中国生物工程杂志  2015, Vol. 35 Issue (10): 100-107

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王世伟, 王卿惠, 翟丽萍, 刘军, 郑苗苗, 王芳, 于志丹
WANG Shi-wei, WANG Qing-hui, ZHAI Li-ping, LIU Jun, ZHENG Miao-miao, WANG Fang, YU Zhi-dan
原核微生物腈转化酶研究进展
Applications and Biodiversity of Prokaryotic Microorganisms with Nitrile Converting Enzymes
中国生物工程杂志, 2015, 35(10): 100-107
China Biotechnology, 2015, 35(10): 100-107
http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20151015

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收稿日期: 2015-05-04
修回日期: 2015-05-20
原核微生物腈转化酶研究进展
王世伟 , 王卿惠, 翟丽萍, 刘军, 郑苗苗, 王芳, 于志丹    
齐齐哈尔大学生命科学与农林学院 齐齐哈尔 161006
摘要: 腈类物质的生物转化符合绿色化工的要求,具有重要应用潜力。系统阐述了产腈转化酶微生物多样性和生物转化特点。从菌株的分离、产酶及诱导物的种类;酶作用的底物、获得的产物;基因表达、酶的耐受性以及其应用价值等方面进行了比较全面的综述。
关键词: 绿色化工     腈转化酶     微生物多样性     进展    
Applications and Biodiversity of Prokaryotic Microorganisms with Nitrile Converting Enzymes
WANG Shi-wei , WANG Qing-hui, ZHAI Li-ping, LIU Jun, ZHENG Miao-miao, WANG Fang, YU Zhi-dan    
School of Life Science and Agriculture and Forestry, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China
Abstract: The nitrile converting system can overcome the shortcomings of serious pollutions and unsafe factors of traditional ones, providing new routes for the green chemical engineering and environmental friendly processes. The microbial diversity and biotransformation characteristics of nitrile converting enzymes are presented. NHase gene expression and its tolerance are also discussed.In the near future, an increasing number of novel nitrile converting enzymes will be screened and their potential in the production of useful fine chemicals will be further exploited.
Key words: Green chemistry     Nitrile converting enzymes     Microbial diversity     Advances    

腈转化酶包括腈水解酶(nitrilase,EC.3.5.5 .1 )、腈水合酶(NHase,EC4.2.1.84)和酰胺酶(amidase,EC3.5.1.4)。1964年,Kelly等[1]发现绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)能产酰胺酶。之后徐建妙等在参考文献[2]中报道了Hook和Robinson等首次发现假单胞菌(Pseudomonas)可产腈水解酶。1980年,Asano等[3]发现节杆菌(Arthrobacter)能产生一种新酶——腈水合酶。这3种腈转化酶,能以不同方式降解腈类物,扩展了酶在绿色化工和环境保护领域的应用。

1 腈转化酶在有机腈类物代谢中的作用

在有机腈代谢过程中,氨基酸通常作为起始物。乙醛肟(Aldoxime)为中间代谢产物,可在脱水酶作用下生成有机腈[4]。有机腈以两种途径分解为有机酸(Organic acid)。第一条路径是在腈水解酶的作用下,将腈直接水解为相应的羧酸。第二条途径是腈先通过腈水合酶的作用,变成相应的酰胺,然后在酰胺酶作用下水解为羧酸和氨。腈转化酶在腈代谢中起到了关键的作用。

2 微生物腈转化酶的特点和鉴别 2.1 微生物腈转化酶的组成和特点

在产腈转化酶微生物中,一些只包含腈水解酶——“单一腈水解酶催化系统”[5];另一些不含腈水解酶,如Cantarella等[6]研究的蛾微杆菌Microbacterium imperiale CBS 498-74,包含腈水合酶和酰胺酶——“双酶催化系统”(NHase-amidase system)。还有一些微生物既含腈水解酶,又含腈水合酶和酰胺酶——“三酶催化系统”,如Pratush等[7]使用的菌株Rhodococcus rhodochrous PA 34,最近用PCR分离获得了其突变子4D的NHase编码基因,并成功在大肠杆菌表达。

利用微生物“产酶系统”,有时会遇到比较棘手的问题。例如,为了获得更有价值的酰胺,在生产过程中需要使用酰胺酶和腈水解酶缺陷型菌株进行生物转化。否则,产物中会混杂副产物——羧酸。我们课题组Zhang(张锦丽)等[8]在研究赤红球菌Rhodococcus ruber CGMCC3090时发现:该菌培养48 h后,没有检测到酰胺酶和腈水解酶,推测其细胞内只含有腈水合酶即“单一腈水合酶催化系统”,属于酰胺酶或腈水解酶缺陷菌株。对该腈水合酶产生菌的深入研究将有利于精细化工生产更有价值的酰胺产品。

2.2 微生物腈转化酶系统的分析和确定

微生物腈转化酶的研究,具有重要理论和应用价值。通过实验,可以分析和鉴别微生物存在哪种腈转化酶。例如,通过仔细研究生物转化的底物和产物,可初步确定微生物腈转化酶的种类和活性。在含有单一腈水解酶途径中,产物几乎不变的是羧酸。Martinkova等[9]报道,一些腈水解酶可将腈类底物直接转变成酰胺,但是腈水解酶不能催化酰胺生成羧酸。因此,如果微生物能将腈转化为羧酸,说明细胞内要么只含单一的腈水解酶催化途径;要么就含有腈水合酶(或腈水解酶)和酰胺酶的“双酶”催化系统。如果微生物只能将腈转化为酰胺,那么微生物应该仅含有腈水合酶(或腈水解酶)的“单一”催化系统,不可能存在酰胺酶。另外,通过酶纯化和特征研究也可鉴别微生物腈转化酶种类;使用Southern杂交和PCR方法对腈转化酶相关基因加以克隆,可间接地鉴定微生物腈转化酶组成[10]

3 产腈转化酶原核微生物多样性和应用 3.1 原核微生物产腈转化酶的种类和应用

产腈转化酶原核微生物资源十分丰富,具有明显的多态性。除常见的红球菌属(Rhodococcus)和杆菌属之外,其他许多种属微生物也含腈转化酶。下面首先介绍产腈转化酶微生物多样性和应用,然后着重论述前两个属产腈转化酶的催化特性。

表 1可以看出产腈转化酶微生物具有明显多态性。研究发现不同菌种腈转化酶可分解和利用相同底物。如慢生根瘤菌Bradyrhizobium japonicum USDA 110,Bradyrhizobium elkanii USDA 76以及Bradyrhizobium sp. BTA-1和BGA-12都能将吲哚-3-乙腈转化为3-吲哚乙酰胺[11]。同一菌株也可降解不同底物。有的菌种能转化比较少见的底物,如Zhou等[12]报道了草木樨中华根瘤菌Ensifer meliloti CGMCC 7333能将新烟碱杀虫剂啶虫脒(ACE)转化为氨基甲酰亚胺衍生物(IM-1-2)。

表 1 产腈转化酶原核微生物的多样性 Table 1 Biodiversity of prokaryotic microorganisms with nitrile converting enzymes
菌株产酶情况底物产物
慢生根瘤菌B. japonicum USDA 110 [11]腈水合酶吲哚-3-乙腈3-吲哚乙酰胺
草木樨中华根瘤菌Ensifer meliloti CGMCC 7333 [12]ACE氨基甲酰亚胺衍生物
泛菌属Pantoea ssp.[13]立体腈水合酶苯基甘氨酸腈(R,S )-苯基甘氨酸酰胺
诺卡氏菌Nocardia corallina B-276 [14]
Nocardia sp. 108 [15]
腈水合酶多种腈类物酰胺
敏捷食酸菌Acidovorax facilis 72W [16]腈水合酶脂肪ω二腈乳胺
睾丸酮丛毛单胞菌C.testosteroni 5-MGAM-4D [17]腈水合酶和酰胺酶羧酸
沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris HaA2 [18]立体选择性腈水合酶酰胺
假单胞菌Pseudomonas putida NRRL-18668 [19-20]
Pseudomonas marginals MA32 [21]
Pseudomonas putida MA113 [21]
Pseudomonas putida [22]
腈水合酶和酰胺酶多种腈类物S-酰胺、布洛芬等
嗜热假诺卡氏菌Pseudonocardia thermophila
JCM 3095 [19]
含钴腈水合酶芳香腈(偏爱)酰胺
莫拉菌属Moraxella ssp. [4]外消旋腈水解酶对映体腈对映体烷酸酰胺或羧酸
粘质沙雷菌Serratia marcescens ZJB-09104 [4]嗜热钴型腈水合酶2-氰基吡嗪腈吡嗪酰胺
3.1.1 宽泛底物特异性腈转化酶微生物研究

宽泛底物腈转化酶的研究是获得多种有价值工业产品的关键。曹明乐等[13]发现,泛菌(Pantoea sp.)能产生宽泛底物腈水解酶。这种酶能以乙腈、3-羟基丙腈、4-羟基苯乙腈等多种腈类作为底物,将它们转化为有经济价值的羧酸。Lievano等[14]报道,珊瑚诺卡氏菌Nocardia coralline B-276产生的腈水合酶能将苯甲腈,4-氯苯乙腈,苯乙腈,4-甲氧基苯甲腈,3,4-二甲氧基苯乙腈等多种腈转化为酰胺。该菌全细胞对布洛芬有去消旋化作用。可将布洛芬腈转化为布洛芬酰胺,再转化为布洛芬。通过去消旋化产生(R)-布洛芬,ee值> 99%。Nocardia sp. 108能产生宽泛底物腈水合酶[15]。多种腈类物,如丙烯腈,吲哚乙腈,对氯苯甲腈,对羟基苯乙腈3,4,5-三甲氧基苯腈,对氨基苯腈,烟腈,邻氯苯腈都可作为酶的催化底物。宽泛底物腈转化酶的开发和利用将为绿色化工生产丰富的有价值产品奠定基础,已经成为当今的研究热点。

3.1.2 腈转化酶催化底物的区域选择性优势

区域选择性是腈转化酶催化底物的优势。Acidovorax facilis 72W能降解多种二腈,包括2-甲基戊二腈,2-亚甲基戊二腈,2-乙基琥珀腈,丙二腈,琥珀腈,戊二腈等,其腈水合酶和腈水解酶对二腈的分解具有区域选择性[16]Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D能产生热稳定的区域选择性腈水合酶和酰胺酶。该菌产生的腈水合酶基因在大肠杆菌中表达,酶活力提高3倍[17]。笔者研究R. ruber CGMCC3090菌株产生的新型腈水合酶对二腈具有明显的区域选择性,可以己二腈为底物生产重要的药物中间体5-氰基戊酰胺(5-CVAM),已经获得国家专利。

3.1.3 立体选择性腈转化酶微生物的研究

立体选择性腈转化酶底物和产物耐受性在医药和精细化工中起到了重要的作用。van Pelt等[18]研究发现沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris HaA2;CGA009,苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti 1021和腈基降解菌属嗜碱菌Nitriliruptor alkaliphilus (iso2)等菌株产生钴型腈水合酶都具有立体选择性。Pseudomonas putida NRRL-18668菌株能以(R,S)-2-甲基戊二腈作为唯一氮源。可在脂肪单腈和二腈化合物中生长。其钴型腈水合酶不但具有立体选择性,而且具有极高的产物耐受性。并能以90%的E值(ee)将2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈转化为(S)-酰胺。更重要的是该菌株还可将2-(4-异丁苯基)丙腈和2-(6甲氧基-2-萘)丙腈转化为(S)-酸(布洛芬和萘普生),对该菌腈转化酶的进一步研究势必将在医药工业中发挥重要潜能[19]

3.1.4 氰基耐受型和热稳定性腈转化酶的研究

氰基耐受型腈水合酶,如Pseudomonas marginals MA32和Pseudomonas putida MA113产生的腈水合酶能够耐受体系中较高浓度氰基而不受抑制,从而为 α-羟(氨)基酰胺的工业化合成开辟了崭新途径[20]。Cui等[21]报道,使用睾丸酮丛毛单胞菌Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D 嗜热腈水合酶片段和2个嗜热假诺卡氏菌Pseudonocardia thermophila JCM3095腈水合酶片段替换PpNHase的相应片段,改善恶臭假单胞菌Pseudomonas putida NRRL-18668 腈水合酶(PpNHase) 稳定性。发现杂种腈水合酶稳定性提高3.5倍,并增强了产物耐受性。氰基耐受性腈水合酶拓展了在精细化工产品合成新途径,阐明其耐受机制将促进产品开发的质量和生产能力,改善生产工艺为绿色化工开辟新的利用途径。

3.1.5 微生物产腈转化酶的异源表达研究

研究表明Rhodococcus equi TG328-2铁型腈水合酶(ReNHase) 表达需要与激活子[ReNHase(+Act)]基因共表达。然而,P. putida菌P14K激活子异源表达是困难的。Liu等[22]根据N-末端控制遗传修饰成功表达了P14K。发现该蛋白N-端第2个氨基酸Lys突变成Ala或者截去N-端16个氨基酸序列可以成功表达P14K。Pei等[23, 24]将锰氧化橙单胞菌Aurantimonas manganoxydans腈水合酶基因在大肠杆菌表达获得热稳定性酶。表达无需低温诱导,只需分子伴侣(GroEL/ES,Dnak/J-GrpE)和引发因子就可提高重组酶活性。Kuhn等[25]发现睾丸酮丛毛单胞菌Comamonas testosteroni Ni1铁型腈水合酶α-和β-亚基基因表达无需激活子或伴侣蛋白(GroES/EL)就可获得可溶性蛋白。该酶有2个His残基位于活性位点,活性位点铁Fe(III) 离子暴露于一个开阔溶剂通道底部。推测该结构对金属的整合起重要作用。一些较少见报道的菌株也产腈代谢酶。Zhang等[26]最近报道了可降解新烟碱杀虫剂噻虫啉的贪噬菌Variovorax boronicumulans J1。其腈水合酶基因也成功地在E. coli BL21 (DE3)中表达。了解微生物产腈转化酶的特性,根据不同微生物的产酶特点,将酶不同特性通过基因工程方法进行优化重组,可获得更加优良的工程菌。

3.2 产腈转化酶的杆菌属的研究和利用 3.2.1 产腈转化酶杆菌属微生物

表 2所示,能产腈转化酶的杆菌包括农杆菌(Agrobacterium)、芽孢杆菌(Bacillus)、微杆菌(Microbacterium)、节杆菌(Arthrobacter)、短杆菌(Brevibacterium)、棒杆菌(Corynebacterium)和克雷伯氏杆菌(Klebsiella)等。

表 2 不同杆菌属腈转化酶 Table 2 The biotransformation of different genus Bacillus
菌株产酶底物产物
芽孢杆菌Bacillus pallidus XY4 [27]热稳定性腈水合酶酰胺
Bacillus smithii SC-J05-1 [28]Co型腈水合酶酰胺
农杆菌Agrobacterium radiobacter 8/4 [4] 腈水解酶溴苯腈、碘苯腈、敌草腈3,5-二溴-4-水杨酰胺、
3,5-二碘-4-水杨酰胺、
3,6-二氯苯甲酰胺
微杆菌Microbacterium sp. [4]腈水解酶丙烯腈丙烯酸
节杆菌Arthrobacter sp. [4]
Arthrobacter sp. IPCB-3 [4]
腈水解酶,酰胺酶
腈水合酶
腈或酰胺
羧酸
酰胺
棒杆菌Brevibacterium sp. CH2 [29]腈水解酶和酰胺酶R, S-腈或酰胺芳氧基丙酸
克氏杆菌Klebsiella pneumonia [30]腈水合酶,酰胺酶脂肪腈或酰胺(底物诱导)酰胺或羧酸
3.2.2 杆菌属腈转化酶底物专一性和酶稳定性改良

苍白芽孢杆菌Bacillus pallidus sp.能产生极高的底物专一性和热稳定性腈水合酶,酶或细胞的固定化能改善生产工艺,在绿色化工产业具有潜能。若引入含强启动子的Rhodococcus rhodochrous J1中,可望获得具有新特性(带有高立体、区域选择性,底物和产物的高耐受性)的腈水合酶[27]。采用酶的固定化方法也可以增加酶的催化。Chen等[28]研究发现,连接盐桥区域和类型适当突变可增加酶稳定性。采用RMSF计算确定了Bacillus SC-105-1腈水合酶1V29 和Pseudonocardia thermophila JCM3095热稳定腈水合酶 1UGQ的3个易变热敏感区(在β亚基上A1、A2和A3 区域)。并将稳定盐桥转移到Rhodococcus ruber TH适温腈水合酶-TH中。NHase-TH-A3的β-亚基表达增加、酶活性提高、热稳定性和产物耐受性均有提高。

3.2.3 杆菌属腈转化酶微生物应用

放射土壤杆菌Agrobacterium radiobacter 8/4对除草剂降解快,毒性小,可应用于环境保护[4]Brevibacterium sp. CH2 菌株含有立体选择性的腈水合酶和酰胺酶,可应用于精细化工生产相应的酰胺或羧酸[29]。利用某些杆菌产耐热腈转化酶的特点,可以研究应用于“三废”处理,例如,Klebsiella pneumoniae产生的腈水合酶的最适温度为55℃,而酰胺酶为40℃。显然该菌在高温工业废水处理方面具有一定的应用价值[30]

3.3 产腈转化酶的红球菌属 3.3.1 产腈转化酶红球菌属生物转化

研究发现,腈转化酶微生物大多属于变形菌门(Proteobacteria)微生物。其中红球菌属(Rhodococcus)是最重要的一个类群。红球菌是产腈转化酶的重要微生物资源,研究红球菌产生的腈转化酶有重要的应用价值。如表 3所示,红球菌许多种都有腈代谢酶的能力。

表 3 红球菌属不同菌种产生的腈转化酶 Table 3 The biotransformation of different species of the genus Rhodococcus
R. equi TG328 [35]
菌株产酶底物产物
玫瑰红球菌Rhodococcus rhodochrous BX2 [31] 诱导腈水合酶-酰胺酶组成型的腈水解酶乙腈;反式丁烯腈;丙烯腈;顺式丁烯腈
Rhodococcus rhodochrous M33 [32]腈水合酶丙烯腈 丙烯酰胺
R. rhodochrous PA-34 [33]腈水合酶烟腈;丙烯腈烟酰胺;丙烯
红平红球菌R.erythropolis G20 [4]腈水解酶β-氨基丙腈β-氨基丙酸
R. erythropolisJCM6823,
R. erythropolis JCM2892 [4]
腈水合酶酰胺(5-己内酰胺诱导)
Rhodococcus rhodochrous tg1-A6 [34] 腈水解酶丙烯腈 丙烯酸
马红球菌R. equi A4 [4]立体选择性腈水合酶2-(2-,4-甲氧苯基)-丙腈,2-(4-氯苯基)-丙腈,2-(6-甲氧基萘)-丙腈相应的酰胺类
腈水合酶
酰胺酶(E-值99.4%)
(R,S)-2-苯基丙腈
(S)-2-苯基丙酰胺
(R,S)-2-苯基丙酰胺
S-(+)-2-苯基丙酸
丁烷红球菌R.butanica (ATCC 21197) [36]腈水解酶苯甲腈、苯乙腈或苯环取代物相应的羧酸或酰胺
嗜吡啶红球菌R.pyridinovorans MW3 [37]底物耐受性腈水合酶酰胺
红球菌R. boritolerans CCTCC M
208108 [38]
腈水合酶2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺咪唑啉酮除草剂
3.3.2 玫瑰红球菌生物转化特点

玫瑰红球菌(Rhodococcus rhodochrous)不同菌株[4],如PA-34、J1、M8能产多种腈转化酶。Fang等 [31]发现Rhodococcus rhodochrous BX2能完全降解腈类污染物。降解效率为乙腈>.反式丁烯腈>丙烯腈>顺式丁烯腈。随着降解进行,只积累氨。酰胺和羧酸尽管能短暂存在,但最后完全消失。mRNA表达和酶活性研究表明,降解反应由诱导型腈水合酶/酰胺酶(NHase/amidase)和组成型的腈水解酶(nitrilase)联合完成。Kang等[32]发现,在ilvC启动子控制下,Rhodococcus rhodochrous M33编码腈水合酶nhhBAG基因可在谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum中克隆和表达。将突变引入nhhB基因转录起始区构建了pNBM4突变质粒,重组腈水合酶比野生pNBW33表达水平有所提高。Raj等[33]报道产腈水合酶Rhodococcus rhodochrous PA-34可固定在聚丙烯酰胺凝胶中,3小时内被聚丙烯酰氨包裹的细胞可以完全转化丙烯腈。

3.3.3 其他红球菌生物转化特点

Rhodococcus erythropolis不同菌株(G20、JCM6823、JCM2892)能产生偏爱芳香腈的腈水解酶和腈水合酶[4]Rhodococcus rhodochrous tg1-A6已在大肠杆菌中得到高效表达[34]Rhodococcus equi TG328腈水合酶或酰胺酶均有立体选择性,可用来开发重要的手性物质[35]Rhodococcus butanica (ATCC 21197)能代谢苯甲腈或其苯环上被羟基、甲基、氯、氰基及甲氧基等取代的腈类物。可代谢苯乙腈和其对位被羟基、氯及甲氧基取代腈类物,产物是重要药物中间体[36]Rhodococcus pyridinovorans MW3可产生底物耐受性腈水合酶[37]。Lin等[38]通过高级色度比色法筛选到产腈水合酶Rhodococcus boritolerans CCTCC M 208108,可将除草剂2-氨基-2,3-二甲基丁腈 (ADBN)作为底物转化生产咪唑啉酮2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺(ADBA)。该菌对氰基抗性高达5 mM,对产物(ADBA)具有明显耐受性。

3.3.4 R. ruber CGMCC3090的研究

笔者研究菌株CGMCC3090为产钴型腈水合酶菌株。已确定为赤红球菌(Rhodococcus ruber[39, 40, 41]。经发酵条件优化腈水合酶活力达892.46 U/ml[39]。金属离子能影响腈水合酶活力[40],通过金属离子优化,酶活进一步上升(1 941U/ml)。当底物丙烯腈浓度≤20%时,腈水合酶活性无明显抑制,转化率达100%。表明菌株具有很强的底物耐受性[41]。诱变菌株LUV30-06酶活力提高21.99%[42]。原生质体融合子TQD-58酶活进一步提高到4296.8 U/ml[43]。研究发现该菌株利用己二腈生产5-氰基戊酰胺(5-CVAM)区域选择性几乎高达100%[44]。笔者[45]对该菌腈水合酶进行了纯化,纯化倍数达到17.13,得率高达26.2%。通过计算机模建和底物对接,构建了该酶3D模型[46],发现底物和酶的结合位点空穴高达559,初步揭示腈水合酶宽泛底物特异性反应机制。总之,腈转化酶产生菌具有生物多样性,在绿色化工生物转化、生物修复、环境保护、精细化工、医药(中间体)、农业(如除草剂)等方面具有重要的应用价值[47]

4 展 望

宽泛底物特异性和氰基耐受性菌株的的获得将为工业产品开发奠定基础。酰胺酶缺陷型菌株筛选将为绿色化工带来新发展。酶不稳定性严重阻碍连续生产,是生物转化的瓶颈。解决的关键是从基因工程角度出发,找到基因序列改变对氨基酸序列、肽键的折叠方式以及亚基空间构象的影响,构建酶活性高稳定表达的工程菌株。对高产腈水合酶野生菌也要进行深入细致地研究,包括菌株全部基因组序列和结构特征。随着对微生物腈转化酶结构、催化机理、酶学特性的深入研究,必将为腈转化酶在精细化工、制药行业的发展注入新活力。产生高选择性合成光学活性非天然氨基酸、同手性单氰基羧酸衍生物、高价值手性中间体。并为环境保护(如含腈废水处理)和生物修复找到新方法。

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