中国生物工程杂志  2016, Vol. 36 Issue (1): 23-28

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倪璇, 姜雪, 李雅乾, 陈捷
NI Xuan, JIANG Xue, LI Ya-qian, CHEN Jie
玉米弯孢叶斑病菌ATMT突变株构建及致病力分析
Construction and Pathogenicity Analysis of ATMT Mutant of Curvularia lunata
中国生物工程杂志, 2016, 36(1): 23-28
China Biotechnology, 2016, 36(1): 23-28
http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20160104

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收稿日期: 2015-08-26
修回日期: 2015-09-02
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倪璇, 姜雪, 李雅乾, 陈捷. 玉米弯孢叶斑病菌ATMT突变株构建及致病力分析[J]. 中国生物工程杂志, 2016, 36(1): 23-28.
NI Xuan, JIANG Xue, LI Ya-qian, CHEN Jie. Construction and Pathogenicity Analysis of ATMT Mutant of Curvularia lunata[J]. China Biotechnology, 2016, 36(1): 23-28.
玉米弯孢叶斑病菌ATMT突变株构建及致病力分析
倪璇, 姜雪, 李雅乾, 陈捷     
上海交通大学农业与生物学院 农业部都市农业南方重点实验室 微生物代谢国家重点实验室 上海 200240
收稿日期: 2015-08-26; 修订日期: 2015-09-02;
基金项目: 国家玉米产业技术体系(CARS-02),国家自然科学基金(31171798,31471734)资助项目.
通讯作者, 电子信箱: jiechen59@sjtu.edu.cn
摘要: 利用农杆菌介导的基因转化(Agrobacterium-mediated transformation,ATMT)技术,转化玉米弯孢叶斑病菌 (Curvularia lunata),共获得转化子1 454个。对其中菌落形态、生长速率等性状有显著变化的8个突变株进行分析。通过离体叶片接种进行筛选,发现4个突变株致病性降低,2个突变株致病性增强。通过测定生长速率、产孢量及细胞壁降解酶活性发现,其中致病性减弱的突变株,其产孢量均有所下降甚至不产孢,突变株的PG酶活性普遍增强,但Cx酶活性没有明显变化,而2株强致病性突变株的Cx酶活性明显增强。
关键词: 玉米弯孢叶斑病菌     ATMT转化     致病力    
Construction and Pathogenicity Analysis of ATMT Mutant of Curvularia lunata
NI Xuan, JIANG Xue, LI Ya-qian, CHEN Jie     
School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Key Laboratory of South Urban Agriculture, Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Microbial Metabolism, Shanghai 200240, China
Abstract: Agrobacterium-mediated transformation were used to construct the transformants of the Curvularia lunata and 1454 transformants were obtained. Then screened eight mutants in which colonial morphology, mycelial growth and the expression of disease related genes changed more distinct. Inoculating the mutants into the detached leaves has been used to screen mutant strains and found that 4 mutant strains whose pathogenicity reduced, and 2 mutant strains whose pathogenicity enhanced. Determining the growth rate, sporulation quantity and the activity of cell wall degradation enzymes showed that the sporulation quantity of the mutants whose pathogenicity reduced were all decreasd and one of the strains did not even produce a spore. The activity of the PG enzyme enhanced generally, but the changes of the Cx enzyme did not have differences apparently. However, the activity of the Cx enzyme of the two mutants whose pathogenicity enhanced was increased.
Key words: Curvularia lunata     ATMT     Pathogenicity    

由新月弯孢(Curvularia lunata)引起的玉米弯孢叶斑病是玉米叶部发生的一种真菌性病害，其分布广泛，属于世界范围的病害[1]。该病害一旦发生会迅速蔓延，病斑较密集，发病严重的地块，植株及叶片发病率可达100%。因此，玉米弯孢叶斑病是继玉米大斑病、玉米小斑病和玉米圆斑病之后，我国的又一个严重的灾害性病害[2, 3]。

目前对玉米弯孢叶斑病菌的致病机制方面，其研究工作主要集中在生理生化水平。例如，王晓飞等[3]推断黑色素可能作为一种毒力因子在玉米弯孢叶斑病菌致病过程中起作用、Liu等研究了弯孢叶斑病菌ATMT突变株构建方法的改进，首次获得了玉米弯孢病菌产生毒素的相关基因Clt1和合成黑色素的1,3,8-三羟基萘还原酶基因Brn1[4, 5, 6]。但至今所获得的致病相关基因种类比较少，制约了对该病原菌致病机制的全面剖析。目前利用农杆菌介导的真菌遗传转化(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation，ATMT)技术已在20多种植物病原真菌的突变体构建和相关致病基因的克隆中发挥重要作用，如灰葡萄孢(Botrytis cinerea)[7]、稻梨孢菌(Magnaporthe oryzae)[8]、稻绿核菌(Ustilaginoidea virens)[9]、禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)[10]等。本研究通过ATMT方法，构建玉米弯孢叶斑病菌突变株体系，重点筛选致病性差异变化较大的突变株，研究其生物学特性和致病相关因子活性变化，为进一步研究玉米弯孢叶斑病菌致病相关基因奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料、仪器设备 1.1.1 菌株

供试感病玉米黄早四自交系，由本实验室保存；供试强致病性菌株CX3(野生型)，由本实验室前期工作从田间病株上分离获得；供试农杆菌AgL-1、大肠杆菌菌株DH5α，由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂

潮霉素B、乙酰丁香酮(AS)、MES、特美汀、利福平、卡那霉素购自前尘生物科技有限公司。LB培养基：胰蛋白胨10g/L，细菌培养用酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，pH自然。MM基本培养基：K2HPO4 2.562 5g/L，KH2PO4 1.812 5g/L，NaCl 0.187 5g/L，MgSO4·7H2O 0.625 0g/L，CaCl2 0.062 5g/L，FeSO4·7H2O 0.003 1g/L，(NH4)2SO4 0.625 0g/L，pH 5.2。IM诱导培养基：2.5×MM母液400ml/L，无水葡萄糖0.9g/L，琼脂粉20g/L，甘油5ml/L。CYA培养基：NaNO3 2g/L，KH2PO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，蔗糖30g/L，琼脂15g/L，pH 7.4。细胞壁降解酶测定培养基： L- asparagines 0.5g/L，K2HPO4 1.0g/L，KNO3 2.0g/L，FeSO4 0.01g/L，KCl 0.5g/L，VitaminB1 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CMC或pectin 10.0g/L，pH 5.0。

1.1.3 主要仪器

PCR仪购自Eppendorf公司,摇床(ZHWY-2112B)、培养箱(ZSD-1270)、分光光度计(UV-1800)均为国产。

1.2 方 法 1.2.1 农杆菌介导的转化

参照Liu等[6]的方法进行农杆菌介导遗传转化。

1.2.2 Southern 杂交

参照《分子克隆实验指南》第三版的方法提取基因组并进行Southern杂交。转化子的基因组用XbaⅠ酶切，利用引物Hgy1、Hgy2扩增潮霉素片段(表 1)，潮霉素基因片段(811bp)为探针，进行Southern blotting分析。

表 1 实验中所用引物 Table 1 Primers used in this study
Primer namePrimer sequence (5′-3′)
Hgy1CGACAGCGTCTCCGACCTGA
Hgy2CGCCCAAGCTGCATCATCGAA
Brn1-FGTCAACTACGCCAACGCCG
Brn1-RGTTGTGAGGAGACCATGTG
Clt-1-FATGCCTCCAGCGGGAAGCG
Clt-1-RGGGTTATCGCATAATCTCCTGGTA
表选项
1.2.3 突变株初步筛选及菌落形态观察

将野生型菌株和转化子分别接种到PDA 培养基上，28℃黑暗培养7天，观察菌落形态，从中筛选出与野生型相比，在菌落形态、产孢量、颜色及生长速率上有明显变化的转化子。

1.2.4 突变株产孢量测定

将供试菌株接种在PDA培养基上，28℃黑暗培养10天 ，用打孔器(9mm)打取菌片，将3个菌片置于10ml无菌水中，充分搅拌后洗下孢子，吸取孢子悬浮液用血球计数板在显微镜下计数。计算突变株的产孢量。

1.2.5 细胞壁降解酶活性测定

取PDA 平板上培养7天的菌片，在液体培养基中，25℃培养7天，每天以120r/min振荡1h。过滤去除菌丝，4℃ 12 000r/min离心20min，取上清液作为待测酶液。利用DNS法在分光光度计540nm处测定反应混合物的吸光值，根据酶反应所释放的还原糖计算纤维素酶(cellulase,Cx)和多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturnase,PG)活性。1个酶活力单位为50℃下每小时催化底物生成1μmol葡萄糖或半乳糖醛酸所需酶量。

1.2.6 致病力测定

选取感病自交系黄早四7叶期第三位叶片，用70%乙醇进行表面消毒，再用无菌水冲洗3次，吸干表面水分。将叶片放入保湿培养皿中，在叶片表面进行刺伤后，接种菌饼，黑暗条件下放置24h后，置于25℃光照培养箱中培养72h，以接种无菌PDA片为阴性对照，接种野生型菌株CX3为阳性对照。实验重复处理3次。

1.2.7 致病相关基因表达分析

参照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，并合成第一链cDNA，运用半定量测定Brn1和Clt1基因在不同突变株内的表达量。扩增引物见表 1。

2 结果与分析 2.1 转化感受态农杆菌

本研究以1×106个/ml的分生孢子浓度进行遗传转化，潮霉素为抗性筛选标记，利用AgL-1农杆菌菌株，转化5~7天后可以形成转化子，获得玉米弯孢叶斑病菌转化子1 454个。

2.2 玉米弯孢叶斑病菌T-DNA插入位点验证

Southern杂交结果显示，从ATMT突变体库中随机选取的转化子中，大多数为T-DNA单拷贝插入，并且杂交条带所处的位置各不相同，由此说明，T-DNA的插入位点没有明显的偏好(图 1)。

图 1 转化子Southern杂交验证T-DNA插入位点及拷贝数 Fig. 1 Southern blotting of randomly selected transformants of C. lunata CX3 for the T-DNA insertion 1~8: Randomly selected hygromycin B-resistant transformants
图选项
2.3 突变株菌落形态观察

通过筛选共获得8株在菌落颜色、形态、产孢量及生长速度方面有明显变化的ATMT菌株(CLM-2、CLM-8、CLM-393、CLM-801、CLM-806、CLM-899、CLM-950、CLM-1648)。

对筛选出的突变株进行形态发育观察，其中CLM-2菌落气生菌丝少，质地紧密，颜色较深；突变株CLM-393、CLM-801、CLM-809、CLM-950、CLM-1648菌落均白化，且气生菌丝旺盛。突变株CLM-8、CLM-899菌落为圆形，边缘呈白色，菌丝为褐色(图 2)。

图 2 玉米弯孢叶斑病菌T-DNA插入突变体菌落形态 Fig. 2 Colonial morphology of screened ATMT mutants
图选项
2.4 突变株产孢量的测定

产孢量测定结果显示(表 2)，与野生型相比，突变株CLM-393完全丧失产生分生孢子的能力，突变株CLM-2、CLM-950产孢能力明显下降，突变株CLM-8、CLM-801、CLM-806、CLM-899、CLM-1648的产孢量略有降低。

表 2 突变株产孢量 Table 2 The number of conidiophores of the mutants
菌株编号产孢量(106个/ml)菌株编号产孢量(106个/ml)
CX33.45CLM-20.16
CLM-81.72CLM-3930.00
CLM-8011.68CLM-8062.46
CLM-8993.00CLM-9500.50
CLM-16482.46
表选项
2.5 细胞壁降解酶活性变化

细胞壁降解酶活性测定结果显示(表 3)，菌株间PG酶活性差异较明显，7株突变株PG的活性比野生型菌株的高。虽然Cx酶活性差异不明显，但CLM-801和CLM-1648菌株Cx酶活性明显比野生型高。

表 3 突变体细胞壁降解酶活性 Table 3 Cell-wall-degration enzyme activities comparison of screened ATMT mutants and wild type strain CX3
菌落编号Cx酶活性PG酶活性
CX32.867 1 ± 0.231 2 C c66.590 2 ± 4.268 1 CD d
CLM-20.948 7 ± 0.307 9 E f51.187 9 ± 6.108 6 D e
CLM-82.180 3 ± 0.502 2 CD de101.88 9 ± 8.365 3 B bc
CLM-3931.912 9 ± 0.226 6 D e76.999 37 ± 9.970 1 C d
CLM-8014.201 1 ± 0.183 3 A b121.055 5 ± 8.439 6 A a
CLM-8062.934 8 ± 0.341 0 B c 113.796 1 ± 10.947 0 AB ab
CLM-8992.606 3 ± 0.206 7 BC cd100.314 2 ± 4.234 3 B c
CLM-9502.883 6 ± 0.057 4 B c102.849 2 ± 1.733 6 B bc
CLM-16484.750 8 ± 0.099 1 A a122.784 0 ± 8.389 1 A a
Note: Capital letters were stand for significant differences at P=0.01 level，small letters were stand for significant differences at P=0.05 level
表选项
2.6 致病性测定

对玉米弯孢叶斑病菌野生型菌株和8株ATMT突变体进行了致病力测定。结果显示，突变株CLM-2、CLM-393、CLM-899、CLM-950的致病力均有明显减弱，且发病程度降低。突变株CLM-801、CLM-1648的致病性增强(图 3)。

图 3 玉米弯孢叶斑病菌T-DNA插入突变体致病力测定 Fig. 3 Pathogenic measurement of Curvularia lunata mutants
图选项
2.7 PG酶活性与突变株致病性关系

研究表明，与野生型菌株相比，大多数突变株的PG酶活性明显增强，但是PG酶活性与突变株的致病性不存在明显的相关性(图 4)。

图 4 PG酶活性和突变株致病力的关系 Fig. 4 Relationgship between activity of PG enzyme and pathogenicity of the mutants
图选项
2.8 突变株致病相关基因表达分析

Brn1、Clt1的半定量PCR结果显示(图 5)，在各个突变株中，Brn1基因的表达量无较大变化，只有突变株CLM-393中该基因的表达量明显降低，该结果与CLM-393菌落白化的现象吻合。Clt1基因在各个突变株中的表达量较不稳定，可能与对应引物的扩增效率相关。但突变株CLM-8中，该基因的表达量高于其他菌株。

图 5 基因Brn1、Clt1在出发菌CX3及其ATMT突变体中的表达量 Fig. 5 RT-PCR analysis of expression of the melanin biosynthesis genes Brn1 and Clt1 pathogenicity-related gene 1: CX3; 2: CLM-2; 3: CLM-8; 4: CLM-393; 5: CLM-801; 6: CLM-806; 7: CLM-899; 8:CLM-950; 9:CLM-1648; M: DNA ladder DL2000
图选项
3 讨 论

本研究利用ATMT方法共获得1454个转化子，其中筛选出8株在菌落颜色、形态、生长速率及产孢量方面有明显变化的菌株进行深入研究。研究发现，由于弯孢叶斑病菌基因组中T-DNA为随机插入，因此，病菌的培养性状和致病相关性状均发生了明显的变化。在产孢能力方面，突变株有不同程度的下降，甚至完全丧失产孢能力，说明插入位点可能有与产孢相关的基因，从而为克隆控制产孢形成相关基因提供了重要突变株材料。与野生型菌株相比，突变株的细胞壁降解酶活性有较为显著的变化，强致病性突变株CLM-801、CLM-1648的纤维素酶活性显著增强，弱致病菌株中突变株CLM-2和CLM-393的纤维素酶活性明显降低，而大多数ATMT突变株产生的PG活性明显高于野生株，但与致病力相关性并不明显。相比之下，纤维素酶更能反映病菌的致病力变化，说明纤维素酶可能在弯孢叶斑病菌致病性中发挥重要作用，对强致病性菌株的诱导效应更为敏感，特异性更强，这与Lalaoui等[11]的研究结果相似，因此需要进一步克隆该基因，分析其与病原菌致病性的相关性。同时，研究发现，在离体培养条件下，突变株菌落黑色素的产生程度与其致病性强弱并不完全相关。例如，突变株CLM-899、CLM-8、CLM-2菌落的黑色素产生较多，但其致病性并没有比白色菌落的突变株高；分析其原因可能是菌株的致病性受多种致病因子调控，其合成代谢途径中有较多其他中间产物[12, 13, 14]。综合以往研究结果，尽管黑色素、毒素、纤维素酶等因子与病菌致病性可能有关，但尚不明确这些基因是如何协同调控的，需要进一步利用定点突变、基因互作等方法明确上述致病相关基因的互作关系和调控网络。

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