋白质数据库Nr、Nt、Swiss-Prot、KEGG及COG和GO(E＜1×10^－5)，得到与给定unigene具有最高序列相似性的蛋白质，从而得到该unigene的蛋白质功能注释信息。其中匹配到Nr数据库中的有25 212条，占全部unigene的62.55%。注释结果显示共有27 925(69.28%)的unigene是有注释的(表 3)。

Unigene注释到Nr数据库中的E值分布图显示，比对到的物种序列值均小于1×10^－5；其中E值小于1×10^－100的有49.0%[图 1(a)]，说明对比结果的可信度较高。相似度(similarity)分布图显示，序列比对相似度为40%~100%，其中大部分序列相似度为80%~95%；序列相似度大于80%的为77.8%[图 1(b)]，说明独行菜转录组的功能注释结果较好。

注释基因同源序列的物种(species)分布情况见图 1(c)，注释到拟南芥(Arabidopsis thaliala)的序列有25.0%；其次是琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)，有23.9%。这是因为拟南芥、琴叶拟南芥和独行菜都同属十字花科植物，且具有丰富的基因组信息，为本研究中转录组的注释提供了参考序列。

图 1 Unigene在Nr库中的E值分布(a)、相似性分布(b)及物种分布(c) Fig. 1 E-value distribution (a),similarity distribution(b)and species classification(c)for unigene

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GO是一套国际标准化的基因功能描述的分类系统，提供一套动态更新的标准词汇表来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。根据Nr注释信息，使用软件Blast2GO得到unigene的GO注释信息，然后用软件WEGO对所有unigene做GO功能分类统计，从宏观上认识独行菜的基因功能分布特征。对独行菜转录组unigene进行GO分析发现，有18 354条unigene注释到GO数据库，注释比例为45.54%。注释到分子功能的基因数目最多，为15 753个，其次是生物学过程14 307个，细胞组成的最少，只有11 056个。GO分析的这3个ontology又分为51个亚类。例如，在生物过程中，细胞过程和代谢过程所占比例较高，细胞和细胞器部分在细胞组成所占比例较高，连接和催化活性在分子功能中占有较高比例(图 2)。

图 2 Unigene的GO分类结果 Fig. 2 GO classification for Lepidium apetalum Willd

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将独行菜转录组所得的unigene与KOG数据库进行比对，对其做了功能分类和统计，得到注释到KOG中的9 071条unigene分布于26个基因家族(图 3)，如RNA加工与修饰、染色体结构和动力学、能量产生与运输、细胞周期控制、细胞分裂及染色体分裂等。在26类基因家族中，注释最多的是一般功能预测(R)，其次是翻译后修饰、周转、分子伴侣(O)。分析发现，有374条unigene注释到次生代谢物的合成、运输及代谢，为后续研究独行菜种子中药用化学成分相关的基因奠定了良好基础。

图 3 Unigenes的KOG分类 Fig. 3 Classification of KOG for unigene A:RNA processing and modification; B:Chromatin structure and dynamics; C:Energy production and conversion; D:Cell cycle control,cell division,chromosome partitioning; E:Amino acid transport and metabolism; F:Nucleotide transport and metabolism; G:Carbohydrate transport and metabolism; H:Coenzyme transport and metabolism; I:Lipid transport and metabolism; J:Translation,ribosomal structure and biogcncsis; K:Transcription; L:Replication,recombination and repair; M:Cell wall/membrane/envelope biogencsis; N:Cell motility; O:Postranslational modification protein tumover,chaperones; P:Inorganic ion transport and metabolism; Q:Secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolism; R:General function prediction only; S:Function unknown; T:Signal transduction mechanisms; U:Intracellular trafficking,secretion,and vesicular transport; V:Defense mechanisms; W:Extracellular structures; Y:Nuclear structure; Z:Cytoskeleton

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KEGG是分析基因产物在细胞中的代谢途径及这些基因产物的功能的数据库，利用它可以进一步研究基因在生物学上的复杂行为。对独行菜的转录组进行KEGG注释发现，在其种子萌发初期有7 844条编码基因参与了263条已知的通路。根据KEGG的注释信息能进一步得到unigene的pathway注释。

根据KEGG注释结果，发现与次生代谢相关的unigene共534条，可将次生代谢合成途径按代谢物分为20类。这20类次生代谢物包括油菜素内酯(brassinosteroid)，咖啡因(caffeine metabolism)，类胡萝卜素(carotenoid)、二萜(diterpenoid)，黄酮和黄酮醇(flavone and flavonol)，类黄酮(flavonoid)，芥子苷(glucosinolate)，吲哚生物碱(indole alkaloid)，异喹啉生物碱(isoquinoline alkaloid)，柠檬烯和松萜(limonene and pinene degradation)，类单萜(monoterpenoid)，苯丙素(phenylpropanoid)，芪类化合物、二芳基庚烷和姜醇(stilbenoid，diarylheptanoid and gingerol)，类萜骨架(terpenoid backbone)，萜类生物碱、哌啶生物碱和嘧啶生物碱(tropane，piperidine and pyridine alkaloid)，玉米素(zeatin)，二萜(diterpenoid)、类萜骨架(terpenoid backbone)，花青素(anthocyanin)，甜菜红碱(betalain)。然而，注释到芥子苷，黄酮类，芪类化合物、二芳基庚烷和姜醇生物合成途径中的unigene分别有4个、19个、69个；注释到苯丙氨酸(phenylalanine)代谢途径中的unigene有92个。

进一步对上述代谢途径中的基因序列进行同源基因的比对分析后，获得了1条与拟南芥CYP83B1(cytochrome P450，family 83，subfamily B，polypeptide 1)基因高度同源的unigene。Yatusevich等^[21]在拟南芥中发现了CYP83B1基因，是芥子苷合成中的重要结构基因。而芥子苷在独行菜种子中是主要的有效止咳成分。该基因在芥子苷合成过程中主要负责催化色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的吲哚族及芳香族醛肟，对芥子苷的生物合成有重要的作用。

黄酮类化合物是重要的次生代谢产物，是很多植物的重要药用成分。查耳酮合成酶基因(chalcone synthase，CHS)、黄烷酮3-羟化酶基因(flavanone 3-hydroxylase，F3H)、黄酮合成酶基因(flavone synthase，FS)和花色素还原酶基因(anthocyanidin reductase，ANR)为黄酮类化合物生物合成途径中重要酶基因，它们在黄酮类化合物的生成过程中起着关键的催化作用^[22]。分析发现，独行菜种子转录组中均有1条编码的同源基因。

苯丙氨酸代谢途径是植物的重要次生代谢途径之一，独行菜种子中的活性物质芪类和黄酮类可能来自该途径。苯丙氨酸脱氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)、肉桂酸4-羟化酶(cinnamate 4-hydroxylase，C4H)和4-香豆酰:辅酶A连接酶(4-coumarate：CoA ligase，4CL)是该途径关键的3个酶。它们作用的产物反式香豆酸-CoA和两个丙二酰-CoA可在芪合酶催化作用下合成芪类次生代谢物；反式香豆素-CoA等也可在查耳酮合成酶的催化作用下进入黄酮类和异黄酮类合成支路，在芪类化合物和黄酮类的合成中具有关键作用^[23]。在独行菜种子中，分别由4个基因编码PAL、3个基因编码4CL和1个基因编码C4H。

研究还获得了103个编码细胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)的unigene。植物细胞色素P450在苯丙素类、生物碱、萜类、黄酮、类黄酮、植物激素、芥子苷等的合成中起着重要作用^{[24, 25, 26]}，参与大多数次生代谢物的氧化过程^[27]。这些注释和分析提供了有价值的资源，有助于研究特定过程、功能和路径，也有助于识别次级代谢物合成相关的新基因。

利用MISA软件对独行菜种子的转录组进行SSR位点多态性分析，搜索了40 304个unigene，总长度为38 487 759 bp，共检测到6 304个SSR位点，出现频率为15.64%，平均跨度为6 105bp。这些SSR位点分布在5 306个unigene中，其中834个unigene含有1个以上的SSR位点。在所有碱基重复类型中，单碱基重复单元的SSR含量最多，约占总数的48.84%。在发现的329种重复基元(motif)中，A/T、AG/CT、AAG/CTT、AAAG/CTTT、AAAAG/CTTTT和AAACAC/GTGTTT分别在单、二、三、四、五和六碱基中出现频率最多，它们在各自重复基元类型中的比例分别为99.20%、64.80%、45.40%、28.00%、40.00%和33.33%(表 4)。

独行菜转录组中所发现的6 304个SSR长度存在极显著变异，10～126个碱基，平均长度为13.57个碱基。如图 4所示，独行菜转录组SSR重复序列长度位于10~15bp的短重复序列最多，占SSR总数的78.83％。进一步利用SPSS软件Person分布进行相关性分析，结果显示SSR位点出现的频率和其长度呈显著负相关(P<0.05)，相关系数为－0.378。

图 4 独行菜转录中SSR序列的长度分布 Fig. 4 Length distribution of microsatellites in Lepidium apetalum Willd transcriptome

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独行菜转录组中SSR的重复次数与其数量的关系见图 5。可以看出，随着重复次数的增加，SSR数量呈明显下降趋势。其中，10次核苷酸重复的最多，为1 757个，占SSR总位点的27.87%。当单碱基的重复次数为16次，二碱基和其他碱基重复次数为12次时，SSR的下降速率降低，最终进入平台期。

图 5 独行菜转录组中SSR数量随重复次数的变化 Fig. 5 Changes with the number of Lepidium apetalum Willd transcriptome of SSR with repeat Others denote the total number of Tri-，Tetra-，Penta-，and Hex-nucleotides repeats

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新一代高通量测序技术的广泛应用，为非模式生物基因信息发掘提供了前所未有的机遇，已经用于中草药植物虎杖^[28]、西洋参^[29]和连翘等转录组的研究。该类研究有助于开发天然药物，选育具优良农艺性状的品种。为了加快药用植物独行菜分子生物学研究，促进独行菜主要天然药物成分的开发和利用，本研究利用RNA-Seq技术分析了独行菜的转录组，探讨了中药植物独行菜种子的功能基因组，基于短读序和组装的unigene进行数据挖掘，共获得40 303条质量较高的基因序列，对有效成分合成的相关基因进行了深度挖掘，并分析得到了6 304个SSR分子标记。

通过代谢通路分析显示，有534条unigenes与次生代谢物生物合成有关，它们编码的次生代谢产物包括：具有抗氧化、清除自由基、抗肿瘤等广泛的药理活性的黄酮^{[30, 31]}；具有抗病、抗氧化、抗肿瘤、抗炎症等多种生物活性的芪类次生代谢物^[32]；具有抗肿瘤、抗HIV、抗氧化、抗炎、抗微生物、抗凝血、抗疲劳等多种生物活性的苯丙素^{[33, 34]}；在独行菜中作为有效止咳成分的芥子苷；许多中草药和药用植物有效成分的多类植物生物碱^[35]。这些次生代谢产物在独行菜种子都得到了分离，且与其药理活性相一致。分析发现独行菜中一些基因还参与咖啡因、异喹啉生物碱、花青素、甜菜红碱等药用有效成分的合成和代谢。这些基因可以作为独行菜次生代谢基因工程的靶标基因，为独行菜种子药用成分的开发和应用领域的拓展奠定了基础。

药用植物主要有效成分是次生代谢产物，然而次生物质代谢途径极其复杂，受到众多基因的调控。目前，药用植物次生代谢工程面临的最大困难是缺乏对次生代谢调控网络的了解，克隆的基因较少，而基因功能清楚的更少。本研究通过生物信息学的方法，对独行菜种子中参与重要次生代谢途径的关键基因进行了挖掘。获得了芥子油苷的结构基因CYP83B1；黄酮类生物合成途径中重要酶的编码基因CHS、F3H、FS和ANR，苯丙氨酸途径中关键酶的编码基因PAL、C4H和4CL。上述基因中，4个基因编码PAL、3个基因编码4CL，其余均只有1个编码基因。这些基因的注释，为今后相关功能基因的克隆和研究提供了依据。

SSR标记按来源，分为基因组SSR(genomic SSR，gSSR)和转录组来源的SSR(expressed SSR，EST-SSR)两种^[36]。真核生物基因组中，转录组中SSR发生频率比基因组中SSR低。相比基因组SSR，转录组SSR多态性可能与基因功能直接相关，具有更高的通用性，能够为功能基因组学研究的应用提供重要价值^[7]。本研究在独行菜转录组中共搜索到6 304个SSR序列，出现频率为15.64%，平均每6.11kb出现一个SSR序列，分布在5 306个unigene中，其中834个unigene含有1个以上的SSR位点。与其他药用植物比较，独行菜转录组中SSR序列出现的频率低于半夏^[36](16.24%)，高于党参^[37](12.22%)和西洋参^[38](7%)，这表明独行菜转录组中SSR数量也很丰富。并且发现独行菜转录组中SSR序列以单碱基重复为主，这与连翘转录组中SSR序列中的优势重复类型是一致的。本研究明确了独行菜转录组中SSR序列的基本特征，为进一步开发新的独行菜功能基因SSR标记奠定了基础。同时对独行菜功能基因资源的开发利用、遗传资源评价、丰富其分子标记和比较基因组学研究都具有重要的价值。

致谢 感谢“新疆师范大学研究生创新科技基金(XSY201502010)为本研究提供的基金资助