免疫球蛋白 E(IgE)虽然是人体内分布最少的免疫球蛋白，但它是变态反应性疾病关键介导者^{[1, 2]}，其中I型变态反应性疾病，如特应性哮喘、鼻炎、食物过敏、特应性皮炎等均由IgE介导^{[3, 4, 5]}，其介导的过敏反应机制如下：IgE通过Fc区与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面IgE受体FcεRI结合后触发一系列生化反应，并释放出组胺，白三烯等引起炎症反应的过敏物质、蛋白酶以及促炎症性反应细胞因子，从而引起黏膜或者皮肤等部位嗜酸性粒细胞浸润和炎症反应^{[6, 7]}，进而出现各种过敏性疾病。

变态反应机制研究表明：可以利用抑制剂中和血液中的IgE，降低血液IgE浓度水平，从而降低 IgE与受体FcεRI结合达到治疗过敏性疾病^[8]。FDA于2003年6月批准的重组人源化IgE单克隆抗体omalizumab是首个治疗哮喘等过敏性疾病的抗体^{[8, 9]}，但残留的鼠源性片段会引起较强的人抗鼠抗体反应(HAMA)，本实验室利用核糖体展示技术从患者外周血中筛选获得一种全人源抗IgE单链抗体(single chain fragment variable scFv),该单链抗体显示出对人IgE分子具有较强特异性及亲和力^[10]，为新型小分子抗体片段，因其分子量小(为全抗体的1/5)且全人源单链抗体，因此预测其免疫原性较omalizumab低。本单链抗体利用比CHO更廉价的大肠杆菌表达，因此该单链抗体显示出可进一步开发为抗IgE小分子抗体新药的价值。

protein L亲和层析填料是GE公司近几年开发的针对有Kappa轻链抗体片段纯化的新型高特异性填料，其纯化的基本原理是利用高pH值上样，低pH值洗脱从而达到纯化目的。

本论文通过对anti-IgE单链抗体纯化工艺的研究，建立了该小分子抗体的两步纯化工艺技术。该工艺技术步骤简洁、收率高，为其进一步放大工艺研究和样品制备奠定了基础，同时该技术也为其它大肠杆菌表达的单链抗体的纯化工艺研究奠定了基础。

分泌型表达重组anti-IgE单链抗体工程菌pET-IgE/BL21(DE3)由本实验室构建及保存,其可溶性表达产物存在于大肠杆菌周质中。

胰蛋白胨、酵母提取物为Oxiod公司产品；甘油、 KH₂PO₄、NaCl、Na₂HPO₄·12H₂O、柠檬酸钠及各种微量盐等常用试剂购自成都科龙化学试剂公司；甘氨酸购自天津天安有限责任公司；巯基乙醇、咪唑购自Sigma公司；氯霉素、氨苄青霉素、蛋白Maker购自Fermentas公司；CE-SDS纯度检测试剂盒购自Beckman Coulter公司。

Hitrap protein L(1ml)及hitrap his(5ml)预装柱、protein L层析填料购于GE公司；Biacore分子互作分析仪、1.6×40 xk层析柱、蛋白纯化仪purifier 10 购于GE公司;毛细管电泳仪购自Beckmam Coulter公司。

LB培养基:10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl；M9培养基：15g/L Na₂HPO₄·12H₂O、3g/L K₂HPO₄、0.5g/NaCl、1g/L NH₄Cl、0.1mmol/L CaCl₂、1mmol/L MgSO₄、0.3%(v/v)甘油、pH7.0；微量元素(Trace element)：25mmol/L FeCl₃·6H₂O、20mmol/L CaCl₂、10mmol/L MnCl₂、10mmol/L ZnSO₄·7H₂O、10mmol/L MnCl₂、2mmol/L CoCl₂·6H₂O、2mmol/L CuCl₂、2mmol/L NiSO₄、2mmol/L Na₂MoO₄·2H₂O、2mmol/L H₃PO₃；protein L亲和层析上样缓冲液：PBS+0.05mol/L甘氨酸+4mmol/L EDTA pH 8.0；protein L亲和层析洗涤缓冲液：0.05mol/L 甘氨酸+0.05mol/L柠檬钠pH3.5；protein L亲和层析洗脱缓冲液: 0.05mol/L 甘氨酸+0.05mol/L柠檬钠pH2.0；Ni亲和层析上样缓冲液:50mmol/L NaH₂PO₄、0.3mol/L NaCl、20mmol/L咪唑、pH8.0；Ni亲和层析洗脱缓冲液：50mmol/L NaH₂PO₄、0.3mol/L NaCl、500mmol/L咪唑、pH8.0。

取冻存菌按照0.1%接种量接种50ml含1%葡萄糖的LB培养基(Amp⁺)中，37℃，260r/min过夜活化作为种子，种子培养好后转种及诱导：按1%的接种量接入400ml M9(加入各种微量元素)培养基中，37℃，260r/min培养至OD₆₀₀=0.6~0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，25℃过夜诱导,离心收集菌体放在－20℃冰箱备用，其可溶性表达目标蛋白用Western blot(WB)检测，检测方法如下：取1g菌体，按1∶5比例加入protein L上样缓冲液混匀后，进行超声破碎。破碎液离心取上清进行SDS-PAGE电泳，然后通过半干转把SDS-PAGE胶的蛋白转移到PVDF膜上，用PBST(0.05% Tween-20的PBS)缓冲液洗涤膜3次，每次5min，然后把PVDF膜放在含2% BSA的PBST缓冲液10ml中，4℃过夜封闭，用PBST洗涤膜3次，每次5min。随后把PVDF膜放在PBST缓冲液稀释的抗-His HRP抗体偶联物 (1∶8 000) 10ml中,37℃孵育1h，用PBST洗涤膜3次，每次5min，最后用TMB显色，是否有杂交信号可判断可溶性表达。

(1)样品预处理：从－20℃冰箱取出菌体，按1:5比例加入Ni亲和层析上样缓冲液混匀，进行超声破碎(300W,工作2s、停2s、30min)，破碎液20 000 r/min离心40min后，上清经0.45μm滤膜过滤备用。

(2)Ni亲和层析：将hitrap his(1ml)预装柱连接到层析系统，上样缓冲液平衡柱5个CV,然后进行上样，上样量30ml。上样结束后，上样缓冲液5个CV洗涤柱子(基线平衡)，最后用洗脱缓冲液洗脱并收集峰，进行电泳检测分析纯度。

(3)样品预处理：从－20℃冰箱取出菌体，按1∶5比例加入protein L亲和层析上样缓冲液混匀，进行超声破碎(300W,工作2s、停2s、30min)，破碎液20 000 r/min离心40min后，上清经0.45μm滤膜过滤备用。

(4)Protein L亲和层析：将hitrap protein L(1ml)预装柱连接到层析系统，上样缓冲液平衡柱5个CV,然后进行上样，上样量30ml。上样结束后，上样缓冲液5个CV洗涤柱子(基线平衡)，最后用洗脱缓冲液洗脱并收集峰，进行电泳检测纯度。

(1)Protein L pH值洗脱条件优化：将hitrap protein L(1ml)预装柱连接到层析系统，上样缓冲液平衡柱5个CV,然后进行上样，上样量30ml。上样结束后，上样缓冲液5个CV洗涤柱子(基线平衡)，再用pH=5.0的buffer A(50mmol/L乙酸钠，50mmol/L柠檬酸钠)的缓冲液洗涤柱子5个CV，最后进行0% buffer B到100% buffer B的20个CV线性梯度洗脱(buffer B：50mmol/L乙酸钠，50mmol/L柠檬酸钠pH=2.0)，通过对层析图和SDS-PAGE图分析选出最佳洗涤和洗脱pH值。

(2)Protein L纯化线性放大：将装填好的层析柱1.6×40xk(20ml)连接到层析系统，上样缓冲液平衡柱5个CV,然后进行上样，上样量600ml。上样结束后，上样缓冲液5个CV洗涤柱子(基线平衡)，然后用最佳洗涤pH值洗涤5个CV,最后用最佳洗脱pH值洗脱5个CV,洗脱样品按1∶5收集在下一步纯化上样缓冲液中，并用稀NaOH(0.5mol/L)调pH=8.0，同时收集两个组分进行SDS-PAGE检测。

将hitrap his(5ml)预装柱连接到层析系统,上样缓冲液平衡柱5个CV,然后将上一步纯化收集的样品直接上样。上样结束后，上样缓冲液5个CV洗涤柱子(基线平衡)，然后用50mmol/L咪唑洗涤、500mmol/L咪唑洗脱，收集各组分，进行SDS-PAGE检测。

(1)纯度检测：SDS-PAGE纯度分析 取20μl样品加入5μl 5×上样缓冲液，混合均匀后，95℃煮5min，3000r/min离心2min，取上清液，进行分离胶为12%的SDS-PAGE电泳分析(200v)。采用凝胶系统拍照，记录结果并用Image lab 4软件分析纯度。

CE-SDS纯度分析 样品处理：按照试剂盒说明书进行，样品检测：首先用0.1N NaOH溶液以70 psi压力冲洗3min，然后用0.1N HCl溶液以70psi压力冲洗1min，最后用超纯水以70psi压力冲洗1min，完成进样前对毛细管的冲洗。接着将试剂盒中的SDS Gel以70psi压力10min灌入毛细管中。进样方式采用电动进样，进样电压为－5kV，进样时间为20s，分离电压为－15kV，分离时间为30min。PAD检测器检测(波长为220nm)，采集的数据用32karatTM软件分析。

(2)生物活性检测：竞争性ElISA结合活性鉴定^{[10, 11]} 稀释IgE蛋白 (浓度范围为1.28～167nmol/L)后与0.16ng/L纯化的anti-IgE scFv预混合,孵育30min。混合物加到IgE包被ELISA检测孔,4℃过夜，用含0.05% Tween的PBS缓冲液洗板3次,然后加入含0.05% Tween-20的PBS稀释的抗-His HRP抗体偶联物 (1∶4 000) 100μl,37℃孵育1h。用含0.05% Tween-20的PBS缓冲液洗孔3次,向孔内加入TMB显影试剂100 μl,1 mol/L HCl 100μl终止显色反应,ELISA 酶标仪于450nm波长读数。

Biacore 亲和力活性分析^[11] 以4μg/ml的IgE与密度为4 000~5 000响应单位的传感器芯片上的羧甲基化游离胺基共价结合，纯化的anti-IgE用10mmol/L HEPES，150mmol/L NaCl，3mmol/L EDTA和0.05% Twenen-20的缓冲液等比例稀释成5种不同浓度，5种不同浓度的样品和检测控制液以20μl/min流速依次通过IgE固定芯片，其数据利用biaevaluation 4.1软件进行收集和分析，从而测量anti-IgE scFv与固定在芯片上的IgE的动力学参数。

(3)Biacore 中和活性分析^[11] 以4μg/ml的 FcεRI与密度为4 000~5 000响应单位的传感器芯片上的羧甲基化的游离胺基共价结合，等比例稀释纯化的anti-IgE(2~500nmol/L)成7个浓度后与 1.5μg/ml(8nmol/L)预混合，孵育30min。7种不同稀释度的混合样品和检测控制液以20μl/min流速依次通过FcεRI固定芯片，其数据利用biaevaluation 4.1软件进行收集和分析，从而测量IgE与固定在芯片上的FcεRI的动力学参数。

发酵结束离心收集菌体，细胞湿重收率14g/L，取菌体用protein L上样缓冲液混匀后，超声破碎后离心上清进行SDS-PAGE电泳，通过半干转将电泳胶上的蛋白转移到PVDF膜上，由于目标蛋白有6个his，带有抗-His HRP抗体偶联物与his杂交，然后TMB显色，有杂交信号表明有可溶性目标蛋白表达，见图1。

图 1 可溶性表达目标蛋白WB Fig. 1 WB profile of soluble target protein(anti-IgE scFv) 1:Soluble anti-IgE scFv WB; M:marker

图选项

分别采用Ni亲和层析和protein L亲和层析填料作为初纯化填料。Ni亲和层析纯化条件为：上样缓冲液破碎细胞，离心上清经过滤后直接上样。上样结束后，上样缓冲液洗涤5个CV后，洗脱缓冲液直接洗脱；protein L亲和层析纯化条件为：上样缓冲液破碎细胞，离心上清经过滤后直接上样。上样结束后，上样缓冲液洗涤5个CV后，洗脱缓冲液直接洗脱。洗脱后的目标蛋白产物经SDS-PAGE结果分析，Ni亲和层析的目标蛋白纯度为5%，见图2；protein L亲和层析的目标蛋白纯度为15%，见图3。因此第一步初纯化选择纯度相对较高的protein L填料。

图 2 Ni亲和纯化产物分析 Fig. 2 SDS-PAGE profile of Ni affinity purified anti-IgE scFv M：Marker; 1：Cell lysate supernatant; 2：Flow through; 3：Elution

图选项

图 3 Protein L 亲和纯化产物分析 Fig. 3 SDS-PAGE profile of protein L affinity purified anti-IgE scFv 1：Cell lysate supernatant; 2：Flow through; 3：Elution; M：Marker

图选项

protein L是GE公司开发的针对抗体轻链的一种亲和填料，其分离效果与pH密切相关。首先通过高pH值与scFv特异性结合，然后利用低pH值进行洗脱。因此本研究利用pH=5.0到2.0进行线性梯度洗脱来探索杂质洗涤的最佳pH值和目标蛋白洗脱的最佳pH值，发现pH=3.5时洗涤一个杂质蛋白峰，pH=2.0时洗脱目标蛋白峰，见图4。优化后进行放大到1.6×40的xk(20ml)柱，pH=3.5洗涤一个杂质蛋白峰，pH=2.0洗脱目标蛋白峰，与线性梯度洗脱的结果一致，见图5。经SDS-PAGE检测其纯度为50%，见图6。

图 4 Protein L线性梯度洗脱层析图 Fig. 4 Protein L chromatographic profile of linear gradient elution

图选项

图 5 Protein L放大等度梯度洗脱层析图 Fig. 5 Protein L chromatographic profile of scale-up isocratic elution

图选项

图 6 Protein L放大纯化anti-IgE分析 Fig. 6 SDS-PAGE profile of protein L scale-up purified anti-IgE scFv 1；Flow through; 2：pH=3.5 washing; 3：pH=2.0 elution; 4：Cell lysate supernatant; M：Marker

图选项

Protein L pH=2.0洗脱目标蛋白收集在Ni亲和层析纯化上样缓冲液中，同时用稀NaOH(0.5mol/L)调pH=8.0进行上样，发现50mmol/L咪唑是洗涤杂质最佳浓度，500mmol/L咪唑是洗脱目标蛋白最佳浓度，纯化的目标蛋白SDS-PAGE纯度99.0 %(目标蛋白为单体+二聚体)，见图7和图8。

图 7 Ni亲和纯化层析图 Fig. 7 Chromatographic profile of Ni affinity purified anti-IgE scFv

图选项

图 8 Ni亲和纯化产物分析 Fig. 8 SDS-PAGE profile of Ni affinity purified anti-IgE scFv 1：Reduced anti-IgE scFv; 2：No reduced anti-IgE scFv

图选项

为进一步鉴定经两步纯化样品的纯度，进行了毛细管电泳，目标抗体按单体和二聚体作为抗体的有效成分，非还原CE-SDS结果显示二者之和的纯度达到99.5%。二聚体∶单体=1∶6，见图9。

图 9 Anti-IgE ScFv的非还原CE-SDS分析 Fig. 9 No reduced CE-SDS profile of purified anti-IgE scFv

图选项

以结合的anti-IgE scFv为横坐标,结合的anti-IgE scFv与游离anti-IgE scFv比值为纵坐标作图，见图7,结果显示随着IgE 蛋白浓度的增加,与包被孔中IgE蛋白结合的anti-IgE scFv 浓度呈线性递减，证明 scFv 能特异性识别IgE靶标蛋白的Fc段(图10)。

图 10 抗IgE单链抗体与IgE竞争性ELISA Fig. 10 Competitive inhibition assay[10] b/f: The ratio of bound anti-IgE scFv concentration to free anti-IgE scFv concentration

图选项

以不同浓度anti-IgE抗体流过固定有IgE的芯片，其测定的Ka为6.70e⁴M，Kd为5.76e^-4M，KD(Kd/Ka)为8.59e^-9M，见图11。结果显示该抗体对IgE靶标具有良好亲和力，且达到了蛋白药物可作为药物应用的亲和力指标，有望成为一种治疗哮喘病的新药。

图 11 Anti-IgE scFv 抗体Biacore亲和力分析 Fig. 11 Anti-IgE scFv Biacore affinity analysis The scFv was injected at various concentration as indicated by different lines

图选项

固定IgE抗体浓度为8nmol/L (1.5μg/ml)与待检IgE单链抗体的7种不同稀释度组合为混合样品，孵育后依次通过固定有IgE受体蛋白FcεRI的芯片，检得IgE与其受体FcεRI蛋白的结合曲线，结果显示抗IgE单链抗体能阻断 IgE 结合到其受体FcεRI的结合位点，显示良好的中和活性，见表1，通过对表1的数据计算处理，计算得到anti-IgE抑制IgE的EC₅₀值为70nM，并进一步证明了该药物对IgE靶标具有良好的中和效果。

Protein L填料是GE公司近年来开发的一种针对有kappa轻链抗体片段纯化的新型高特异性填料，特别是对表达丰度非常低的大肠杆菌中可溶性scFv单链抗体有非常良好的纯化效果。

本研究结果显示，针对大肠杆菌周质表达的可溶性anti-IgE scFv单链抗体破碎液上清，因其含量极低，在第一步初纯化过程中，采用Ni亲和层析捕获目标蛋白其分离效果差，纯度很低，相反，protein L亲和层析则展示出良好的效果。同时，还纯化了其它几个单链抗体，都得到同样的结果，因此protein L用在捕获阶段有非常独特的纯化效果，为其它抗体片段的纯化提供了新的纯化思路。

pH值是protein L纯化的关键，通过pH值梯度优化，获得最佳洗涤pH=3.5，最佳洗脱pH=2.0。经过protein L亲和层析，anti-IgE单链抗体SDS-PAGE纯度为50%。经第二步Ni亲和层析后，其纯度为: SDS-PAGE纯度99.0%；CE-SDS纯度99.5%，两步收率为80.0%。经两步纯化后的anti-IgE抗体进行了活性检测，竞争ELISA显示其能特异性结合IgE靶标蛋白，Biacore亲和力的测定为KD达到8.59e^-9M，竞争Biacore测得anti-IgE scFv 单链抗体能明显阻断IgE 与受体FcεRI的结合，其抑制IgE的EC₅₀值为70nM,显示出anti-IgE单链抗体具有良好的中和效果。

通过本研究，建立了一种简洁、快速、收率高的anti-IgE单链抗体的纯化工艺，为anti-IgE抗体进一步放大制备工艺的研究奠定了良好的基础。

目前治疗哮喘的大分子药物只有omalizumab单抗，但由于是人源化单抗，其鼠源性会引起较强的人抗鼠抗体反应(HAMA)副作用，而anti-IgE是全人源单链抗体没有这样的副作用。经对纯化的anti-IgE抗体活性分析，其竞争Elisa结果证明能特异性结合IgE的Fc段，Biacore亲和力结果为8.59e^-9M，竞争Biacore测定的anti-IgE scFv 抗体抑制8nM (1.5μg/ml) IgE 结合到其受体FcεRI的中和阻断活性结果，其抑制IgE的EC₅₀值为70nM，表明其满足新药开发的要求，并使其可能成为一种更安全更有效的治疗哮喘病的新药。