日本乙型脑炎(JE)，又称流行性乙型脑炎，简称乙脑，是由乙型脑炎病毒(JEV)引起的以三带库蚊为主要传播媒介的人畜共患的急性传染病。

乙脑现在的流行区域很广泛，涉及亚洲、太平洋西部的24个国家，其中以东亚和东南亚是最流行的区域。乙脑每年发病约67 900例，其中约51 000例发生在0~14岁的儿童，所占比例为75%，中国(不包括台湾)的发病人数约33 900例，占全球发病人数的50%^{[1, 2]}。

我国是乙脑病毒的高发区，除新疆、西藏、青海未报道有乙脑感染外，其余省份均为乙脑疫区，四川省乙脑高发区主要在成都平原及四川东北部，后来遂宁、达州、南充、广安、宜宾和巴中等边远贫困地区也成为乙脑高发区。乙脑主要发生在儿童：90%乙脑发生于15岁以下的儿童，6岁以下的儿童发病率为68.1%，其中发病率最高的是2~4岁的儿童^[3]。乙脑可导致幼龄儿童中枢神经系统病毒的感染和致残^[4]，致死率高达40％，就算幸存的儿童也会留下中枢神经系统后遗症^{[1, 5, 6]}。

乙脑病毒可以通过被感染的蚊子传染给人，病毒最主要的传播媒介是三带库蚊^[7]，蚊子通过吸血感染乙脑病毒，病毒在蚊子体内复制后随着蚊子叮咬其他动物如鸟类、猪等将病毒传播出去。与人感染相关的最重要的宿主是猪。人类一旦被乙脑病毒感染，由于人体内低水平和一过性的病毒血症，人类不能继续感染蚊子最终成为宿主。人乙脑流行高峰比猪的自然感染高峰晚3~4周，所以猪可以把乙脑病毒扩增后通过蚊虫传播给人，引起人乙脑的流行。有研究可以通过检测猪乙脑病毒感染率和感染高峰时段来预计人乙脑流行强度和发病高峰时间^[8]。乙脑的流行强度与气候、地理条件、(蚊虫密度、气温、降雨量)及人群暴露等因素有关，表现出地区性、季节性、周期性等流行病学特征。在温带地区乙脑流行于夏天，在热带地区的雨季是乙脑流行的高峰期^[5]。乙脑在流行区域以儿童感染为主，在新入侵区域因成人和儿童都缺乏保护抗体所以都易感^[9]。因为乙脑严重影响了公共健康，所以世界卫生组织提出到2015年将0~14岁儿童乙脑发病率在流行区降至0.5/100 000。

乙脑病毒属于黄病毒科(Flaviridae)中的黄病毒属(flavivirus)。黄病毒属是一大群具有包膜的单正链RNA病毒。这类病毒通常通过吸血的节肢动物(蚊、蜱、白蛉等)传播。在我国，主要的黄病毒成员有流行性乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒和登革病毒。黄病毒属中的大多数病毒对人是致病的，同属的很多成员有抗体交叉反应。目前所分离的乙脑病毒有4个基因型，我国分离的乙脑病毒Ⅲ型占大多数，只有很少一部分属于Ⅰ型。

乙脑病毒颗粒是圆球形状，病毒基因组是单股正链RNA，外面由一个50nm糖蛋白环绕的呈20面体立体对称的核衣壳包裹着。病毒基因组全长11kb，编码一个含多聚蛋白的开放式阅读框，在病毒蛋白酶以及宿主细胞信号肽酶的共同作用下，病毒基因组编码的多聚蛋白裂解形成3种结构蛋白(分别为：核衣壳蛋白、膜蛋白和囊膜糖蛋白)和7种非结构蛋白(分别为：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。病毒基因组5′端的非编码区有一个促进起始翻译并且保护5′端免受核酸酶或磷酸酶降解的帽子结构m7GpppAmp。病毒基因组的3′末端无Poly(A)尾，是CU_OH，但含一段对RNA病毒复制很重要的保守核苷酸序列。乙脑病毒的结构特点、基因组构成、蛋白合成加工等与黄病毒属的其他病毒高度相似。

核衣壳蛋白(C蛋白)是乙脑病毒的核心蛋白，分子量13.9 kDa，由120个氨基酸组成，其39~54位氨基酸在所属的黄病毒属中具有高度保护性。

囊膜蛋白(M蛋白)的分子量8.3 kDa，由75个氨基酸残基组成，它是由囊膜前体蛋白(PrM蛋白)成熟后去除N端裂解形成。由于M蛋白有高度的疏水性，所以它可插入毒粒的脂质双层中。

囊膜糖蛋白(E蛋白)分子量为53 kDa，由500个氨基酸残基组成，是乙脑病毒的主要结构蛋白之一。E蛋白与病毒颗粒的吸附、穿入、致病等息息相关。

NS1蛋白的分子量为42 kDa，由350个氨基酸残基组成，是病毒的糖基化蛋白，具有可溶性补体结合活性，没有中和活性，也不具备血凝活性。但是它在病毒粒子感染的过程中产生的强抗体反应可以保护宿主细胞不受到乙脑病毒的攻击。

NS2A蛋白的分子量为17 kDa，NS2B蛋白的分子量为13 kDa，它们都是小分子疏水性蛋白，可能与病毒其他蛋白的加工成熟有关。

NS3蛋白的分子量为64 kDa，该蛋白具有亲水性的基团。NS3蛋白还具有依赖于NS2B的蛋白酶和三磷酸核苷酸酶的活性，该活性对乙脑病毒颗粒的复制很重要。

NS4A蛋白的分子质量为28 kDa，NS4B蛋白的分子质量为14 kDa，他们也是小分子疏水蛋白，可能与病毒膜结构有关。

NS5蛋白的分子质量为105 kDa，该蛋白为碱性蛋白，在黄病毒科中是最大的保守蛋白，NS5蛋白所具有的RNA聚合酶和甲基转移酶活性能够确保病毒复制过程的忠实性。

上世纪60年代我国最早开始使用的乙脑疫苗是地鼠肾细胞培养的灭活疫苗。80年代后期我国开始使用乙脑减毒活疫苗。90年代末我国改进了乙脑减毒活疫苗的生产工艺，纯化了减毒活疫苗，降低了不良反应的发生。

鼠脑灭活疫苗是目前得到国际上认可和使用的乙脑疫苗之一，使用的毒株是乙脑Nakayama株。目前在泰国、韩国、斯里兰卡、越南以及马来西亚部分地区已将鼠脑灭活疫苗纳入常规免疫，美国后来也批准上市使用。该疫苗有两种剂型：液体和冻干，其中在4℃保存冻干疫苗可稳定保持一年以上。WHO对此类疫苗在生产技术上制订了严格的要求，对疫苗的免疫原性也制定了标准化的规定，反复提纯后髓磷脂蛋白含量 < 2 ng/ml。鼠脑灭活疫苗相对较安全，免疫功能缺陷的人群也可以接种。此类疫苗的缺点是有较多的脑组织成分，疫苗接种次数多，接种后出现的不良反应如局部敏感、疼痛、红斑、注射部位发生肿胀等约占23％；由于该疫苗的制备工艺复杂，费用较高，其应用范围逐渐缩小。只有在有较大感染风险时孕妇才接种。日本在2006年已停止生产鼠脑灭活疫苗。

本疫苗于1968年在中国生产和使用，使用的毒株是北京P3株。该疫苗对各型乙脑病毒都可产生较强的免疫保护。一般在病毒感染开始流行前1个月对10岁以下儿童和来自非流行区的易感人群进行疫苗接种；主要采用皮下注射2针(每针间隔7～10天)，第二年加强注射1针；预防接种后人群保护率可达90%。但该疫苗由于没有经过纯化和浓缩，所以含杂蛋白较多，且产生抗体的持续时间短、需多次接种，易产生过敏等不良反应。

对乙脑灭活疫苗而言，尽可能提高抗原纯度，在制剂中避免添加不合适的赋形剂、保护剂和防腐剂，制品的安全性有望得到进一步提高。

SA14-14-2株是一株高度减弱、免疫原性良好、遗传稳定性高的毒种，适合用于制备人用减毒活疫苗。1989年成都生物制品研究所用SA14-14-2减毒株接种原代地鼠肾细胞，经培养、收获病毒液，加适量明胶、蔗糖保护剂冻干，成功研制了乙脑减毒活疫苗SAl4-14-2，该疫苗是目前唯一用于人类的乙脑减毒活疫苗。迄今该疫苗在我国已使用超过6亿剂次，其安全性和效果已得到充分证实。接种该疫苗能使机体产生体液免疫和细胞免疫，优于灭活疫苗。接种后在体内增殖相似于自然感染，可激发机体对病原的持久免疫力。而且该疫苗的副作用小，症状轻(只有少数人有局部红肿，偶尔发热和过敏性皮疹)，疫苗价格低 ^[10]。但减毒活疫苗易受到母源抗体的影响从而引起胎内感染。幼龄动物接种疫苗后，在一定程度上阻碍其自身机体的生长，而且减毒活疫苗有毒力恢复的潜在危险，所以孕妇和免疫缺陷者不推荐接种此类疫苗。

2013年国药中生集团成都生物制品研究所有限责任公司的乙脑减毒活疫苗通过了世界卫生组织预认证，这也是全球第一个通过认证的乙脑减毒活疫苗。该公司每年生产的乙脑疫苗在国内使用的约有2 000万剂次，另外向东南亚出口的有几千万剂次。该公司的乙脑减毒活疫苗已在印度、越南、韩国、尼泊尔等11个国家注册销售。中国已将SA14-14-2乙脑减毒活疫苗纳入国家扩大免疫规划。

IC51是一种纯化的、灭活的、自动免疫接种的乙脑疫苗，可激活人体免疫系统防止乙脑病毒感染。在生产过程中采用组织培养，由培养于Vero细胞的SA14-14-2毒株经纯化和甲醛灭活制得，不含明胶稳定剂、抗生素或硫柳汞。接种IC51疫苗后的人体安全性观察共进行了7次，表明IC51疫苗的局部/全身不良反应发生率低，未出现严重的过敏反应。在美国、德国和奥地利对接种IC51疫苗的18岁以上人群进行观察，临床试验显示98%的受试者在接种该疫苗后可达到保护性抗体滴度，机体可持续半年产生免疫应答；83%的受试者在接种该疫苗一年后仍有保护性抗体产生。但IC51疫苗仅限于18岁及以上成人预防乙脑，对1～2岁儿童接种IC51疫苗的免疫性还需要进一步观察。

IC51由澳大利亚Intercell AG 公司研发，目前在美国、澳大利亚、欧洲、加拿大和瑞士获批使用。该疫苗在北美、欧洲等地的销售权由诺华公司获得，疫苗商品名定为IXIARO。在澳大利亚的销售权由CSL Biotherapies公司获得，疫苗商品名定为JESPECT。

在分子生物学技术上发展起来的基因工程疫苗，是近年来用于疾病治疗的一种全新的免疫防治剂。包括：DNA疫苗^[11]、嵌合病毒减毒活疫苗、亚单位疫苗、cDNA疫苗等^[12]。

DNA疫苗在机体内能表达天然的蛋白质抗原、诱导有效的免疫应答、不存在毒力逆转的危险、可以进行联合免疫、也能制成含多种抗原的多价疫苗、还兼具预防和治疗等优点，另外DNA疫苗生产成本较低、稳定性好、贮存便捷，因此很受欢迎。

乙脑病毒的E蛋白含中和抗原表位及特异性抗原表位，该蛋白具有血凝活性，能刺激机体产生中和抗体，保护机体免受病毒的攻击，是乙脑病毒主要的抗原成分。E蛋白的成熟与PrM有关。PrM蛋白是乙脑病毒诱发保护性免疫的重要成分，对病毒颗粒的成熟和释放起重要作用。PrM蛋白在不完全裂解的情况下产生的中和抗体靶子可作为乙脑病毒研究的新领域^[13]。目前乙脑DNA疫苗的研究主要在PrM、E、NS1这3个蛋白编码的基因上。

Pan等将含乙脑病毒E蛋白编码基因的重组质粒通过肌肉注射/基因枪注射免疫小鼠，能使小鼠产生CTL细胞免疫和Th细胞免疫，保护机体免受乙脑病毒的感染。Konishi等使用含乙脑病毒PrM-E基因编码的质粒免疫小鼠，能有效诱导机体产生JEV特异性抗体和CTL的保护性免疫反应。

Ashok将乙脑病毒编码E蛋白的基因与TPA融合后构建成载体，将该载体以DNA形式注射到鼠脑，研究发现机体对乙脑病毒的感染可以产生70％的有效保护率，由此可以推测DNA疫苗可能产生CTL细胞免疫和Th细胞免疫，保护机体免受乙脑病毒的感染。

Feng等将乙脑病毒Beijing-1株的E蛋白编码基因克隆，将表达的质粒注射小鼠后，和乙脑灭活疫苗相比产生同样的中和抗体水平。并且在小鼠脾细胞中发现了乙脑病毒的记忆B细胞和CTL。

Chang等构建了表达融合或不融合的PrM/E蛋白质粒载体，和佐剂一起通过肌肉注射小鼠后发现，表达PrM/E蛋白的质粒DNA能使70%的小鼠获得免疫保护。单独注射E蛋白质粒DNA只能使40%的小鼠抵抗致死性乙脑病毒的攻击。非结构蛋白NS1一般用于构建表达乙脑病毒的非结构蛋白DNA疫苗。动物被NS1蛋白免疫后，产生的免疫反应能有效抵抗病毒的攻击。有研究表明用只表达NS1蛋白的质粒免疫小鼠，能使90%的小鼠免受病毒的袭击。

关于嵌合病毒的研制其主要原理是利用基因工程技术，将稳定的减毒株作为受体株，嵌合进与供体株相应的结构基因，这样得到的嵌合病毒株不但保留了一定的减毒特性，对供体株而言还有免疫性。嵌合病毒疫苗株属于减毒活疫苗，比亚单位疫苗、灭活疫苗和DNA疫苗等更为有效。研制嵌合疫苗必须是在基于熟悉各病原体基因组各部分的基因序列位置及其功能后，才可以实施。所以嵌合病毒减毒活疫苗是未来乙脑基因工程疫苗研究的新领域。常用的乙脑疫苗载体有黄热病毒和痘病毒。黄热病毒17D株活疫苗和乙脑SAl4-14-2株在国内外广泛应用均证明其对人体安全有效。巴斯德公司利用SAl4-14-2毒株的具有免疫保护的核心蛋白PrM和E蛋白基因去替换黄热病毒17D株cDNA的相应基因位置，构成了黄热-乙脑嵌合病毒(ChimeriVaxTM-JE)^[14]，该病毒经过Vero细胞培养制成了乙脑嵌合病毒减毒活疫苗JE-CV。

通过Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床试验，验证了JE-CV具有较好的安全性、免疫原性和耐受水平^{[15, 16]}。至今还没有该疫苗存在安全问题的报道^[17]。2009年7月巴斯德公司已分别向澳大利亚药品管理局和泰国食品药品管理局申请市场授权。目前该疫苗已获得了在美国、澳大利亚和欧洲的应用许可证。

2012年成都生物制品研究所的“乙脑登革3型嵌合病毒的构建与生物学研究”，该项目旨在利用反向遗传学技术，以乙脑减毒活疫苗株SA14-14-2为骨架，用四个血清型登革病毒的主要保护性抗原基因prM-E替换乙脑减毒活疫苗株SA14-14-2的相应区域基因，构建针对我国登革1～4型病毒流行株保护性抗原的乙脑/登革嵌合病毒，并对其基因和生物学特征进行全面检定，筛选出遗传学特性稳定、减毒特征明确、免疫原性高的登革疫苗候选株，建立嵌合病毒种子库，初步探索嵌合病毒生产工艺，为临床研究和疫苗稳定性研究奠定基础。该项目目前进展顺利,并且得到了专家组的高度评价，一致认为其具有较高学术水平和实用价值，创新性突出。

亚单位疫苗是利用微生物的某种表面结构成分(抗原)制成不含有核酸、能诱发机体产生抗体的疫苗，包括：病毒样颗粒和基因工程亚单位疫苗。

(1)病毒样颗粒 细胞感染乙脑病毒后，能在细胞外分泌一种病毒样颗粒(VLPs)形式的衍生物。乙脑病毒的M蛋白和E蛋白组成病毒的VLPs，在病毒感染或者由表达这2种蛋白的真核表达载体转染的细胞培养物中，M蛋白和E蛋白可以装配成多聚体微粒。因为病毒样颗粒是球状无核心的空病毒，不含感染性病毒核酸，不具有红细胞凝集性，VLPs疫苗没有病毒感染的危险，所以它作为免疫原可通过和病毒感染相同的途径传递给免疫细胞，从而诱发机体的免疫系统产生有效的免疫保护反应，防止病毒感染，是一种新型的乙脑疫苗。

Kojima等构建了基于Beijing-1 株的PrM-E蛋白编码基因的真核表达载体J12，通过转染BR13细胞筛选出表达E蛋白的克隆体J12＃26，纯化J12＃26后免疫小鼠，经过7个月后检测小鼠体内仍然保持高滴度的中和抗体。

但是VLPs疫苗在生产上存在一些技术问题；另外，随着VLPs免疫途径的不同产生的免疫效果也会不同。VLPs疫苗产生的机体防护水平由宿主、病毒和疫苗这3个因素共同决定。目前黄病毒科研究较成熟的是登革热病毒样颗粒。随着对VLPs的深入研究，VLPs也有望在将来应用于乙脑疫苗的生产。

(2)基因工程亚单位疫苗 基因工程亚单位疫苗(Subunit vaccine)也称生物合成亚单位疫苗/重组亚单位疫苗，此类疫苗是利用保护性抗原基因在原核/真核细胞中高效表达后以基因产物-蛋白质或多肽的形式制成的疫苗。此类疫苗的优点：安全性高(不含核酸，主要由病原菌的免疫保护成分构成，不会感染动物)，纯度高，经济高效，稳定性好，通常采用大肠杆菌或者酵母菌作为工程细胞。缺点是：与复制性完整病原体比较，此类疫苗的免疫原性差，需要与佐剂联合使用才能产生较好的免疫效果，而且此类疫苗的研究成本和生产费用都很高。目前针对黄病毒科的基因工程亚单位疫苗主要包含E蛋白中的抗原表位。有研究通过表达乙脑病毒的结构蛋白E蛋白或非结构蛋白NS1蛋白制备的基因工程亚单位疫苗，能诱导机体产生有效的免疫应答反应。有报道^[18]将E蛋白利用大肠杆菌表达出融合蛋白TrxD3。该蛋白纯化后与佐剂混合免疫小鼠，能使小鼠产生较高的中和抗体。用乙脑病毒纯化的E蛋白免疫小鼠能诱导机体产生大量中和抗体，而针对乙脑病毒低至1∶20的中和抗体能有效地保护80％以上的小鼠抵抗病毒的攻击。Alka等在大肠杆菌中表达了E蛋白结构域DⅢ与麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白MBP-EDⅢ，同时将DⅢ与His偶联后表达His-EDⅢ。纯化MBP-EDⅢ和His-EDⅢ后，用氢氧化铝协同弗氏佐剂一起直接免疫小鼠后都产生了乙脑病毒的特异性抗体及中和抗体，并且发现His-EDⅢ免疫后的抗体水平较高。可以确保小鼠免受100 pfu乙脑病毒的感染。

应用反向遗传学技术建立的乙脑病毒全长感染性cDNA克隆的方法已在实验研究中^[19]。该技术通过构建乙脑病毒减毒株 SA14-14-2 的全长cDNA克隆，来初步探讨将其作为表达载体的可行性。

黄莺等采取优化措施，利用改造的低拷贝质粒载体pBR-kpn，通过SA14-14-2疫苗株构建了我国乙脑病毒基因组全长cDNA(10 976bp)的克隆，体外转录后转染BHK-21细胞，CPE在第6～7天时成强阳性，然后通过Vero细胞的放大培养，RT-PCR实验和间接免疫荧光实验都验证获得了乙脑病毒颗粒。

目前对乙脑病毒在临床上主要采取抗病毒治疗结合对症治疗和支持治疗为主的方式。防蚊和灭蚊是防控乙脑病毒流行的关键^[20]。人体(特别是流动人口和易感人群)按时接种疫苗可提高自身机体对乙脑病毒感染的抵抗力，这也是预防该病流行的重要环节。

随着对乙脑病毒致病机制及功能研究的逐渐深入，利用基因工程技术表达具有免疫保护效果和重要生物学活性的病毒抗原基因，是研制乙脑基因工程疫苗的重要方法^{[21, 22]}。其中乙脑DNA疫苗及乙脑嵌合减毒活疫苗(ChimeriVax-JE)都有望在未来几年内上市使用。现阶段正在研究的乙脑口服疫苗也可提高机体自身的保护率和降低接种后的不良反应^[23]。