肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)是人体内正常表达的一种蛋白，为Ⅱ型膜蛋白，属于肿瘤坏死因子(tumer necrosis facter,TNF)超家族。WILEY等^[1]首次发现并克隆了这个开放阅读框为1 769bp的cDNA。其基因定位于人染色体3q26，编码281个氨基酸，广泛表达于多种正常组织、细胞表面^[2]。TRAIL通过与肿瘤细胞表面的死亡受体(Death receptor)DR4和DR5特异性结合后才能发挥作用，而大多数正常细胞缺乏死亡受体，且细胞表面含有诱骗受体(Decoy receptor)DcR1和DcR2逃逸TRAIL对自身的凋亡作用^{[3, 4]}。可溶性TRAIL蛋白(soluble TRAIL,sTRAIL)为TRAIL蛋白114位到281位氨基酸残基，依然具有活性，能与特异受体结合，且可溶性大大提高^[5]。利用这种特点，为TRAIL抗肿瘤的临床治疗提供了新思路。由于原核细胞表达外源蛋白具有周期短、成本低、产量高的优点，是不可或缺的研究外源蛋白功能和活性的方法。本研究通过构建人sTRAIL基因原核表达载体，优化表达条件，得到高活性的可溶性sTRAIL蛋白，并测定了其相关抗肿瘤活性。

pET28a载体，大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)，人早幼粒白血病细胞(HL-60)、人子宫颈癌细胞(HeLa)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人肝癌细胞(Hep-3B)、人结肠癌细胞(HCT-116)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人大细胞肺癌细胞(H460)，均由本实验室保存。EcoRⅠ、XhoⅠ等限制性内切酶，T4连接酶，DNA Marker，蛋白Marker等购自TaKaRa公司。质粒提取试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，PCR产物纯化试剂盒均购自北京博大泰克生物技术有限公司。TRIzol试剂，RevertAid反转录试剂盒(#1622)购自Thermo公司，DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程材料有限公司，注射用卡那霉素(Kan)、青霉素钠、硫酸链霉素和胰蛋白酶购自上海生工生物工程有限公司，MTT试剂盒购自Invitrogen公司，二甲基亚砜购自Sigma公司，NovoCyte流式细胞检测系统(ACEA Biosciences，美国)；其余为国产分析纯。

在含有体积分数为10% 胎牛血清的DMEM培养液中培养HL-60细胞，37℃，体积分数为5% CO₂条件下培养。收集到足够细胞后，TRIzol一步法提取HL-60细胞总RNA。根据GenBank提供的人TRAIL基因序列(GenBank accession U37518)设计扩增人TRAIL序列114~281位氨基酸的特异性引物，其中上游引物P1为5′-CCGGAATTCGTGAGAGAAAGAGGTCCTC-3′，划线处为EcoRⅠ酶切位点，下游引物P2为5′-CCGCTCGAGGCCAACTAAAAAGGCC-3′，划线处为XhoⅠ酶切位点。取5μl总RNA，按照RevertAid反转录试剂盒的说明进行操作，以所获cDNA为模板，PCR反应条件为：94℃预变性5 min后，按94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s的顺序循环30次，再于72℃延伸10 min。取产物5μl在含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。

由EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切sTrail基因扩增产物并纯化回收，与双酶切后的pET28a载体通过T4连接酶连接，以构建成为诱导型表达载体pET28a-sTrail。连接产物热转入大肠杆菌DH5α，在含Kan 30 mg/L的LB固体平板上进行筛选，提取转化子中质粒进行酶切鉴定，将阳性重组质粒送上海铂尚生物技术有限公司测序以进一步验证。

将大肠杆菌BL21(DE3)菌种保藏液接种于LB液体培养基中，37℃、220r/min培养12 h活化，按1%接种量转接，培养2~2.5 h至OD₆₀₀为0.4~0.6，冰浴10 min，用预冷的无菌双蒸水洗涤2次，30μl水重悬菌体，加入10 μl重组质粒，混匀转入电转杯，1 250 V电击，37℃复苏1h，用含Kan 30 mg/L的LB平板进行筛选，挑取转化子进行PCR鉴定，质粒酶切鉴定。

重组工程菌株大肠杆菌BL21(pET28a-sTrail)接种LB液体培养基，37℃、220 r/min培养12 h，按照1%接种量转接，培养2~2.5 h至OD₆₀₀为0.4~0.6，加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，16℃、120 r/min，诱导培养720 min。表达产物通过SDS-PAGE和LC-MS检测。

大肠杆菌BL21(pET28a-sTrail)经诱导培养后，收集菌体，用无菌水清洗2次，加结合缓冲液混匀，超声破碎，4℃、13 000 r/min离心20 min取上清，经镍离子柱纯化蛋白，用结合缓冲液平衡和20mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱杂蛋白，用250 mmol/L、500 mmol/L咪唑洗脱缓冲液将目标蛋白从镍离子柱上洗脱，收集到的目标蛋白洗脱液透析除盐，经真空冷冻干燥机浓缩，并用Bradford法测定纯化的sTRAIL蛋白含量。

在96孔板中接种人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，人子宫颈癌细胞(HeLa)、人肝癌细胞(Hep-3B)、人结肠癌细胞(HCT-116)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人大细胞肺癌细胞(H460)，每孔1×10³ cells/90 μl，置于5% CO₂ 培养箱中，37℃培养，待细胞贴壁后分别加sTRAIL蛋白使细胞培养基中sTRAIL蛋白浓度分别达到300、600、900、1 200 ng/ml，向其中加入等量的无菌双纯水作为对照组。继续培养48 h，通过观察肿瘤细胞形态推测sTRAIL对肿瘤细胞的抑制作用，采用MTT法检测该蛋白对各肿瘤细胞的生长抑制率，采用流式细胞术检测该蛋白对人肝癌细胞(Hep-3B)的影响。

取5μl RT-PCR产物于质量浓度为1%的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶扫描仪下观察，可见清晰条带，片段大小约为522 bp，与预期DNA大小一致(图 1)。

图 1 sTrail基因的RT-PCR结果检测 Fig. 1 Electrophoretogram of the sTrail gene amplified by RT-PCR M： DL2000 Marker；1：RT-PCR product

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在含Kan 30 mg/L的LB固体培养基上挑取转化子，经LB培养液(含Kan 30 mg/L)培养12h后，对其质粒进行提取，以限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳显示在500 bp大小附近有条带(图 2)，测序结果表明，该DNA片段大小为504 bp，与GenBank中数据一致。表明已成功构建表达载体pET28a-sTrail。

图 2 pET28a-sTrail质粒的双酶切鉴定 Fig. 2 Identification of plasmid pET28a-sTrail by double digestion M：DL10 000 DNA Marker；1~3：Plasmid pET28a-sTrail digested by EcoRⅠand XhoⅠ

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经过IPTG诱导的重组工程菌大肠杆菌BL21(pET28a-sTrail)经超声破碎后，取上清蛋白经SDS-PAGE检测，在25kDa附近处有明显蛋白条带，而对照组则没有检测到该大小条带，与预测实验结果相符合(图 3)。经LTQ XL液质联用质谱仪鉴定，采用Sequester搜索引擎搜库，搜索数据库为从NCBI下载Homo sapiens所有种类的蛋白。结果显示该蛋白为sTRAIL蛋白(图 4，表 1)。

图 3 sTRAIL蛋白表达的SDS-PAGE检测 (箭头处为目的蛋白) Fig. 3 SDS-PAGE analyzing the expression of sTRAIL after inducing M：Premixed Protein Marker (Low)；1：The supernatant proteins of E. coli BL21(pET28a-sTrail) induced by IPTG；2：The supernatant proteins of E. coli BL21(pET28a) induced by IPTG

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图 4 sTRAIL蛋白DAEYGLYSIYQGGIFELK的肽指纹图谱 Fig. 4 MS/MS spectrum of double charged peptide DAEYGLYSIYQGGIFELK from sTRAIL

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将经过IPTG诱导的重组工程菌大肠杆菌BL21(pET28a-sTrail)经超声破碎后的离心上清过镍离子柱，使用梯度咪唑洗脱液洗脱杂蛋白和目的蛋白，不同咪唑浓度洗脱液SDS-PAGE检测(图 5)，从图 5中可以看出，蛋白纯度较高，将含有较纯sTRAIL蛋白的咪唑洗脱缓冲液进行透析、浓缩后，使用Bradford法测定，重组工程菌大肠杆菌BL21(pET28a-sTrail)低温16℃诱导培养12h后，sTRAIL蛋白的表达量为1.8 mg/L。

图 5 sTRAIL蛋白过镍离子柱的梯度咪唑洗脱液SDS-PAGE检测 Fig. 5 SDS-PAGE analyzing the gradient imidazole eluent from nickel ion column M：Premixed Protein Marker (Low)；1~5：The sample washed by 50mmol/L, 100mmol/L, 250mmol/L, 500mmol/L, 500mmol/L Imidazole eluent

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通过使用终浓度为300、600、900、1 200 ng/ml的sTRAIL蛋白作用的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人子宫颈癌细胞(HeLa)、人肝癌细胞(Hep-3B)、人结肠癌细胞(HCT-116)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人大细胞肺癌细胞(H460)48h后，与未加蛋白的对照组比较，HeLa细胞、HCT-116细胞、MDA-MB-231细胞、H460细胞和Hep-3B细胞生长受到不同程度的抑制，并且抑制作用呈现浓度依赖性，而HUVEC细胞的生长无明显抑制(图 6)。使用1 200 ng/ml 的sTRAIL处理48h后，对HeLa细胞、HCT-116细胞、MDA-MB-231细胞、H460细胞和Hep-3B细胞的抑制率分别为27.2%、22.5%、32.9%、10.8%和29.7%。而对HUVEC细胞则没有抑制活性。在倒置显微镜下对HUVEC细胞、HeLa细胞、HCT-116细胞、MDA-MB-231细胞、H460细胞和Hep-3B细胞进行观察，可以明显观察到随着sTRAIL蛋白浓度的增加，HeLa细胞、HCT-116细胞、MDA-MB-231细胞和Hep-3B细胞中有越来越多的细胞从不规则的形态转变为圆型，并且细胞折光率发生变化。sTRAIL蛋白对H460细胞作用效果较弱，对HUVEC细胞则没有作用(图 7)。通过流式细胞术分析sTRAIL蛋白处理人肝癌细胞(Hep-3B)72h后对其细胞凋亡的影响，发现随着sTRAIL蛋白浓度的上升，处于凋亡晚期(M3期)的细胞比例上升，呈现浓度依赖(图 8)。表明sTRAIL蛋白可使Hep-3B细胞发生凋亡。

图 6 sTRAIL蛋白对HUVEC、HeLa、HCT-116、MDA-MB-231、H460、Hep-3B细胞作用48h后的细胞抑制率 Fig. 6 Cell inhibition of HUVEC cells, HeLa cells, HCT-116 cells, MDA-MB-231 cells, H460 cells and Hep-3B cells when treated with different concentration of sTRAIL for 48h

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图 7 sTRAIL对HUVEC、H460、Hep-3B、HCT-116、MDA-MB-231和HeLa细胞形态的影响 Fig. 7 Morphological changes of HUVEC cells, H460 cells, Hep-3B cells, HCT-116 cells, MDA-MB-231 cells and HeLa cells after been treated by sTRAIL

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图 8 sTRAIL蛋白处理人肝癌细胞(Hep-3B)72h后的晚期凋亡百分比 Fig. 8 Late apoptotic percentage of Hep-3B cells after been treated by sTRAIL (a)CK (b)Treated by 300ng/ml sTRAIL (c)Treated by 600ng/ml sTRAIL (d)Treated by 900ng/ml sTRAIL (e)Treated by 1 200ng/ml sTRAIL

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从TNF家族中发现的TRAIL蛋白，继承了TNF家族一贯具有的广谱抗肿瘤活性，可以通过与细胞表面的特异性受体结合而体现其诱导肿瘤细胞凋亡的作用，并且其诱导效应不依赖肿瘤细胞的p53基因状态^[6]，因此一直是抗肿瘤研究方向的热点。与TNF家族的其他抗肿瘤细胞因子比较，TRAIL具有更强的诱导凋亡能力，而对正常细胞影响较小，且避免了FasL导致的肝细胞损害和TNF-α带来的严重炎症反应^[7]。已有研究结果表明，TRAIL蛋白的研究已经进入临床阶段，显示了良好的抗肿瘤活性^[8]。

本研究表达载体选用具有遗传背景清楚、表达量较高，利于发酵制备物的提取、纯化、控制等优点的大肠杆菌BL21(DE3)，其特性适合表达组氨酸标签融合蛋白^[9]。通过优化了蛋白诱导条件，发现在16℃，120 r/min，IPTG浓度为0.1 mmol/L条件下诱导720 min，sTRAIL蛋白可溶性表达量最高。利用组氨酸标签与Ni离子柱结合的特点，使用Ni-IDA柱的金属螯合层析来分离纯化带有组氨酸标签的蛋白^[10]。本研究发现只有在sTRAIL两端同时加上组氨酸标签后才可以成功挂载在Ni-IDA柱上，而只在sTRAIL的N端或者C端连接单个组氨酸标签则无法分离目的蛋白。通过使用SDS-PAGE和LC-MS检测，证实成功纯化到sTRAIL蛋白。

本研究使用MTT法检测sTRAIL对人脐静脉内皮细胞株HUVEC、人子宫颈癌细胞株HeLa、人结肠癌细胞株HCT-116、人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、人大细胞肺癌细胞株H460和人肝癌细胞株Hep-3B的生物活性。结果显示，在很低的sTRAIL蛋白浓度下，对HeLa细胞、HCT-116细胞、MDA-MB-231细胞、H460细胞和Hep-3B细胞有良好的抑制活性，分别为27.2%、22.5%、32.9%、10.8%和29.7%，且存在计量依赖，而对正常的HUVEC细胞没有细胞毒性。与其他抗肿瘤蛋白比较，sTRAIL蛋白的抗肿瘤活性具有明显的优势。小麦胚芽抗肿瘤活性蛋白在250 μg/ml浓度下作用人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)48 h，抑制率不到40%^[11]。天花粉蛋白在浓度为120 μg/ml浓度下作用人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)48 h，抑制率在25%~30%^[12]。而sTRAIL在与上述蛋白比较后发现，在浓度低于两个数量级情况下，能达到相近的抑制活性，可见sTRAIL具有很好的抗肿瘤活性。

通过流式细胞术检测到sTRAIL对人肝癌细胞株Hep-3B细胞有诱导凋亡的效果，推测其对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231等其它肿瘤也有类似的效果，但其更深层次的凋亡信号传递途径，对肿瘤细胞和正常细胞的毒性、毒理机制等，还需进一步研究和揭示。并且尝试sTRAIL同化学药物联用，将有望开发成为一种很有前景的抗肿瘤药物。