CXCL4又名血小板因子4(PF4)，早在1955年作为一种具有抗肝素活性的血小板蛋白被发现^[1]。它是趋化因子大家族中的首个成员，属于ELR-CXC趋化因子亚家族。人CXCL4(hCXCL4)编码基因位于4号染色体GRO区域中的q13.1位置，与其他大多数CXC趋化因子基因含有4个外显子和3个内含子不同，CXCL4只含有3个外显子和2个内含子，全长大约1 000bp^[2]。全长hCXCL4包括信号肽在内共含有101个氨基酸，成熟的hCXCL4单体是一个含有70个氨基酸的多肽链，分子质量约为7.8kDa，其中包含了可形成2对二硫键的4个半胱氨酸和1个酪氨酸残基，但是不含甲硫氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基^[3]。CXCL4与CXC趋化因子家族的其他成员具有30%~95%的氨基酸同源性，因此在整体结构上有很好的相似性^[4]。然而在四级结构上，趋化因子间却有着更多的差异，CXCL4是由4个单体构成两个不对称的二聚体而组成的四聚体，它们主要通过静电力作用维持相互之间的平衡状态^[5]。

巨核细胞和血小板被认为是CXCL4产生的主要来源，人骨髓巨核细胞合成后，CXCL4被包裹于血小板α颗粒中，当血小板被激活时，CXCL4从血小板α颗粒中释放出来^[6]。正常人血浆中CXCL4含量低至(1.8±1)ng/ml，然而正常人血清中CXCL4含量可高达数千倍(近5μg/ml)，人血小板中CXCL4含量为7~22ng/10⁶个血小板^[7]。此外，其他细胞类型，如平滑肌细胞、小神经胶质细胞、巨噬细胞或T细胞^{[8, 9, 10]}也都可以表达CXCL4，但这些细胞表达CXCL4的量比血小板中的低很多。

在过去几十年中，CXCL4已被报道可广泛作用于不同类型的细胞，包括单核细胞、中性粒细胞、内皮细胞、T细胞^[11]等，产生各种生物学效应。一方面，CXCL4介导一些快速的生物学反应，如直接激活中性粒细胞和单核细胞，参与宿主防御过程^[12]；另一方面，不同于其他趋化因子，CXCL4常参与细胞凋亡，细胞分化、生存和增殖等许多生长调控的生理反应。例如，有研究表明CXCL4能够通过阻断内皮细胞从G₁期到S期的进程，抑制血管内皮细胞增殖，进而抑制血管生成，抑制肿瘤的增殖和转移^[13]。然而，很多生物学活性的发现需要CXCL4的刺激，暗示CXCL4可能是以间接的副作用发挥功能的，因此，需要更多深入的研究来进一步明确或发现其复杂的生物学活性。

本文通过构建来自天然序列的 hCXCL4重组蛋白原核表达载体，在大肠杆菌表达系统中高效表达，建立了简便的纯化工艺，并获得了高纯度具有生物活性的重组hCXCL4蛋白，为制备抗CXCL4单克隆抗体及进一步的功能研究奠定了物质基础。

本实验中所用表达宿主菌株E. coli BL21(DE3)由本实验室保存，目的基因全合成于南京金斯瑞公司，PVDF膜购自Pall公司，ECL购自北京康为世纪生物科技有限公司。破菌缓冲液(1×PBS,5mmol/L DTT,0.1mmol/L PMSF)、镍柱亲和纯化缓冲液A(20mmol/L Tris-HCl,0.5mol/L NaCl,pH7.0)、缓冲液B(20mmol/L Tris-HCl,0.5mol/L NaCl,0.5mol/L Imidazole,pH 7.0)、变性液[20mmol/L PB(pH7.0)]，8mol/L尿素，10mmol/L DTT)、复性液[20mmol/L PB(pH 7.0)]、SP柱纯化低盐缓冲液C(20mmol/L PB,1mmol/L EDTA,pH7.0)、高盐缓冲液D(20mmol/L PB,1mmol/L EDTA,1mol/L NaCl ,pH7.0)，以上实验缓冲液配制所用试剂均为国药分析纯。

实验所用主要仪器和材料包括PCR仪(Biorad，美国)，EPS 300电泳仪(上海天能科技有限公司)，恒温振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)，超声波细胞粉碎仪VCX 750(南京新辰生物科技有限公司)，镍离子亲合柱6cm Ni Sepharose FF(General Electric Healthcare公司，美国)，20ml SP Sepharose FF 阳离子交换柱(General Electric Healthcare公司，美国)，AKTA Purifier 100(GE，美国)。

通过检索美国国家生物信息中心(NCBI)基因数据库得到人全长CXCL4基因序列(基因库检索号No. NM_002619.2GI:194097423)，全长306bp，将基因的密码子优化后构建到pET43.1a(+)载体中，并在序列前带有His标签(图 1)，重组后蛋白质大小为8.6kDa。南京金斯瑞公司全合成并测序，结果正确。将 pET43.1a-rhCXCL4 转化进 BL21 (DE3)菌株，挑取单菌落于含有 100mg/L 卡那霉素的5ml LB 培养基中，37℃、200r/min 摇床培养过夜。次日，将5ml 的菌液接种至 1L (含有100mg/L卡那霉素)LB培养基中，相同条件摇床培养，直至菌液OD₆₀₀=0.6~0.8时加入1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)37℃诱导5h。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测是否表达。

图 1 RhCXCL4原核表达载体构建 Fig. 1 Construction of rhCXCL4 expression plasmid The underlined sequences represent restricted sites; The rhCXCL4 protein was expressed as a fused protein with a 6×His-tag

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用6 000r/min收集经诱导表达的1L菌液，加入30ml破菌缓冲液充分重悬菌体，冰浴条件下进行超声破菌裂解(200Hz,3s/15s,10min×6次)。破菌后溶液在4℃ 14 000r/min离心30min，收集上清液并用0.22μm滤膜过滤备用。

将超声后的上清液用缓冲液A稀释10倍，镍柱用5个柱体积的缓冲液A平衡后，以 1ml/min流速上样，上样结束后，用5个柱体积的缓冲液A洗涤柱床。接着用5个柱体积的含60mmol/L咪唑的磷酸缓冲液洗涤柱子，最后使用含有500mmol/L咪唑的缓冲液B洗脱，收集洗脱液，各组洗脱液经SDS-PAGE检测分析。

将收集到蛋白质溶液用20mmol/L PB(pH7.0)、4℃透析过夜。将透析后的蛋白质溶液加入8mol/L尿素，边加边搅拌，再加入终浓度为10mmol/L的DTT，室温搅拌1~2h，待溶解后离心15℃ 12 000r/min，离心20min。将变性上清液用蠕动泵缓慢滴加到10倍体积的复性液内，再按照1∶1的比例，用蠕动泵加入新的复性液，将复性液在4℃下搅拌过夜，收集上清液。

将复性后的样品用阳离子交换柱SP柱进一步纯化。用含0~1mol/L NaCl洗脱液进行线性梯度洗脱，监测280nm紫外吸收下的出峰情况，并对所出峰洗脱样品进行收集，洗脱样品进行SDS-PAGE电泳分析。

采用常规的 SDS-PAGE 电泳分析蛋白质表达与纯化结果。用 15%分离胶，80V电泳 20min再换成130V电泳60min，然后进行考马斯亮蓝 R250 染色，观察蛋白质条带分布。

用 Western blotting 方法鉴定rhCXCL4的位置。将电泳完成的蛋白质样品以 250mA 电流100min原位转移到聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜上。膜被封闭后加入本实验室制备的可抗人抗小鼠CXCL4 单克隆抗体，并用抗大鼠HRP标记二抗孵育后，用 ECL 化学发光检测目的条带。

用鲎试剂凝胶法测定重组蛋白中的内毒素含量，具体方法参照试剂盒说明书。

采用SDS-PAGE和银染法检测目的蛋白纯度。制备15%分离胶、4%的浓缩胶，80V电泳待溴酚蓝进入分离胶后，换成130V电压至溴酚蓝到达胶底端即停止，分别进行考马斯亮蓝R250染色和银染，观察蛋白质条带位置并分析纯度。

rhCXCL4的生物活性通过ACHN细胞存活率的变化来检测。将ACHN细胞以3×10⁴个 / ml铺于 96 孔板中，含5% FBS 的MEM培养基培养24h后待细胞完全贴壁，加入不同浓度rhCXCL4蛋白(72.6μg/ml、24.2μg/ml、8.1μg/ml、2.7μg/ml、0.9μg/ml、0.3μg/ml、0.1μg/ml)培养 48h，CCK-8试剂盒检测细胞存活率变化，并通过软件GraphPad Prism 5分析IC₅₀值。

将构建好的pET43.1a-rhCXCL4质粒转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)，挑取单克隆在LB培养基中振荡培养过夜，第二天转接至新的LB培养基培养至OD₆₀₀为0.6~0.8时，经表达条件摸索优化后选择使用1mmol/L IPTG,37℃诱导表达5h，菌体在上样缓冲液中95℃水浴裂解，7 500g离心30s，将上清液进行SDS-PAGE分析。经过考马斯亮蓝染色发现rhCXCL4在宿主菌中能够大量表达[图 2(a)]。

利用上述表达条件诱导1L细菌，菌体湿重为5.3g，加入30ml破菌液重悬后进行超声破菌裂解，破菌后溶液4℃高速离心，收集上清液进行蛋白质纯化。由于融合蛋白带有His标签，等电点(pI)为8.77，因此选择在pH7.0的磷酸缓冲条件下进行镍亲和层析色谱纯化(Ni Sepharose FF)。纯化后收集的样品经过SDS-PAGE分离后，进行考马斯亮蓝染色，结果发现，亲和介质能够特异性的吸附目的蛋白，使用500mmol/L咪唑洗脱液可将目的蛋白完全洗脱[图 2(b)]。

图 2 RhCXCL4蛋白表达与亲和层析纯化 Fig. 2 The expression and Ni Sepharose affinity purification of rhCXCL4 protein (a) rhCXCL4 was induced in E.coli BL21 1: Bacteria extracts without IPTG induction; 2: Induced total lysate; 3: Induced lysate supernatant; 4: Induced lysate sediment (b) Ni Sepharose affinity purification 1: Induced total lysate; 2: Induced lysate supernatant(10-folds diluted); 3: Flow-through; 4: Washing buffer; 5: Samples eluted with elution buffer (60mmol/L imidazole); 6~8: Samples eluted with elution buffer (500mmol/L imidazole); MW: Protein molecular weight with 97kDa,66kDa,45kDa,35kDa,27kDa,20kDa,14.4kDa; The arrow point to the location of target protein

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将上述洗脱下来的蛋白质进行还原和非还原电泳分析，经过考马斯亮蓝染色发现亲和层析纯化后的蛋白质有多聚体存在[图 3(a)]。因此将收集到的蛋白质溶液先用20mmol/L PB(pH7.0)透析过夜，然后用8mol/L尿素变性和稀释复性方法进行蛋白质复性。由于复性后蛋白质的理论等电点为8.77，蛋白质所处的缓冲液pH为7.0，故使用阳离子交换柱(SP柱)进行下一步纯化。样品能够与SP柱介质很好地结合，用NaCl浓度梯度进行洗脱。结合SP柱色谱图[图 3(b)]和SDS-PAGE结果[图 3(c)]可以看出只有一个单峰，无杂峰出现。同时非还原电泳显示目的蛋白已无多聚体形式存在[图 3(c)，9]。

实验最终获得了15ml蛋白质溶液，通过Bradford法检测蛋白质浓度，共得到约20.015mg蛋白质。

图 3 RhCXCL4蛋白阳离子交换柱纯化 Fig. 3 Purification of rhCXCL4 by cation exchange chromatography (a) Non-reduced and reduced SDS-PAGE analysis of purified protein 1: Non-reduced SDS-PAGE analysis of protein after affinity chromatography; 2: Reduced SDS-PAGE analysis of protein after affinity chromatography (b) Purification of rhCXCL4 by cation exchange chromatography after denaturation and renaturation (c) SDS-PAGE analysis of eluted protein 1: Renaturation solution; 2: Flow-through; 3~8: SDS-PAGE analysis of collected fractions from peak; 9: Non-reduced SDS-PAGE analysis of purified rhCXCL4 protein; MW: Protein molecular weight

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纯化产物 rhCXCL4 纯度通过银染法和Tanon 凝胶成像系统估测在 97%以上[图 4(a)]，内毒素检测试剂盒检测内毒素含量约为2.5EU/μg。Western blotting证实该条带为rhCXCL4蛋白[图 4(b)]。

图 4 RhCXCL4蛋白纯度和鉴定 Fig. 4 Purity and identification of rhCXCL4 protein (a) Purified rhCXCL4 was loaded on SDS-PAGE and protein sliver-staining 1: Purified rhCXCL4 (b) Western blotting analysis of purified rhCXCL4 1: Bacteria extracts without IPTG induction; 2: Induced total lysate; 3: Purified rhCXCL4; MW: Protein molecular weight

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rhCXCL4 的生物活性通过对人肾癌细胞系(ACHN)的存活率变化来检测。实验将ACHN细胞用0.1~100μg/ml的rhCXCL4蛋白孵育，72h后MTT检测发现rhCXCL4(IC₅₀=11.25μg/ml)有效降低了ACHN细胞的存活率(图 5)。实验结果表明，rhCXCL4对ACHN细胞的增殖具有抑制作用，从而有效验证纯化所得 rhCXCL4 具备生物学活性。

图 5 RhCXCL4蛋白对ACHN细胞的增殖抑制 Fig. 5 Purified CXCL4 inhibited the proliferation of ACHN cells

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大肠杆菌具有生长快、培养经济方便、表达水平高、可选载体和宿主多及遗传性状清晰等优点，因此在基因工程中成为首选的表达系统^{[14, 15]}。本研究通过将rhCXCL4构建到常用的pET43.1a(+)载体中，在大肠杆菌中得到高效表达。同时为了简化纯化步骤，在蛋白质的N端直接加上His-tag。但原核表达也存在不足之处，如缺乏翻译后修饰、有毒性、容易形成包涵体^[16]等。本实验中，超声破菌后上清液出现可溶表达，但同时亦有包涵体出现[图 2(a)]，将破菌后上清液经亲和层析纯化后，通过还原性电泳发现的确有多聚体形式存在[图 3(a)]，因此本实验在亲和层析与离子交换层析纯化之间将蛋白质进行变性和复性处理，这样大多数蛋白质能够有充分的时间和空间进行结构的修正，从而确保纯化后的蛋白质结构正确，有生物活性。而在SP柱纯化后由于洗脱下来的都是带电荷及结构正确的蛋白质，且杂蛋白质更少，缓冲液条件也较为稳定，因此没有多聚体形式的蛋白质出现。理论上本实验利用包涵体纯化也可获得目的蛋白，但相比而言，可溶性表达纯化工艺更加简单，可避免被蛋白酶降解和N端甲硫氨酸延伸，蛋白质正确折叠概率更高^[17]，因此本研究并没有将包涵体中的目的蛋白进行纯化处理，而是希望能够提高rhCXCL4蛋白的可溶性表达从而为该蛋白质的纯化提供更便利的实验方案，即使本研究中也采用了变性复性处理，但仍然较包涵体变性复性更易摸索条件和更易操作。也正因如此，提高可溶性表达成为原核表达系统中非常关键的一步，除了传统优化载体宿主及诱导条件外，新的提高蛋白质可溶性表达的策略也不断出现，如使用荧光标记基因分析系统^[18]、嗜热裂孢菌角质酶共表达系统^[19]、乙酸钠-乳糖诱导表达系统^[20]等。

ELR- 类趋化因子的主要受体是CXCR3，目前研究表明CXCR3至少有3个剪切本，分别是CXCR3-A、CXCR3-B和CXCR3-alt^[5]。Lasagni 等在早期研究表明，CXCR-3B是CXCL4的主要受体，CXCR-3B主要介导细胞调亡并抑制细胞增殖，介导血管生成抑制活性，并在人肾癌细胞系ACHN中表达^{[21, 22]}。最近有研究表明，CXCR-3A和CXCR-3B能够竞争性的与CXCL4结合^[23]，但ACHN细胞中并未检测到CXCR-3A表达，因此可以通过抑制ACHN细胞生存率实验进行rhCXCL4蛋白活性的检测。本实验结果显示纯化后的rhCXCL4蛋白对ACHN细胞的半数有效抑制浓度(IC₅₀)为11.25μg/ml，具有很好的生物活性，同时该检测活性的方法也可为以后检测抗CXCL4单克隆抗体的活性检测奠定基础。

趋化因子大家族具有很多相似的特点，不同的趋化因子具有相同的7次跨膜蛋白受体，如CXCL4、CXCL9、CXCL10和CXCL11的受体都是CXCR-3B^[24]，因此本工艺对纯化趋化因子家族的其他蛋白质都具有重要的参考意义。同时这也为制备抗CXCL4单克隆抗体、检测抗体亲和力，以及为进一步研究CXCL4蛋白在炎症和凝血反应及诸如动脉粥样硬化、癌症、肝纤维化等病理反应中的机制提供了必要的物质基础。

(1)将优化后的hCXCL4构建到pET43.1a载体上并转化进BL21 (DE3)菌株，当OD₆₀₀为0.6~0.8时，使用1mmol/L IPTG、37℃诱导5h即可大量表达目的蛋白。

(2)1L菌液经诱导表达后得到的rhCXCL4蛋白通过镍柱亲和层析纯化、变性复性及阳离子交换层析纯化，共获得20.015mg。纯化后的蛋白质纯度高且结构折叠正确。

(3)纯化得到的rhCXCL4可有效抑制ACHN细胞生存率，实验表明rhCXCL4具有很好的生物活性，可用于进一步研究。