结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，其发病率和死亡率分别位居全世界第三位和第四位，在我国也均呈逐年上升趋势，形势十分严峻^[1] 。当前，早期结直肠癌患者的治疗以外科手术切除为主，中晚期辅以放疗和化疗的综合治疗为主，但晚期患者5年生存率还是比较低。进一步研究结直肠癌发生发展的分子机制，可为发现更有效的结直肠癌诊治方法提供思路。

S100A6(calcyclin，钙周期蛋白)是S100家族的成员之一，分子质量约为10kDa，是一类具有EF手型结构的小分子钙结合蛋白，与Ca²⁺或靶蛋白结合后参与细胞增殖分化、蛋白磷酸化和转录因子的调节等。大量文献报道S100A6在肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌等肿瘤组织中呈现高表达^{[2, 3, 4, 5, 6]} ，并与肿瘤转移、不良预后等具有一定的相关性^{[5, 6, 7]} 。

S100A6不仅可表达于成纤维细胞及上皮细胞内^[8] ，同时也可分泌到细胞外^[9] 。有文献表明，细胞外的S100A6可通过与膜上的受体晚期糖基化终末产物(advanced glycation end product，RAGE)结合发挥作用^{[10, 11]} 。前期研究发现，外源性的重组人S100A6蛋白作用肿瘤细胞后，细胞内的S100A6蛋白水平有所增加。提示肿瘤微环境中的S100A6可能增加肿瘤细胞内的S100A6。但是，其机制是否涉及S100A6基因的转录水平的改变尚不清楚。已有研究表明，S100A6高表达常与 β-catenin的升高同时存在于肿瘤中^{[12, 13]} ，且受β-catenin的调控^[14] 。结合我们的新近研究发现，S100A6可以促进多种肿瘤细胞中的β-catenin表达^{[15, 16, 17, 18]} ，提示肿瘤微环境和肿瘤细胞可能存在S100A6与β-catenin之间的正反馈环路。

因此，本研究以结直肠癌细胞HCT116及SW480为研究对象，初步探讨外源性rhS100A6蛋白对细胞内自身S100A6基因转录的影响及其相关机制是否涉及β-catenin通路的激活。

人结直肠癌细胞系HCT116、SW480及正常肠上皮细胞FHC购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC)。

重组质粒pGST-HRV3C、 pGST-ClvHRV3C-hS100A6和感受态细菌E．coli BL21为本实验室保存；pGST - moluc质粒、重组腺病毒Adsiβ-catenin(含编码β-catenin的siRNA基因序列和红色荧光蛋白基因序列)和对照腺病毒AdRFP(只含有红色荧光蛋白基因序列)为美国芝加哥大学医学中心分子肿瘤学实验室何通川教授馈赠。

DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司)；TRIzol 试剂( Invitrogen公司)；反转录试剂盒(TaKaRa公司)；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；蛋白质提取相关试剂(上海碧云天生物技术研究所)；核蛋白提取试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)；兔抗人S100A6单克隆抗体(ab181975，Abcam公司)、鼠抗人β-catenin单克隆抗体(sc-7963，Santa Cruz公司)；兔抗人Histone H3.1抗体(P30266，上海Abmart生物医药有限公司) ；山羊抗兔IgG/HRP标记(Abgent公司)；山羊抗鼠IgG/HRP标记(中杉金桥生物技术有限公司)；DyLight488标记的山羊抗鼠IgG(E032210，Earthox公司)；实时荧光定量PCR检测试剂盒(Kapa公司)。

rhS100A6的制备方法参考文献^[19] 。分别将重组质粒pGSTClvHRV3C-hS100A6与pGST-HRV3C化转至感受态细菌E.coli BL21中，在LB培养基中培养扩菌，随后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-D-thiogalactoside，IPTG)诱导蛋白质的表达，包括两种融合蛋白，即谷胱甘肽S转移酶-人鼻病毒3C蛋白酶酶切序列-hS100A6(glutathione S transferase-human rhinovirus 3C protease cleavage site-hS100A6，GST-ClvHRV3C-hS100A6)和重组蛋白谷胱甘肽S转移酶-人鼻病毒3C蛋白酶( glutathione S transferase-human rhinovirus 3C protease，GST-HRV3C) 。冰上超声破菌后，用谷胱甘肽－琼脂糖4B球珠( glutathionesepharose4B，GS4B)分别纯化上述两种融合蛋白，随后用制备的GST-HRV3C 酶切GST-ClvHRV3C-hS100A6(4℃)，再经GS4B纯化，以去除其中的GST-HRV3C和切下的GST，即可获得rhS100A6蛋白。经SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色和Western blot鉴定，并于－80℃保存备用。

人结直肠癌细胞系HCT116和SW480培养于含10%胎牛血清、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO₂的培养箱中。待细胞融合度达到70%~80%时，分别加入腺病毒载体AdRFP、Adsiβ-catenin，36h后观察荧光强度，病毒感染效率需达到70%以上，此时加入rhS100A6蛋白(终浓度为10μg/ml)处理12h，并设空白对照组(Blank组)、AdRFP组、Adsiβ-catenin组、rhS100A6组及Adsiβ-catenin+rhS100A 5组。

分组干预相应时间后，收集细胞，TRIzol 法提取总RNA，取600ng总RNA用反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR反应，检测HCT116、SW480细胞中内参基因GAPDH和目的基因S100A6、β-catenin、E-cadherin的转录水平。内参GAPDH上游引物序列为5′-CAGCGACACCCACTCCTC-3′，下游引物序列为5′-TGAGGTCCACCACCCTGT-3′，扩增片段大小为109bp；S100A6上游引物序列为5′-ATGGCATGCCCCTGGATCAGG-3′，下游引物序列为5′-TCAGCCCTTGAGGGCTTCAT-3′，扩增片段大小为272bp；β-catenin上游引物序列为5′-CTGCAGGGGTCCTCTGTG-3′，下游引物序列为5′-TGCATATGTCGCCACACC-3′，扩增片段大小为125bp；E-cadherin上游引物序列为5′-CTGAGAACGAGGCTAACG-3′，下游引物序列为5′-GTCCACCATCATCATTCAATAT-3′，扩增片段大小为111bp。PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，62～54℃退火30s，9个循环(每个循环依次降低1℃)，72℃延伸30s；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，22～25个循环；最后72℃延伸10min。产物经琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像采集系统采集图像，采用Quantity One软件分析目的条带的灰度值，计算目的基因与内参的比值。

分组干预相应时间后，收集细胞，TRIzol 法提取总RNA，取600ng总RNA用反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行qPCR反应，检测HCT116、SW480细胞中内参基因GAPDH和目的基因S100A6的转录水平。qPCR反应条件按试剂盒说明书进行操作，并对定量结果进行分析。

取处于对数生长期细胞，待细胞融合度达到80%左右时更换为无胎牛血清DMEM培养基，进行实验干预，于37℃、5% CO₂ 培养箱中培养，此时记为0h。干预相应时间点后收集细胞，按照核蛋白提取试剂盒说明书提取细胞核蛋白，分光光度仪测定其浓度。蛋白质煮沸5min变性，经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后，湿转法转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜，5% BSA封闭2h，一抗分别为鼠抗人β-catenin(1∶1 000稀释)、兔抗人S100A6(1∶3 000稀释)及兔抗人Histone H3.1(1∶3 000稀释)单克隆抗体，4℃孵育过夜，TBST洗膜后加二抗(1∶5 000稀释)37℃孵育1h，按照ECL试剂盒说明对其显色，通过凝胶成像仪采集图像，并采用Quantity One软件分析所获得的各条带的灰度值，计算目的蛋白与内参的比值。

取对数生长期的HCT116及SW480细胞，制备细胞爬片。待细胞融合度达到80%左右时更换为无胎牛血清DMEM培养基，进行实验干预，于37℃、5% CO₂ 培养箱中培养，此时记为0h。干预4h后，取出细胞爬片，用预冷的PBS漂洗2次，用4%多聚甲醛溶液固定15min；PBS再次漂洗3次后，用0.25% Triton溶液37℃处理15min，继续用PBS漂洗3次，随后用山羊血清37℃封闭30min，加入β-catenin(1∶300)，4℃过夜；PBS漂洗3次，加入DyLight488标记的山羊抗鼠IgG(稀释比例为1∶200)，37℃避光反应1h；PBS漂洗3次，然后加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)，室温避光反应5min，对细胞核进行染色；PBS漂洗3次后，荧光显微镜下(×400)观察β-catenin核移位的情况。

采用SPSS17.0统计软件对各组实验结果进行统计学分析。各实验均独立重复3次，实验数据以均数±标准差(± s) 表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验。以P﹤0.05为差异有统计学意义。

所需蛋白质rhS100A6的制备方法如“ 1.2.1 ”所述。获得的蛋白质经过SDS-PAGE显示制备的rhS100A6分子质量约为10kDa，符合预期[图 1(a)]。Western blot结果显示，S100A6单克隆抗体能够识别所制备的rhS100A6蛋白，提示rhS100A6蛋白制备成功[图 1(b)] 。

图 1 rhSl00A6的制备和鉴定 Fig. 1 Identification of recombinant protein rhS100A6 (a)SDS-PAGE (b)Western blot

图选项

10μg/ml的 rhS100A6处理HCT116细胞0h、3h、6h、12h后，RT-PCR结果显示各组S100A6 mRNA校正灰度值依次分别为0.54±0.01、0.62±0.42、0.66±0.01和0.72±0.01，其中3h、6h和12h处理组较对照组(0h组)分别增加了14.8%、22.2%和33.3%，差异均具有统计学意义(F=30.903，P﹤0.01)[图 2(a)]。

10μg/ml的 rhS100A6处理SW480细胞0h、3h、6h、12h后，RT-PCR结果与HCT116细胞系相似，其S100A6 mRNA的校正灰度值分别为0.35±0.61、0.54±0.08、0.54±0.06和0.53±0.03；其中，3h、6h和12h处理组较对照组(0h组)分别增加了54.3%、54.3%和51.4%，差异均具有统计学意义(F=6.831，P﹤0.01)[图 2(b)]。

但是，10μg/ml的 rhS100A6处理正常肠上皮细胞FHC细胞0h、3h、6h、12h后，RT-PCR结果显示各组S100A6 mRNA校正灰度值依次分别为1.04±0.08、1.05±0.11、1.06±0.06和1.02±0.08，差异无统计学意义(P﹥0.05)[图 2(c)]。

以上结果提示，rhS100A6可以增强人结直肠癌细胞系HCT116和SW480细胞中S100A6基因的转录，但对正常肠上皮细胞无明显影响。

图 2 RT-PCR法检测rhS100A6 对HCT116、SW480和FHC细胞中S100A6 mRNA 水平的影响 Fig. 2 Effect of rhS100A6 (10μg/ml) on S100A6 mRNA level in HCT116,SW480 and FHC cells by RT-PCR (a)HCT116 (b)SW480 (c)FHC ** P﹤0.01 compared with 0h group

图选项

10μg/ml的rhS100A6处理HCT116细胞0h、0.5h、1h、2h、4h后，Western blot结果显示，各组细胞核中β-catenin的校正灰度值依次为0.69±0.09、0.78±0.06、0.92±0.05、1.32±0.11和1.36±0.15；其中1h、2h和4h组的细胞核β-catenin蛋白水平明显高于对照组(0h组)，差异均具有统计学意义(F=30.287，P﹤0.05，)[图 3(a)]。

10μg/ml的rhS100A6处理SW480细胞0h、0.5h、1h、2h、4h后，Western blot结果显示，各组细胞核中β-catenin的校正灰度值依次为0.63±0.04、0.79±0.05、1.03±0.06、1.27±0.05和1.45±0.06；其中1h、2h和4h组的细胞核β-catenin蛋白水平较明显高于对照组(0h组)，差异均具有统计学意义(F=123.17，P﹤0.01，)[图 3(b)]。

以上结果提示，rhS100A6可上调人结直肠癌细胞系HCT116和SW480细胞核内β-catenin蛋白水平。

图 3 rhS100A6 对HCT116和SW480细胞核中β-catenin蛋白水平的影响 Fig. 3 Effect of rhS100A6 (10μg/ml) on the protein level of nuclear β-catenin in HCT116 cells and SW480 cells (a)HCT116 (b)SW480 * P﹤0.05 ,** P﹤0.01 compared with 0h group

图选项

10μg/ml的rhS100A6分别处理HCT116细胞和SW480细胞4h后，以0h为空白对照，细胞免疫荧光法检测，结果显示，HCT116细胞和SW480细胞的4h处理组均发生β-catenin的核转位(图 4)

图 4 细胞免疫荧光法检测rhS100A6对分布变化的影响(×400) Fig. 4 Effect of rhS100A6 (10μg/ml) on the distribution of β-catenin in HCT116 and SW480 cells by immunofluorescence staining(×400)

图选项

10μg/ml的rhS100A6处理HCT116细胞0h、0.5h、1h、2h、4h后，RT-PCR结果显示各组E-cadherin mRNA校正灰度值依次分别为1.45±0.14、1.28±0.10、0.87±0.05、0.55±0.11和0.44±0.08，其中1h、2h和4h处理组的E-cadherin mRNA水平明显低于对照组(0h组)，差异均具有统计学意义(F=51.722，P﹤0.01)[图 5(a)]。

10μg/ml的rhS100A6处理SW480细胞0h、0.5h、1h、2h、4h后，RT-PCR结果与HCT116细胞系相似，其E-cadherin mRNA的校正灰度值分别为1.45±0.24、1.05±0.25、0.85±0.25、0.65±0.09和0.39±0.08，其中0.5h、1h、2h和4h处理组的E-cadherin mRNA水平明显低于对照组(0h组)，差异均具有统计学意义(F=12.233，P﹤0.01)[图 5(b)]。

以上结果提示rhS100A6可以下调人结直肠癌细胞系HCT116和SW480细胞内的E-cadherin mRNA水平。

图 5 RT-PCR法检测rhS100A6 对HCT116、SW480细胞中E-cadherin mRNA 水平的影响 Fig. 5 Effect of rhS100A6 (10μg/ml) on E-cadherin mRNA level in HCT116 and SW480 cells by RT-PCR (a)HCT116 (b)SW480 * P﹤0.05 ,** P﹤0.01 compared with 0h group

图选项

空载腺病毒AdRFP及重组腺病毒Adsiβ-catenin在HCT116和SW480细胞中感染36h，RT-PCR [图 6(a)] 及Western blot [图 6(b)] 结果证实感染Adsiβ-catenin后致其β-catenin水平降低，说明干扰有效。

RT-PCR结果显示，Adsiβ-catenin处理后，HCT116细胞的S100A6 mRNA水平低于AdRFP对照组，差异具有统计学意义(F=20.276，P=0.041)[图 5(c)]；Adsiβ-catenin与rhS100A6共同处理组的S100A6 mRNA水平明显低于单独rhS100A6处理组(F=20.276，P=0.001)[图 6(c)]，差异具有统计学意义。

HCT116和SW480细胞的qPCR结果与其RT-PCR结果一致，差异均具有统计学意义(P﹤0.01)[图 6(e)]。

以上结果进一步证实rhS100A6能够上调HCT116和SW480细胞中S100A6 mRNA水平，且其机制涉及Wnt/β-catenin通路的激活。

图 6 Adsiβ-catenin 对rhS00A6增加HCT116细胞和SW480细胞中S100A6基因转录作用的影响 Fig. 6 The effect of Adsiβ-catenin on rhS100A6-increased S100A6 mRNA level in HCT116 and SW480 cells (a) The β-catenin mRNA level was identified after treated with Adsiβ-catenin (b) The β-catenin protein level was identified after treated with Adsiβ-catenin (c),(d) The effect of Adsiβ-catenin on S100A6 mRNA level in HCT116 cells (d) and SW480 cells (e) by RT-PCR (** P﹤0.01) (e) The effect of Adsiβ-catenin on S100A6 mRNA level in HCT116 and SW480 cells by qPCR

图选项

S100A6是由Filipek和Kuznicki 首次在Ehrlich腹水瘤中发现的^[20] ，属于S100钙离子结合蛋白家族，具有EF手型结构，分子质量约为10kDa。我们的前期实验发现，S100A6在结直肠癌组织和结直肠癌细胞系中均呈现高表达，且S100A6能够通过激活MAPK信号通路促进结直肠癌细胞的增殖、迁移^[21] ，这与多数文献认为其能促进肿瘤的发生、发展是一致的。同时，我们也发现，外源性重组GST-hS100A6蛋白作用肿瘤细胞后，细胞中的S100A6蛋白水平有所增加，但其S100A6基因转录水平是否也发生相应改变还不清楚。因此本实验中我们采用外源性重组rhS100A6蛋白处理结直肠癌细胞系HCT116和SW480细胞，结果表明细胞中的S100A6基因转录水平也出现明显上调，说明S100A6在结直肠癌细胞系中能够正向调节自身表达，但其具体机制还不明确。

众所周知，与结直肠癌发生发展密切相关的一条信号通路当属Wnt/ β-catenin信号通路。在正常的细胞中，少量的β-catenin作为细胞骨架蛋白，与细胞膜上的E-cadherin结合以维持细胞的极性及细胞间的连接，另一部分β-catenin与细胞中的支架蛋白Axin、APC、GSK3β、DVL等相互作用，形成降解复合体而被降解，以使胞浆中游离的β-catenin维持在较低的水平。一旦Wnt信号通路被激活，β-catenin的降解就会受到抑制，使胞浆内游离的β-catenin水平增高并进入细胞核，与TCF4结合调控下游靶基因的转录，从而促进肿瘤的发生发展。

已有报道S100A6高表达与β-catenin增多常并存于多种肿瘤细胞中，提示这两者之间可能存在某种联系。我们的前期研究也发现S100A6可以上调多种肿瘤细胞中的β-catenin水平及β-catenin/TCF4的活性，包括人结肠癌细胞系HCT116 ^[22] ；同时，Ewa等^[14] 报道β-catenin能够上调S100A6的表达。基于此，我们假设外源性rhS100A6蛋白能够上调结直肠癌细胞内自身S100A6基因转录水平的机制可能涉及β-catenin通路的激活。本次结果与预期相符，即rhS100A6蛋白处理结直肠癌细胞系HCT116和SW480后致细胞核中β-catenin蛋白增加，提示可能发生β-catenin的核移位，从而调控下游靶基因的转录。经进一步细胞免疫荧光法检测结果证实rhS100A6处理HCT116和SW480后，细胞中β-catenin确实发生了核移位。有文献指出，与E-cadherin结合的β-catenin蛋白可从细胞膜上脱离进入到细胞质，参与Wnt信号通路的活化^[23] ，同时，Felix等^[24] 采用靶向于E-cadherin的小干扰RNA (siRNA)转染结直肠癌细胞系DLD-1 ，并采用TOPflash报告质粒系统检测，结果发现细胞连接之间的β-catenin消失且β-catenin转位至细胞核中并大量积聚，揭示E-cadherin可能通过β-catenin调控Wnt依赖的基因的表达。因此，我们用rhS100A6蛋白分别处理HCT116和SW480细胞后检测了其E-cadherin mRNA水平，发现rhS100A6处理组的E-cadherin mRNA水平明显低于空白对照组。以上结果表明，Wnt/β-catenin通路参与rhS100A6对核蛋白β-catenin的促上调作用。

为了进一步验证rhS100A6能够上调结直肠癌细胞内自身S100A6基因转录水平的机制是否涉及β-catenin通路的激活，我们随之又应用Adsiβ-catenin与rhS100A6共同处理上述两株细胞，发现Adsiβ-catenin处理组的S100A6 mRNA 水平低于AdRFP对照组，这一结果与Ewa等^[14] 的结论相符，进一步印证S100A6的转录受β-catenin的调控。更重要的是，Adsiβ-catenin和rhS100A6共同处理组的S100A6 mRNA 水平显著低于rhS100A6处理组，提示S100A6上调结直肠癌细胞中S100A6基因表达至少部分是通过激活Wnt/β-catenin通路实现的。

综上所述，本研究揭示了胞外微环境中的S100A6可促进结直肠癌细胞中S100A6基因的转录，并且其机制涉及β-catenin信号通路的激活，为进一步阐明结直肠癌细胞中存在的S100A6与β-catenin之间的正反馈现象及结直肠癌的发生发展机制积累了实验依据，也为结直肠癌的治疗研究提供了潜在靶点。