缺血性心脏病是当前发达国家人类发病和死亡的主要原因，也是发展中国家主要的医疗负担^[1]。目前的治疗技术包括药物治疗、介入治疗、手术治疗等，但皆只能开通闭塞的冠脉血管或缓解症状，而不能解决最主要的问题——心肌细胞损伤^[2]。成人心肌细胞主要为分化终末期细胞，因此心肌梗死后受损部分由纤维组织瘫痕修复，缺少心脏实质细胞再生。细胞治疗为缺血性心脏病的治疗提供了一种新的选择。胚胎干(Embryonic stem,ES)细胞和诱导多功能干(induced pluripotent stem,iPS)细胞已证实具有明确的心肌细胞分化潜力，但仍存在伦理障碍，诱导时程长、效率低，细胞功能不完整^[3]，成瘤性，表观遗传不稳定^[4]等问题，因此限制了其临床应用。

近年来发展的一项新技术——直接重编程(direct reprogramming)又称为直接转分化(direct transdifferentiation)。该技术能够使成熟细胞直接转化为另一种成熟细胞，跳过产生多功能干细胞的中间阶段，有望为将来的细胞再生治疗提供更为便捷、安全的细胞来源^{[5, 6]}，为心血管病患者心脏修复的临床应用带来新希望。直接重编程发现于上世纪80年代，研究者将非肌肉细胞和肌肉细胞融合后，发现细胞表现出肌肉细胞为主导的特性，据此筛选出一种称为MyoD的肌肉细胞调控因子，并由此推测起源于同一胚层的不同类型细胞之间可以相互转化^{[7, 8]}。Vierbuchen等^[9]在小鼠成纤维细胞中导入编码转录因子的三个基因(Ascl1,Brn2,和Mytl1)，成功诱导出神经元样细胞。这是第一次使用特异性转录因子，无需产生iPS细胞，将分化成熟细胞直接重编程为一种特定细胞类型的成功报道。类似的方法已用于成纤维细胞重编程为神经元细胞、骨骼肌细胞、胰岛B细胞、肝细胞、内皮细胞及血细胞等^{[10, 11, 12]}。本文就体细胞直接重编程应用于心脏再生治疗现状和发展作一综述，重点介绍重编程方法检测标准、现存的问题及未来前景。

受Takahashi等^[13]利用一系列转录因子获取iPS方法的启发，Ieda等^[14]据此测试了不同的转录因子组合，最终在14种转录因子中优化筛选出3种心脏细胞转录因子(Gata4,Mef2c,Tbx5:合称GMT)。首先用α心肌重链蛋白绿色荧光(αMHC-GFP)报告基因标记新生小鼠心脏成纤维细胞，然后用携带GMT转录因子编码基因的病毒感染宿主细胞，转染3天后即有GFP⁺细胞出现，10天后，αMHC-GFP⁺细胞达到20%。最初有不到1/3的GFP⁺细胞肌钙蛋白T(cTnT)表达阳性，4周后cTnT⁺细胞达到45%。同时，大约30%的GFP⁺细胞表现出心肌细胞特性，即自发的钙离子浓度瞬时变化，亦有可自发跳动的细胞出现。Song等^[15]研究指出，在GMT基础上加入转录因子Hand2，可将获得αMHC和cTNT共表达细胞的效率提高3倍左右^[15]。Protze等^[16]在小鼠胚胎成纤维细胞中测试了120种转录因子组合，尽管未培养出有功能的心肌细胞，但他们指出，Tbx5,Mef2c,和 Myocd诱导的心肌样细胞比GMT分化更完全。

然而，Chen等^[17]报道，慢病毒转导心脏成纤维细胞和尾尖成纤维细胞后，能够实现GMT转录因子的表达，但未检测出心肌特异性启动子，如Nkx2.5的激活，尽管有cTnT表达上调，但并无有功能的心肌细胞。实验结果存在争议的原因可能是：(1)不同实验者所用病毒载体的种类不同。Chen等使用的慢病毒载体GMT表达水平只有逆转录病毒的1%~10%^[18]；(2)病毒滴度不同；(3)实验具体步骤有所不同；(4)实验动物发育阶段不同。Ieda使用新生小鼠，Chen等^[17]选用3~6周龄小鼠。可见直接重编程对诱导条件的要求较为严格。

转录因子导入法是最早应用于诱导直接重编程的方法，使用携带了转录因子相关基因的病毒载体(逆转录病毒、慢病毒、腺病毒等)感染细胞，这一方法通过病毒将基因插入细胞，虽然尚未发现致癌风险，但永久改变了宿主细胞的DNA，有一定的潜在风险，且转化效率不高。

有研究显示，miRNA组合(miR-1,miR-133,miR-208,miR-499)可替代转录因子诱导成纤维细胞转分化，约1.5%~7.7%的成纤维细胞表现αMHC-GFP阳性。随后又证实单用mRNA-1即可诱发心脏表型，但转化效率较低^[19]。培养基中加入酪氨酸激酶(JAK)阻滞剂Ⅰ，抑制了细胞表现全能性的通路后，细胞αMHC-CFP阳性率比普通培养基中的细胞高出将近10倍，GFP⁺细胞达到28%。在第10天即发现了约1%~2%可自发收缩的细胞。而miRNA介导的Snai 1阻滞剂对转分化亦十分重要，因为Snai 1阻滞剂是抑制成纤维细胞特性的关键因子。这是第一次对直接重编程的分子机制进行解释^[20]。由于miRNA不会并入宿主染色体组，只进行短暂的瞬时表达，因此应用于人体的安全性可能更高，但效果也只能维持一段时间，随着核酸的代谢降解，效应减弱消失，需持续转染。

最初的直接重编程方法多采用遗传操作和核移植等技术，其技术难度限制了临床应用，且诱导效率难以满足临床应用需求，因此人们开始探索小分子“鸡尾酒”诱导方法——加入小分子以简化操作减少转录因子基因导入的数量、提高分化效率。Wang等^[21]报道，在培养基中加入一系列小分子物质(SB431542,CHIR99021,parnate和forskolin，合称SCPF)后，仅导入一个转录因子Oct4即可使小鼠胚胎成纤维细胞直接转分化为心肌细胞。细胞中Myh6、Nkx2-5等心肌特异性基因表达水平接近心肌细胞，Gata4表达水平则达心肌细胞的3倍以上。第20天发现跳动的细胞群落，第30天时，约1%的细胞可自发跳动。研究者还意外发现未导入Oct4的细胞经SCPF处理后也出现了管状的可跳动细胞，这些细胞可能是未完全转化的心肌细胞，拥有部分骨骼肌细胞特性^[21]。Ifkovits等^[22]在GMT基础上增加了转录因子Hand2，Nkx2.5，然后加入TGF抑制剂、SB431542，第10天时αMHC-GFP⁺细胞亦可达20%，且将获取可跳动细胞的效率提高了5倍，可见小分子诱导技术获取的心肌细胞的成熟度高于早期转基因诱导方法，目前，小分子诱导尚未完全取代转录因子，未来仍有待进一步研究。

胚胎干细胞和iPS技术无法实现的可能是体内的直接重编程。直接重编程如果仅能在体外环境下出现，则无法排除仅是人为因素造成，这可能使其临床应用大为受限。如果能在体内再现，则可能证明直接重编程是生物进化过程中保留的一种潜能。如果能使心梗后填充的成纤维细胞在体内转分化为心肌细胞，则无需细胞移植。

目前体内转重编程实验多用携带有转录因子编码基因的逆转录病毒直接注射进心脏受损区域，诱导原位再生。并利用受特异性成纤维细胞启动子调控的Cre重组酶标记初始细胞，便于进行成纤维细胞示踪^[23]。实验者建立小鼠心梗模型后导入GMT，可将小鼠体内内源性非心肌细胞(大部分为成纤维细胞)诱导为有功能的心肌细胞，梗死及周边区域约35%的心肌细胞为新生细胞，超过一半的心肌细胞拥有排列完好的肌节结构，具有电生理特性，并能与内源性心肌细胞同步收缩^[24]。心肌梗死发生12周后，瘢痕组织面积减少50%，射血分数为对照组的两倍。同时，加入HAND2和Vegf可提高GMT的体内重编程效率^{[15, 21]}。以上实验表明，体内重编程治疗可在一定程度上缩小梗死面积，改善心功能。

研究者进一步探索了人类细胞直接重编程的应用。研究显示，仅使用GMT不足以使人体细胞转分化。加入转录因子ESRRG和MESP1后，虽然能使人类成纤维细胞重编程为表达心脏细胞基因并产生肌节的心肌样细胞，但效率非常低。继续加入心肌素(Myocd)和转录因子ZFPM2 (FOG2)后，可使心肌样细胞生成更成熟的肌节，并产生钙瞬变，某些细胞中还会出现自发动作电位。研究者同时还证明生长因子β(TGF-β)对提高重编程效率非常重要；说明合适的因子组合可能使人类心肌细胞表观遗传稳定表达^[25]。使用激活素A(Activin-A)和骨形态发生蛋白2(BMP2)处理细胞，然后仅加入两种转录因子MESP1和ETS-2即可诱导出心肌样祖细胞^[26]。在GMT和Myocd基础上加入两种mRNA(miR-1和miR-133)可以使20%的人类成纤维细胞重编程为cTnT⁺细胞^[27]。导入GMT,MESP1和Myocd，与大鼠心肌细胞共同培养，可获得能产生动作电位和搏动的心肌细胞。除诱导因子外，载体的影响也不可忽视，转染效率低必然导致直接重编程效率降低。研究发现，使用泛噬性逆转录病毒载体的诱导效率高于使用间噬性逆转录病毒、亲噬性逆转录病毒和慢病毒，其有望广泛用于难以转染的细胞类型^[28]。

目前，人类细胞直接重编程的效率低于小鼠，仍需寻找更为合适的转录因子或mRNA、小分子组合作为人类细胞直接重编程的诱导条件。

目前体细胞直接重编程为心肌细胞尚无统一的评估标准，评估方法的说服力亦有差别。加入诱导因子1~4周后，可使用流式等方法测定心脏标记基因或蛋白表达，并进一步做细胞功能性分析^[29]。利用RT-PCR进行检测，发现心脏特异性基因表达上调，来源细胞特异性基因表达下调。在蛋白表达水平，心脏特异性蛋白[如α肌球重链蛋白(αMHC)、肌钙蛋白T (cTNT)和肌动蛋白(α-actin)等]表达阳性^[26]。形态学方面，重编程细胞可见清晰的肌纤维结构。产生钙瞬变是细胞有功能的最早标志，可使用Ca²⁺染料(如fura-2和rhodamine-3)或Ca²⁺标记物(如GCaMP)进行测定。诱导出起搏细胞自发收缩，非起搏细胞接受电或化学刺激后收缩是证明细胞功能的最显著证据，但需注意的是除成熟心肌细胞外，心脏祖细胞等亦有收缩功能，需加以区分。使用膜片箝技术或微电极记录法可测得跳动细胞的动作电位，如果细胞足够成熟，电生理特性还可以用于分辨细胞亚型(心房细胞、心室细胞等)^[30]。异丙肾上腺素刺激后，细胞亦可出现收缩力增强、动作电位时程缩短等反应。

尽管直接重编程诱导的心肌细胞与自然心肌细胞已十分相似，但特性功能上仍有差距，未来应进一步探索提高诱导效率和细胞成熟度的方法。

直接重编程与干细胞技术相比，跳过了干细胞阶段，短期内即可获取功能更佳的心肌细胞，诱导时间缩短，应用自体细胞不受伦理因素限制，且可能进行在体直接转分化，无需进行细胞移植，可避免成瘤性风险、移植存活率低和免疫排斥反应等问题^[31]；若使用小分子或miRNA诱导方法，有望取代转录因子导入，消除病毒载体及靶基因插入带来的相关风险，改变转录因子添加种类、最佳浓度、比例，优化外部培养条件等有望提高诱导效率、靶细胞功能完整性。另外有研究显示直接重编程诱导方向精确，不会产生靶细胞之外的细胞类型。但目前直接重编程仍未能获得完全成熟的心肌细胞，仅有少部分细胞拥有自发电活动、自发收缩等功能；由于心肌细胞自身难以增殖，因此难以获取临床数量级的细胞用于临床实验，并最终用于临床治疗，而目前研究多使用成纤维细胞，若用于临床治疗，需自皮肤取材，十分不便，因此，选用最佳细胞来源是未来的一个研究目标。直接重编程的机制亦尚未完全清楚，心肌微环境等外部条件的作用、表观遗传的稳定性等有待研究。同时还存在一些技术困难，如体内重编程实验中，miRNA或小分子方法如何在在体靶细胞区域保持足够的刺激时间；转基因方法如何将目的基因准确导入在体靶细胞等。此外，必须进一步掌握鉴别和获取特定靶细胞类型的方法^[32]。

在干细胞治疗领域，胚胎干细胞因伦理限制难以真正用于临床，诱导多功能干细胞分化时程长，成体干细胞(如骨髓间充质干细胞)已逐渐转向研究其旁分泌作用。直接重编程作为一项新兴技术，是以诱导多功能干细胞技术为基础的优化，为再生治疗开辟了一个新方向。应用细胞直接重编程技术，实现一举多得——降低操作难度，提高分化效率，避免干细胞技术潜在风险，获得再生治疗的最佳细胞来源等，将是研究者努力的方向。目前直接重编程技术处于发展阶段，离真正应用于临床还有一定距离，仍有很多问题等待人们探索。但可以确定的是，未来的再生医学正朝着更高效、精确的方向发展，直接重编程技术将继续在控制细胞命运、理解细胞转化机制方面扮演重要角色，为调控细胞功能、促进组织修复提供强有力的支持。