文章信息
- 邱丽娟, 赵玉娇, 李多, 黄新伟, 王晓丹, 席珏敏, 潘玥, 陈俊英, 孙强明
- QIU Li-juan, ZHAO Yu-jiao, LI Duo, HUANG Xin-wei, WANG Xiao-dan, XI Jue-min, PAN Yue, CHEN Jun-ying, SUN Qiang-ming
- 登革病毒四型联合重组包膜蛋白III区的表达和免疫原性鉴定
- Expression and Immunological Analysis of Recombinant Tetravalent Envelope Domain III Protein of Dengue Virus
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(1): 1-6
- China Biotechnology, 2016, 36(1): 1-6
- http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20160101
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文章历史
- 收稿日期: 2015-08-24
- 修回日期: 2015-09-25
2. 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室 昆明 650118
2. Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research & Development on Severe Infectious Diseases, Kunming 650118, China
登革病毒(Dengue virus,DENV)是一种单股正链RNA病毒,属于黄病毒属,黄病毒科,是全球流行广泛的虫媒传染病之一[1, 2]。每年接近25亿的包括成年人和儿童在内的人群面临感染登革病毒的风险,由于登革病毒的媒介白纹伊蚊及埃及伊蚊等广泛分布于热带及亚热带地区,所以这些地区是登革病毒广泛流行的地区。由于每年有大约1.2亿登革病毒携带者频繁地在热带及亚热带活动,因而登革热的防控形式比较严峻[3, 4]。在我国,登革病毒流行于包括福建、台湾、广州、云南等在内的地区,流行区域日益拓宽,出现疫情后往往发展比较迅速[5]。
登革病毒的结构主要包括衣壳蛋白(capsid,C)、膜蛋白(membrane,M)和包膜蛋白(envelope,E)3个结构蛋白和7个非结构蛋白(non-structure protein,NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)[6, 7]。登革病毒分为4种血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4),感染后会出现登革热(Dengue fever,DF)、登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克综合征(Dengue shock syndrome,DSS)等临床表现[8]。引起登革出血热及登革休克综合征的一个重要原因可能是抗体依赖增强感染效应(antibody-dependent enhancement,ADE),即感染某一型的登革病毒后产生的亚中和抗体,在患者再感染异型病毒时不但没有中和病毒的效果,反而在感染其他血清型病毒时介导病毒的复制扩增过程,最终使病情加重[9]。登革热疫苗的研究已经有70多年的历史,ADE问题一直困扰着研究者,成为登革热疫苗研究中的一个重要瓶颈。
研究已经表明,prM抗体对登革病毒的中和能力较弱,却能显著介导ADE效应,因此针对prM蛋白研究疫苗可能产生较强的副作用[10]。而登革病毒(Dengue Virus,DV)结构蛋白E蛋白结构域Ⅲ区(EDIII)具有中和抗原表位,能引起高水平的血清中和抗体滴度,且该区产生较少的交叉抗体或无交叉抗体,所以DV EDIII蛋白有望成为疫苗研制过程中一个非常有价值的靶抗原。并且就重组亚单位疫苗而言,与传统疫苗相比其具有安全有效、生产快速、效果稳定的优点,所以极有可能成为登革病毒疫苗研发的突破口[11]。在本研究中,我们人工合成了4种血清型登革病毒的EDIII区基因序列,用柔性肽分子将其拼接,对基因序列进行了酵母表达密码子优化,并构建了毕赤酵母高效表达菌株,通过表达及纯化最终获得四型联合的DV EDⅢ蛋白,通过免疫小鼠,证实所构建、表达及纯化获得的重组亚单位蛋白能介导小鼠产生高滴度的特异抗体。包含4种血清型病毒抗原表位的重组蛋白将成为一个登革病毒四价候选疫苗,同时,由于抗原表位选取的是登革病毒的包膜蛋白亚单位结构区域,在很大程度能规避抗体依赖增强感染效应这一副作用的发生,明显优于以其他结构蛋白为靶标设计的重组蛋白候选疫苗。
1 材料与方法 1.1 材 料 1.1.1 表达系统大肠杆菌(E.coli,DH5α)由中国医学科学院医学生物学研究所分子流行病学联合实验室保存。质粒pPink-HC/pPink-LC及酵母菌株PichiaPink strains 均购自Invitrogen公司。
1.1.2 细胞系及病毒C636细胞由中国医学科学院医学生物学研究所分子流行病学联合实验室保存,4种血清型登革病毒标准株由广东省疾控中心馈赠。
1.1.3 酶及试剂限制性内切核酸酶SphI、EcoRI、SpeI及DNA T4连接酶购自大连宝生物公司;质粒提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;HRP发光底物试剂盒购自Millipore公司;DNA回收试剂盒购自大连宝生物公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司;弗氏完全佐剂购自Sigma公司;铝佐剂由医学生物学研究所供给;6*his 抗体购自Proteintech公司;dengue EDIII抗体购自Santa公司;6*his磁珠购自苏州海狸纳米科技有限公司;6*his 镍柱购自GE公司。
1.1.4 实验动物BALB/c小鼠,购自中国医学科学院医学生物学研究所。
1.1.5 仪器PCR仪(Bio-Rad C1000);凝胶成像系统(Bio-Rad gel-doc xr+);培养箱(Thermo);摇床(Thermo orbital shaker 436); 酶标仪(Bio-Rad iMARK+)。
1.2 方 法 1.2.1 表达质粒的构建4种血清型的登革病毒EDIII蛋白基因序列(位点:907~1185)均选自中国流行株(表 1),序列经酵母密码子优化,添加以丝氨酸为主的柔性短肽(GGGSGSGGSGSGGSGS)对4个EDIII蛋白序列进行连接,并通过DS2.5蛋白空间结构分析后,由上海生物工程股份有限公司合成基因序列。通过PCR方法在目的基因两端引入6*his标签、肠激酶位点及EcoRI/SphI酶切位点,引物为DVR/DVF ( 5′-GCGAATTCATGCACCACCATCACCACCAT GACAGGTAAATTCAAGGTC-3′/5′-CGGCATGCTTAACCCTTTCGGAACC AATG-3′)。同时用EcoRI/SphI双酶切目的基因和pPink-HC/pPink-LC质粒,通过DNA回收试剂盒同时回收以上酶切产物。随后经T4 DNA连接酶连接后,获得含有目的基因片段的表达质粒,转入E.coli中培养挑选单克隆,扩增质粒,通过PCR、酶切反应及基因测序进行鉴定。
Serotype | Source | Code(GeneBank) |
I | Guangdong | EF508198.1 |
II | Fujian | EU249523.1 |
III | Zhejiang | GU721069.1 |
IV | China | EF436282.1 |
通过山梨醇处理生长状态优良的4种PichiaPink strain(strain1、strain2、strain3、strain4),获得毕赤酵母的感受态。同时将表达质粒用SpeI限制性内切核酸酶酶切后变成线性化质粒,通过电转的方法转化毕赤酵母。用MD培养基筛选出阳性克隆株,重复两次筛选培养获得表达稳定的菌株。
1.2.3 重组四型联合登革病毒EDIII蛋白的诱导表达及鉴定将鉴定后阳性单克隆酵母菌株培养于50ml BMGY培养基中,36h后离心菌体。用BMMY培养基清洗两遍,将菌体重悬于500ml BMMY培养基中培养,每24h补加一次甲醇至0.5%,继续培养84h后收获菌体。在0h、24h、48h、72h、84h时取培养液3 000r/min室温离心得菌体作SDS-PAGE实验,并且用6*his抗体和DV EDIII抗体作为一抗进行Western blot检测。
1.2.4 重组蛋白的纯化及鉴定将收获的菌体破碎后,溶解于含20mmol咪唑的磷酸缓冲液中(pH 7.4),4℃ 4 000r/min离心15min后取上清液,随后用Bio-Rad 的His trap FF预装柱及Ni-磁珠进行纯化。
His trap FF预装柱纯化:用平衡缓冲液平衡His trap FF预装柱,通过上样使蛋白质与填料结合,用冲洗缓冲液(pH 7.4,50mmol咪唑的磷酸缓冲液)冲洗,去掉非特异结合的杂蛋白质,最后将目的蛋白用洗脱缓冲液(pH 7.4,500mmol咪唑的磷酸缓冲液)洗脱下来。
Ni-磁珠(His-tag beaver beads)纯化:取适量Ni-磁珠,将蛋白质溶液加入,通过混合后使目的蛋白与Ni-磁珠结合,将混合后的磁珠悬液置入磁架,洗涤3次去除未结合的杂蛋白质,最后通过洗脱液将目的蛋白洗脱。上述纯化获得的蛋白质各取200μl洗脱液进行SDS-PAGE电泳,鉴定纯化蛋白质的含量和纯度。
1.2.5 动物实验及免疫原性检测0.01mol/L PBS透析纯化后的蛋白质洗脱液,获得的蛋白质溶液以5μg/ml的浓度包被ELISA板。对本实验室保存的免疫DVII、DVIII小鼠血清及采自西双版纳的登革热患者血清进行检测,并且用PBS作为阴性对照,鉴定重组蛋白的免疫原性。
用0.01mol/L PBS透析纯化后的蛋白质洗脱液,然后免疫6周龄的Balb/c小鼠,50μg每只,分为两组,分别混以弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。每间隔10天免疫一次,共免疫三次,每次免疫后第7天采血测定,第三次免疫后第7天处死取血,分离血清用于ELISA检测。用纯化蛋白质以5μg/ml浓度做包被蛋白,1∶100μl每孔包被于96孔板中,4℃过夜,次日洗板5次;加入封闭液200μl/孔,28℃ 1h;加入100μl稀释好的血清(1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000),每孔做3个重复并设置空白孔,37℃孵育2h;洗板5次,加入100μl 1∶10 000稀释后的HRP酶标抗鼠抗体,37℃孵育1h;洗板5次,用TMB显色法显色10min,加终止液终止并读数,双波长读取数值得A值,A值=A450-A630-Blank。
选取ELISA检测结果高的免疫血清用于中和试验,即将血清置56℃灭活30min后,稀释为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256浓度,50μl/孔加入到96孔板中,每个稀释度重复5孔。向其中4孔中加入50μl包含100TCID50的病毒稀释液,置5% CO2 28℃培养箱中45min,向每孔加入100μl稀释到3×105个/ml的C636蚊子细胞,未加病毒的孔即为血清毒性对照组。将96孔板放在5% CO2 28℃培养箱中培养7天,观察病变情况。4种血清型登革病毒中和试验条件完全一致,96孔板独立不共用,避免病毒交叉污染影响实验结果。
2 结 果 2.1 表达质粒的构建及鉴定人工合成的四型登革病毒联合EDIII核酸片段大小为1 113bp,表达使用的候选质粒为pPinkHC/pPinkLC 7.7kp,将片段和质粒同时通过EcoRI/SphI双酶切产生黏性末端,加入T4 DNA连接酶连接后将连接产物转化至E.coli中,于氨苄抗性的LB平板筛选阳性克隆,获得的单克隆扩增后提取质粒,通过PCR、双酶切鉴定,见图 1、图 2。结果表明获得了准确克隆的pPinkHC-DV EDIII/pPinkLC-DV EDIII质粒。
Marker: DL2000; 1,2 : Tetravalent EDIII gene of Dengue virus |
Marker:DL15000;1,2:Recombinant plasmid pPinkHC;3,4:Recombinant plasmid pPinkLC |
将表达质粒在1 500V、250Ω条件下电转入酵母感受态中,用MD平板筛选阳性克隆。挑取单克隆的酵母株进行诱导表达,在BMMY培养基中加入甲醇诱导表达,表达产物通过anti-6*his抗体进行鉴定和筛选,选出候选的表达效率较高的菌株。对候选高效表达工程菌株再次进行培养和目的蛋白的诱导表达,并通过Western blot 检测和鉴定,再次验证重组蛋白的表达(41kDa),见图 3。将最终筛选出的工程菌株转接至诱导表达培养基中大量培养,将培养菌体破碎,所得上清液用分别通过GE的His trap FF预装柱及Ni-磁珠(His-tag Beaver beads)进行纯化,产物用SDS-PAGE进行检测,如图 4所示。
(a)anti-6*his 1~8: Recombinant EDIII expression induced in Pichiapink yeast strains with pPinkHC/LC -EDIII;9: Pichiapink yeast control without pPinkHC/LC -EDIII (b)anti-DV EDIII 1,2: Recombinant EDIII expression were induced in Pichiapink yeast strain1,strain4 with pPinkHC/LC -EDIII ;3 Pichiapink yeast control without pPinkHC/LC -EDIII |
Marker: protein maker;1: Recombinant tetravalent EDIII purified by his-trap FF; 2,3: Recombinant tetravalent EDIII purified by His-tag Beaver beads;4:Total lysate of Pichiapink yeast strain with pPinkHC/LC -EDIII;5:Total lysate of Pichiapink yeast strain without pPinkHC/LC -EDIII |
5μg/ml的纯化后重组蛋白包被ELISA板,用DVII、DVIII病毒的小鼠免疫血清及登革热患者血清进行免疫吸附检测,同时设置PBS作为阴性实验组。临界值设为阴性对照校正OD值的2.1倍,阴性对照校正OD值小于0.05则按0.05计算,高于0.05按实际OD值计算,大于临界值判定为阳性,小于临界值则为阴性,结果见表 2。
DVII小鼠免疫血清 | DVIII小鼠免疫血清 | 登革热病人血清 | PBS(阴性对照) | |
1 | 3.863 | 3.815 | 1.041 | 0.051 |
2 | 3.730 | 3.711 | 1.378 | 0.047 |
3 | 3.492 | 3.674 | 1.135 | 0.049 |
平均值 | 3.695 | 3.733 | 1.185 | 0.049 |
鉴定结果 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阴性 |
纯化所得的重组蛋白分别混以氢氧化铝佐剂和弗氏佐剂免疫小鼠(50μg/次 每只与等体积的佐剂混合),同时设置注射PBS对照组小鼠,统一采血,用ELISA法测定效价,结果显示弗氏佐剂混重组DV EDIII蛋白组效价为1∶9 586,氢氧化铝佐剂混重组DV EDIII蛋白组效价为1∶4 935,弗氏佐剂组引起明显偏高的免疫反应。
EILSA结果中弗氏佐剂组能刺激小鼠产生更高水平的免疫反应,故用该组血清针对4种血清型别登革病毒的标准株进行中和试验。实验结果通过Read-Muench法进行统计分析,计算公式如下:
距离比例=(高于50%的保护率-50%)/(高于50%的保护率-低于50%的保护率)
LgPD50=高于50%的保护率血清稀释度的对数+距离比例×稀释度对数的差
重组四型联合EDIII蛋白免疫小鼠血清对4种血清型别病毒作中和试验,显示DVI-DVIV型PD50分别为1/34、1/20、1/45、1/18,即待测血清分别稀释为1∶34、1∶20、1∶45及1∶18时能保护50%细胞免于4种血清型登革病毒感染后病变。结果值均大于1∶4,表明待测血清能对登革病毒的感染起到有效的保护作用,证明重组四型联合EDIII蛋白具有良好的免疫原性。
3 讨 论登革病毒现在全球热带及亚热带地区广泛流行,据WHO的统计有112个国家流行过登革热,且全世界约25亿人受到登革热的威胁。登革热疫情在我国近几年呈现爆发式的流行,以广州为例,仅2014年一年的病例就占1978年以来总病例的70.57%[13]。2013年云南西双版纳登革热疫情暴发,共报告登革热1 313例,其中本地感染1 294例,诊断重症病例39例,本次登革热属Ⅲ型病毒亚基因Ⅱ型[12]。2014年广东省暴发了登革热疫情,截至2014年10月21日,全省共有20个地级市累计报告登革热病例38 753例,其中重症病例20例,死亡病例6例,可见近期我国登革病毒的流行有上升的趋势[13, 14]。同时,由于登革病毒感染中的ADE效应,没有合适的实验用动物模型,以及对登革病毒引起的免疫病理反应的机制缺乏了解,导致登革热疫苗研究受到了大大的制约 ,登革病毒疫苗的研制显得更加迫切[15]。从成分上分类,目前在登革病毒疫苗的研究方面,主要有灭活疫苗、减毒活疫苗、重组亚单位疫苗和DNA疫苗4种,其中重组亚单位疫苗能够介导比较单一的抗体组分,尽量减少不必要的交叉抗体或其他抗体的产生,因而在避免ADE效应上显露出明显的优势,在安全性方面具有突出的优势[16]。
登革病毒E蛋白能引起机体明显的免疫反应,产生高水平的中和抗体[8],E蛋白III区具有中和表位,能引起高水平的中和抗体,且该区产生较少的交叉抗体或无交叉抗体,因此DV EDⅢ蛋白成为疫苗研制过程中一个重要的靶抗原[6]。在本研究中我们分别选取了从1978年以来在我国流行的具有代表性的Ⅰ~Ⅳ型登革病毒株,并将4种血清型的登革病毒的EDIII蛋白截取出来获得相关的编码基因序列,通过以丝氨酸为主的柔性肽将4个型别的EDIII片段连接,在毕赤酵母真核表达系统中获得高效表达并纯化获得高纯度的DV EDIII四型联合蛋白,以期获得四价联合候选亚单位疫苗。小鼠免疫实验表明,重组的DV EDIII四型联合蛋白可以引起机体的高水平免疫反应,证明实验所获得的重组蛋白具有较好的免疫原性,为四价联合登革病毒重组亚单位疫苗的研究奠定了良好的基础。为了进一步提高免疫效果,我们目前也正在采用CpG寡聚脱氧核苷酸作为免疫佐剂开展进一步的研发工作。
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