毕赤酵母表达系统是美国Research Corporation Technologies公司(Tucson, AZ)申请的专利，近年来，随着高通量基因测序技术的不断发展，以及两种可利用的基因组浏览器(酵母菌属基因组数据库Saccharomyces Genome Database，SGD ^[1]、毕赤酵母Genome Browser^[2])的公开，有多种外源基因在毕赤酵母中成功获得表达，毕赤酵母表达系统逐渐成为表达外源蛋白的主导系统之一^[3]。但是作为新兴的蛋白表达系统，毕赤酵母表达系统仍存在一些缺点，如：筛选药物昂贵、生产过程使用的甲醇易燃等安全隐患、糖基化高甘露糖的存在以及发酵周期较长等。因此，毕赤酵母表达载体的改进，糖基人源化工程(Humanized Glycosylation Engineering)的研究，以及发酵条件优化已成为推进毕赤酵母表达系统成为强有力的外源蛋白表达工具的重要环节。

毕赤酵母中醇氧化酶1基因启动子(PAOX1)是外源基因高效表达的关键因素^[4]，毕赤酵母中的转录因子通过特异的顺势作用元件与启动子相互作用来影响基因的转录和表达。构建PAOX1启动子文库，从中筛选可提高外源基因表达量的新型启动子，以及利用启动子共表达系统均可以显著提高外源蛋白在毕赤酵母菌株中的表达产量和质量。

通过编译PAOX1基因内公认的转录因子结合位点使启动子效率增加，从而提高启动子控制之下的外源基因表达量。研究者^[5] 通过对已知的PAOX1启动子序列中转录因子结合位点的删除和重复，创建启动子文库,并使用绿色荧光蛋白( GFP) 为报告基因来研究启动子文库的特性，结果显示：在抑制，去抑制和诱导条件下的文库表现出至少12种与PAOX1启动子启动基因高表达相关的顺式作用元件，从该文库中筛选出来的新型启动子可以成功启动基因的高表达。熊向华等^[6]以人血清白蛋白(HSA) 作为报告蛋白，通过致错 PCR 构建PAOX1启动子突变体，筛选出毕赤酵母高水平表达菌株，其摇瓶中 HSA 的表达量由 200 mg/L 提高到 335 mg/L。

应用PAOX1和GAP双启动子共表达系统，可显著提高外源蛋白在毕赤酵母中的表达产量，其原理是同时将受PAOX1和GAP启动子序列控制的表达盒整合入毕赤酵母基因组中，产生含有两种启动子的新型毕赤酵母工程菌株，两种启动子在非竞争性机制作用下共同诱导基因的表达^[7]，可使外源基因表达量显著增加。Wu等^[8]将编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因(hGM-CSF)分别克隆进入pPIC9K和pGAPZαA中，将构建成功的pGAPZαA-hGM-CSF转化进入GS115产生重组菌株GS115-G，再将构建成功的pPIC9K-hGM-CSF转化进入GS115-G产生含有共表达系统的重组菌株 GS115-GA，对比只含有一种启动子的GS115-G的表达情况，在GS115-GA中表达的目的基因产量明显高于GS115-G两倍。李红亮等^[9]应用PAOX1 和GAP 启动子共表达体系表达人胰岛素原基因，结果表明，人胰岛素原的表达水平可达1.6 g/L，分别为PAOX1和GAP启动子单独启动基因表达时产量的1.6 和5.3倍，显著提高了人胰岛素原在毕赤酵母中的表达量。

将α交配因子前导序列中部分序列进行突变或剔除，可优化α交配因子信号肽，继而提高外源蛋白在毕赤酵母中的分泌表达效率。Rakestraw等^[10]将来源于酵母菌株BJ5464α基因组DNA中的α交配因子前导序列进行PCR扩增，构建α交配因子信号肽序列文库，再对文库中的序列进行定向突变，根据单链抗体片段在含α信号肽突变序列的毕赤酵母工程菌株中表达量的高低，筛选出了新型α信号肽突变序列MFα1pp，含有MFα1pp信号肽序列的菌株使单链抗体片段的表达量增加了16倍。用与MFα1pp结合的酵母工程菌株生产人IgG1，产量高于先前报道野生型酵母产量的180倍。Lin-Cereghino等^[11]将α交配因子前导序列中第57到70位氨基酸删除，即相当于删除α交配因子信号肽序列中的第三个α螺旋，进一步将辣根过氧化物酶和脂肪酶在含有该种α交配因子信号肽的毕赤酵母中进行小规模发酵，结果显示，这两种蛋白的表达量均增加了至少50%。经过优化的α信号肽可以促进外源蛋白在毕赤酵母中高效分泌，便于蛋白纯化回收等下游工作。

毕赤酵母表达系统常用的筛选标记是营养突变标记(主要是组氨酸)和抗生素标记(主要是博来霉素)，其中，营养突变标记通常是隐性遗传的，当用工业酵母菌株处理时很难找到合适的受体，而抗生素筛选虽然易于操作，但随目的基因整合入酵母中的抗生素标记可能会通过食物转移到人、畜肠道中，从而影响抗生素的治疗效果。因此，通过Cre/loxP系统将选择性标记基因去除在毕赤酵母表达外源蛋白工程中有着举足轻重的作用。

Cre/loxP是由Cre重组酶和两个同向排列的loxP识别位点组成，Cre重组酶是一种来源于噬菌体P1的酪氨酸重组酶，可以催化两个DNA识别位点(即loxP位点)进行特异性重组，是整合酶家族中的一员，由343个氨基酸组成，分子量为38 kDa。loxP位点序列是由两端各为13bp的反向重复序列和中间为8bp的核心序列组成。将选择标记基因两端加入loxP序列，目的基因位于loxP位点之外，Cre 重组酶可以介导两个同向排列的loxP 位点之间DNA 的缺失，所以当含有目的基因的表达载体整合到宿主菌的染色体后，可以通过诱导Cre重组酶来实现选择标记序列的剔除^[12]。

目前国内应用Cre/loxP系统比较广泛的领域是转基因动、植物，这一技术在酵母上的应用为之甚少。Cre/loxP系统于2011年首次在毕赤酵母中得到应用。Pan等^[13]通过融合PCR方法将Cre/突变lox系统、博来霉素抗性标记和同源重组臂拼接在一起，产生基因表达框架(同源区域-lox71-Cre-ZeoR-lox66-同源区域)，这个框架能够通过同源重组的方式整合进入毕赤酵母基因组中，当把这种毕赤酵母菌株转移到含有甲醇的培养基中时，Cre重组酶可瞬时表达，引起lox71位点与 lox66位点特异性重组，导致Cre-ZeoR元件成功从毕赤酵母基因组中删除。傅静^[14]通过构建适用于树干毕赤酵母(S. stipitis)的筛选标记并通过定点突变修饰 Cre/loxP重组系统，实现尿嘧啶营养缺陷基因(URA3)的删除，为S. stipitis的遗传转化研究提供基础工具，并以此为基础为开发外源基因表达体系奠定基础。

以上研究为从事酵母表达工作的学者能够更好地运用Cre/loxP系统解决毕赤酵中抗生素残留问题提供了依据,同时也避免了抗生素筛选标记残留对人、畜身体健康造成的伤害。

以蛋白质为基础的治疗方法正在成为医药工业增长最迅速的一类治疗方法。从第一种治疗性重组蛋白(常规人胰岛素)引入之后，大量的蛋白已证实可用于人类治疗，这些具有治疗功能的蛋白通常为糖蛋白，然而酵母的糖基化修饰与哺乳动物相比存在着许多不同点，其糖基化天然高甘露糖的存在不适合糖蛋白的生产^[15]。因此，对毕赤酵母菌株进行优化，将毕赤酵母设计成为更适合外源蛋白生产的糖基化工程菌株势在必行。

毕赤酵母人源糖基化工程至关重要的四个步骤为：①通过抑制OCH1酶(一种α-1,6糖苷键转移酶)活性来消除内源性高甘露糖；②引入α-1,2糖苷甘露糖苷酶Ⅰ，进行高甘露糖的降解；③引入类似于哺乳动物的唾液酸化复杂聚糖成分；④酵母系统糖基化过程是在内质网中进行的，进一步研究内质网的控制机制也是不可或缺的关键步骤。Hamilton等^[16]首次实现了末端唾液酸化糖蛋白在毕赤酵母中的生产，并且还证明了在全人源化酵母菌株中生产的唾液酸化重组红细胞生成素可以诱导剂量依赖性红细胞生成反应，与重组蛋白的生物激活形式一致。Nett等^[17]运用组合基因库和高通量筛选方法正确定位毕赤酵母糖基化过程中异源甘露糖苷酶和糖转移酶在内质网中的位置，进一步推动了毕赤酵母人源糖基化工程的发展。

目前，对于毕赤酵母发酵过程中生物参数如发酵温度，培养液pH值，甲醇浓度等的控制均有了比较系统的策略^[18]，因此本文主要对发酵过程中如何在生长阶段增加细胞生物量和混合碳源分批流加策略进行概述。

细胞生长阶段的的生长模式和状态对后期表达有着直接的影响，如果在甲醇诱导之前，细胞处于亚健康或者非功能性状态，即使甲醇浓度得到优化，也不会获得大量外源蛋白。因此对细胞生长阶段碳源的添加策略进行优化，是毕赤酵母高密度发酵优化中不可缺少的环节。其中，多波长荧光监测法(MWF)和乙醇在线测量的DO-Stat 甘油流加法是近年来发展起来的细胞生长阶段生物量监测方法。Surribas等^[19]使用MWF法结合化学计量学方法 (PLS-1)在毕赤酵母表达米根霉脂肪酶的过程中监测细胞生物量，发现MWF可以在诱导和非诱导阶段很好地预测生物量。侯国力等^[20]在其测定分析甲醇代谢关键酶基因的转录水平以及酶活后发现甘油流加培养末期乙醇的大量(超过6 g/L)和长期积累(超过4h)不可逆转地抑制醇氧化酶1基因启动子(PAOX1)的启动，PAOX1的启动直接关系到外源蛋白的表达水平，因此在传统DO-Stat 甘油流加策略的基础上建立了改良型甘油流加策略，即乙醇在线测量的DO-Stat 甘油流加策略，结果表明，该策略可以在保证细胞快速生长的同时，将乙醇浓度有效控制在2 g/L 以下的水平。与传统DO-Stat 甘油流加策略比较，乙醇在线测量的DO-Stat 甘油流加策略可以强化猪α干扰素的诱导表达性能、确保其发酵生产的稳定。

总之，多波长荧光监测法(MWF)和乙醇在线测量的DO-Stat 甘油流加法均可很好地对细胞生长阶段的生物量进行监测，确保细胞处于健康状态，为外源基因的大量表达夯实基础。

毕赤酵母在以甲醇为唯一碳源和能源表达外源蛋白时，只依靠甲醇代谢途径提供能量^[21]，如果在这个阶段合理添加额外碳源，与甲醇共混流加就可缓解甲醇作为唯一能源时细胞工作运转所承受的供能压力。额外碳源的添加量要刚好用于菌体的生长且不抑制启动子启动外源基因表达，一般情况下，可选用甘油或者山梨醇作为协同底物，但是甘油价格昂贵，不断发展的柴油行业所生产的粗甘油易被甲醇污染，限制了其在酵母工业的使用，因此山梨醇/甲醇共混流加成为毕赤酵母发酵工程合适且经济的策略。Jungo等^[22]在使用分批补料策略时，以两种不同的速率添加43% 甲醇 和57%的山梨醇，抗生素蛋白的产量增加了1.3倍。Celik等^[23]研究表明，山梨醇浓度为50g/L以下时，不会抑制细胞的生长或者表达，因此在表达的起始阶段，分批添加50 g/L的山梨醇，使重组人体红细胞生成素(rHuEPO)表达产量高出1.8倍。汪慧会等^[24]在甲醇/山梨醇共混流加的诱导条件下表达猪α干扰素，目标蛋白的最高抗病毒活性达到1.8×10⁷ IU/ml，是甲醇单独诱导下最高活性的100 倍以上。本实验室成功构建了表达家蝇幼虫防御素基因(MddⅠ)的毕赤酵母工程菌株GS115/pPIC9K- MddⅠ，在对其进行小量摇瓶发酵表达时，采用甲醇/山梨醇混合流加策略进行诱导，MddⅠ基因表达产量比甲醇单独诱导时有显著提高。

采用山梨醇/甲醇共混流加策略可缓解甲醇为唯一碳源时细胞所承受的压力，以此显著提高外源蛋白在毕赤酵母中的表达产量。

近年来，随着毕赤酵母表达载体、菌株及发酵条件的不断完善，已有大量工业酶、生物制剂以及小分子生物肽在毕赤酵母中成功表达，但是要成为标准的外源蛋白生产工具，毕赤酵母表达系统仍然存在着很大的优化空间，例如“pPp”兼容载体的研发与应用^[25]，表达系统中蛋白水解酶基因序列的敲除^[26]，外源蛋白在内质网中的折叠加工-未折叠蛋白响应途径(UPR)的研究^[27]等。随着对这些问题研究的深入，毕赤酵母表达系统在功能性蛋白的生产、商业型产品的研发等方面必将发挥越来越重要的作用。