当今，化石燃料消耗占据全球能源消耗的80%。使用化石燃料所导致的环境污染、温室效应等威胁人类生存与健康的问题愈发受到重视；同时，出于能源安全的考虑，国家迫切需要转变能源结构以降低对进口原油的依赖，所以寻找新型清洁可再生能源成为当前能源领域研究的重点。生物质能被公认为是最有发展前景、在未来能源结构中将占据重要地位的新型能源，它是以生物为载体将太阳能以化学能形式储存的一种能源，因其直接或间接来源于植物的光合作用，因此是一种可再生能源。

生物柴油是以大豆和油菜籽等油料作物、油棕和黄连木等油料林木果实、工程微藻等油料水生植物，以及动物油脂、废餐饮油等为原料，通过酯交换反应而制成的脂肪酸酯含氧液体燃料。生物柴油是一种无毒、对环境无害、可生物降解的可再生能源，被认为是理想的可替代石化柴油的适用于柴油动力机的生物质能^{[1, 2]}。

微藻生物柴油有很大的发展前景，具有其他生物柴油不可比拟的优势，小球藻是目前研究较深入、非常有吸引力的用于生产生物柴油的微藻藻种，是优质的生物柴油原料。

以动物油脂、废餐饮油和油料作物为原料的生物柴油已经实现商业化。但生物柴油的原料会因有限的耕地面积受到限制，油料质物与粮食作物竞争，危及粮食安全，推动全球粮食价格的上涨，而且生物柴油的生产量远远无法满足当前交通运输业对能源的需求^[3]。因此，探索其他潜在的生物柴油原料不可避免，微藻被认为是目前可用于柴油动力机的具有发展前景的生物柴油原料。

微藻具备将太阳能和CO₂转变为可利用油脂的能力。微藻生物柴油与其他生物柴油相比具有以下优势。①单位面积微藻油脂产出效率明显高于其他植物油料作物^[4]，Chisti^[3]报道微藻生物柴油是非常有希望满足交通运输业能源需求的可再生能源，Balat M和Balat H^[5]报道，与同等量的以油菜子或大豆为原料的生物柴油相比，微藻生物柴油所需的土地资源是前者的1/132~1/49。②微藻生物柴油是可再生、可降低温室效应、对环境友好的生物质能，基本无毒、不含硫类、可生物降解，提取油脂后的微藻副产品可作为土壤肥料或用于乙醇提取^[6]。③微藻不是人类可食用的食品，同时微藻生长速率快、容易培养，所需的环境条件对基于土地资源的农业基本无影响，其大规模的培养不会对人类食物供应链产生重大影响^{[7, 8]}。④生物柴油的品质取决于脂肪酯的特性和结构，如链长度、支链、不饱和度，评价指标有十六烷值、燃烧值、黏度系数、排放物等。微藻生物柴油含有较高的十六烷值，满足欧盟EU14214标准^[9]。Haik等^[10]研究微藻生物柴油对柴油动力机的燃烧质量、气缸压力和热值释放的影响，结果显示微藻生物柴油品质类似于石化柴油，成功用于单缸Ricardo动力机。

小球藻是一种单细胞微藻，细胞呈球形或椭球形，直径为2~10μm，以似亲孢子方式进行无性繁殖，生长速率快、光合效率高、分布广泛，主要生长于土壤、潮湿的岩石表面及淡水中，对环境的适应能力较强，易于大规模培养。

选取高品质的油藻藻株，对于小球藻规模化培养、实现生物柴油商业化生产至关重要，产油小球藻的藻株选择应该综合考虑含油量、生长速率、对胁迫条件的可接受性、油脂的提取难度及对生态环境可能的危害性等多方面因素。

生物柴油的油脂由不含脂肪酸(FA)的单脂和含脂肪酸的复脂组成，复脂进一步分为极性脂质(如磷脂和糖脂)和非极性脂质(如甘油三酯和胆固醇)^[11]。作为生产生物柴油的原料，脂肪酸与甲醇进行酯交换反应生成脂肪酸甲酯，然而，并非所有的脂肪酸都适用于生产生物柴油。甘油三酯(TAG)因有更高的脂肪酸含量、无磷酸盐而比磷脂和糖脂更适用于生物柴油的生产，同时，多不饱和脂肪酸(PUFA)稳定性低不宜作为生物柴油的原料^{[12, 13, 14]}。因此，在小球藻生物柴油研究中不仅要考虑油脂产出效率，而且要看油脂所含的脂肪酸成分，甘油三酯含量高和以C₁₆~C₁₈系脂肪酸为主的藻株成为研究的重点^[14]。

梅帅等^[15]通过生物柴油脂肪酸甲酯的组成、黏度、碘值、十六烷值、冷滤点等指标比较了3种不同小球藻生物柴油品质，进而快速筛选藻株，得到了适合生产生物柴油的藻株。另外，“工程微藻”也是藻株筛选的研究热点，Song等^[16]利用基因工程改造藻株，提高了微藻的光合效率、油脂含量、微藻的环境适应能力和自裂解释放油脂的能力。

小球藻的培养方式分为自养、异养、混合培养。一般来说，在光照的情况下可以利用CO₂进行自养培养，在无光的情况下可以利用培养基中有机物作为能源与碳源进行异养培养。异养培养不仅突破了小球藻自养需要光源的限制，而且可以利用有机碳源，特别是低价值糖类物质，在微生物发酵罐内以较高的细胞密度培养小球藻以生产高附加值代谢产物。与自养培养方式相比，相同条件下异养培养的小球藻胞内油脂合成能力增强，有利于提取油脂转化为生物柴油^[17]。然而，异养培养方式会显著增加整个生物柴油生产周期内的运行成本和资金成本。混合培养是结合CO₂和有机物并给予光照的培养方式，在尽可能降低成本的前提下获取更高的效益，是现实情况下适用于微藻规模化培养的方式。混合培养一方面可以利用低成本的CO₂在阳光下进行光合作用，另一方面可以在夜晚无光照的情况下利用有机碳源进行代谢防止细胞生长率的下降。Garcia等^[18]研究表明，在混合培养条件下，光照和有机碳源的协同效应可以诱导更高的生长效率和油脂产出率。Wan等^[19]报道，混合培养条件下小球藻的生长速率是自养条件下小球藻生长速率的4.2倍，Liang等^[20]报道，混合培养条件下小球藻的生长速率和油脂产出率比自养和异养都要高。

适合的培养条件是获取较高小球藻生物量和油脂含量必不可少的条件，适宜的生长环境会刺激磷脂和糖脂的合成以满足生长需要，而压力环境会触发小球藻转变油脂代谢方式转而合成甘油三酯积累油脂。

氮限制成本低、可操作性强。可以显著影响油脂含量，是当前研究的用于增强小球藻油脂含量的最常用方法^[21]。然而，尽管氮限制可以增强油脂含量，却同时抑制了小球藻的生长速率，因此可能并不能在总体上提高小球藻油脂产出。Breuer等^[22]采用两步分阶段方法培养小球藻，第一步在氮充分的环境下培养小球藻尽快获得最大的细胞密度，第二步将小球藻转移至氮缺乏的环境中继续培养诱导其积累油脂，发现总的脂肪酸和甘油三酯的含量都大大增加，而转移至氮缺乏的环境后小球藻仍能继续生长。Belotti等^[23]报道，氮、磷联合限制培养获得了比单独氮限制培养更高的油脂产出，并且其油脂成分主要为非极性油脂，适用于生产生物柴油。

碳元素约占小球藻干重的48%，CO₂通气量可以显著影响小球藻油脂的含量和组成。Xia等^[24]报道，小球藻藻株CS-01可以利用5%~15% CO₂的模拟烟道气作为碳源在光反应发生器中培养，10% CO₂的烟道气培养的小球藻可以获得最大的生物量和油脂产出，继续提高CO₂通气量可以促进油脂含量增加，但会抑制小球藻的生长速率。

此外，温度、pH、光照及重金属离子浓度等因素也会影响小球藻生长和油脂积累。

小球藻油脂含量快速准确的测定是生产生物柴油必不可少的过程，常用的用于油脂提取的方法有Bligh-Dyer法、索氏提取法等^[25]，但存在着溶剂有毒性、污染环境、提取时间长等问题，溶剂不能有效地回收也是阻碍小球藻油脂提取工艺商业化的重要方面。一些研究机构报道了应用超临界CO₂萃取技术提取小球藻油脂，选用低毒性溶剂、离子液体取代有毒性的有机溶剂，具有灵敏度高、热稳定性好、安全、快速、不易挥发、防止产物氧化的优势，适用于链长差别较大的脂肪酸分离^{[26, 27, 28]}，但该方法需要采用专门的仪器设备，成本较高而提取效率较低。

为减少提取时间与降低成本、提高油脂提取效率，通常在油脂提取之前对小球藻进行预处理，预处理工艺有高压匀浆、微波、超声处理等，具有低成本、对环境无污染、适合大规模推广等优势。超声处理技术应用高强度的超声可以物理性地破除微藻细胞壁，可以有效的增加油脂提取效率^[29]。Lee等^[30]联合高压匀浆、微波两种预处理工艺结合油脂提取方法获得了超过单独一种预处理工艺3倍的油脂含量。

离子液体是一种由有机阳离子和无机阴离子相互结合而成，在室温或低温下呈液态的盐类化合物。Kim等^[31]采用离子液体(BMIM)MeSO₄成功地从小球藻提取出油脂，获取的油脂量远远高于索氏提取法、Bligh-Dyer法获取的油脂量，获取的油脂脂肪酸结构与采用Bligh-Dyer法获取的油脂脂肪酸结构相似。另外，离子液体(BMIM)MeSO₄结合超声处理获取的油脂量是单独采用离子液体(BMIM)MeSO₄获取油脂量的1.6倍。

提取出来的油脂转变为生物柴油通常采用酯交换工艺，利用油脂和醇类(甲醇)在催化剂催化作用下或超临界条件下反应生成脂肪酸酯，该工艺生产成本低、操作简单，是传统地用于油脂转化的主要方法。从小球藻提取的油脂含有水分和游离脂肪酸，因此应用均相碱性催化剂(如KOH、NaOH)或碱性固体催化剂(如金属氧化物)的酯交换反应，在反应过程中会发生皂化副反应产生肥皂，存在的水也会降低催化剂的活性，进而降低生物柴油的产出效率^[32]。Jothiramalinggam和Wang^[32]研究了采用脂肪酶作为催化剂进行的酯交换反应，发现可以克服上述化学催化剂的缺陷，提高油脂利用率；同时，使用脂肪酶作催化剂的反应条件温和，可以重复使用，进一步降低了反应成本^[33]。Mathimani等^[34]探索比较不同催化剂和酯交换反应条件对小球藻株BDUG91771生物柴油产出效率的影响时发现，均相酸性催化剂比均相碱性催化剂和多相催化剂更适用于小球藻生物柴油的合成，3.5%的H₂SO₄作为催化剂时生物柴油脂肪酸甲酯(FAME)产出效率高达60%。

小球藻油脂提取过程通常是费时、费力、不充分的，而且溶剂萃取的油脂释放速率也会影响合成生物柴油的酯交换反应。为进一步降低规模化培养成本，提高生物柴油产出效率，近年来研究者提出了一种新型的将油脂萃取和酯交换工艺集成为同一个反应阶段的SET方法，该方法将培养获取的小球藻直接用于合成生物柴油，免除了小球藻油脂萃取过程。Patil等^[35]采用SET方法培养绿球藻株CCMP1776，生物柴油转化效率高达85.75%；Wahlen等^[36]采用SET方法培养角毛藻株，生物柴油转化效率高达82%；Tran等^{[37, 38]}采用SET方法培养小球藻株ESP-31，生物柴油转化效率高达97.3%。证实SET方法是一种高效的用于合成微藻生物柴油的方法。

尽管小球藻的油脂产出能力可以通过优化培养条件与培养方式调控，但生物柴油的品质相应的受到生长条件和培育环境的影响。目前，大量的研究聚焦于通过采用特定的生长条件调节油脂代谢从而使油脂产出显著增加，然而作为生物柴油原料的小球藻的油脂品质特性研究却很少^[39]。

生物柴油脂肪酸甲酯(FAME)应包含少于12%的亚麻酸和少于1%的PUFA，以此满足欧盟EU14214标准和美国ASTMD6751标准，确保生物柴油品质满足交通运输的需求。Shekh等^[40]以油料作物来源的生物柴油品质指标十六烷值、抗氧化性、碘值、冷滤点来评价压力环境下以小球藻(C.pyrenoidosa)为来源的生物柴油品质，发现不同压力环境下的油脂中聚不饱和脂肪酸(PUFA)相关2倍，而PUFA是导致油脂品质偏离生物柴油标准的最主要因素，提示在小球藻生产生物柴油研究中要关注油脂品质。

在微藻生物柴油的生产进程中，小球藻培养阶段是成本相对较高的环节，寻求降低小球藻培养成本是研究者一直努力的方向，探索将废水、废气、废活性污泥等用于小球藻培养是当前的研究热点。Ryu等^[41]将市政废水作为培养小球藻的环境，由于废水中含有充足的氮源，在提高小球藻油脂产出的同时可以大大降低小球藻的培养成本，为市政废水的去污处理提供了新路径。Faroog等^[42]使用啤酒厂废水分两步以光合自养-光合异养方式培养小球藻，该方法可以充分利用废水中的无机氮源和有机碳源，提高小球藻的生长速率和油脂产出效率，同时解决了废水培养小球藻的细菌污染问题，适合小球藻的大规模培养。

联合培养是研究者探索的另一个新方向。联合培养可以调节小球藻生长与油脂积累以期获得更高的油脂产出效率。研究发现^{[43, 44, 45]}小球藻-细菌联合培养、小球藻-酵母菌联合培养可以提高小球藻的生物量和油脂产出量,在大规模培养阶段采用光合自养方式培养小球藻时仅仅需要光照和CO₂，可以进一步降低生产成本，具有良好的发展前景。Zhao等^[46]将小球藻U4341和单针藻FXY-10联合培养的发现，与单独培养相比，联合培养大大增加了微藻总体生物量和油脂产出量，提高了微藻油脂产出效率，而且提取出的油脂制备的生物柴油经品质鉴定后发现，评价指标更加贴近国际生物柴油标准，是潜在优良的生物柴油原料来源。

综上所述，微藻被认为是具有广阔发展前景的生物柴油原料，与陆生植物相比，具有更高的光合作用效率，可以更有效地利用二氧化碳；与能源作物相比，具有更快的生长速率和更高的油脂产出效率，节约土地资源，生产生物柴油的成本更低。小球藻是目前研究较深入、非常有吸引力的用于生产生物柴油的微藻藻种，也是目前微藻生物柴油的研究热点。目前，围绕小球藻用于生物柴油生产的一些问题和研究趋势值得关注。首先，小球藻的规模化培养还有很长的道路要走，在提高小球藻油脂产出效率的同时，如何降低小球藻生产成本依然是当前最重要的研究课题。其次，小球藻生产的生物柴油品质鉴定越发受到关注，尽管压力环境下培养小球藻可以获取更高的油脂产出，但获取的油脂中PUFA增多会导致生物柴油品质降低，探索适宜的小球藻培养方法获得品质与数量兼得的高品质油脂是努力的方向。