作为一项成熟的、强有力的生物技术手段，PCR在现代分子生物学中具有广泛的应用，如定点突变，不使用连接酶的载体构建、线性DNA片段拼接等^[1]。定点突变(SDM)技术在DNA序列修饰、体外定向进化、蛋白结构与功能研究等方面有着广泛的应用。近三十年来，不断有新的工作改进这一实验技术^{[2, 3, 4, 5, 6, 7, 8]}。目前，最为常用的方法之一是使用QuikChange^®(Agilent Technologie)定点突变试剂盒，将该实验分为三个简单的步骤完成，即基于PCR的突变链合成，模板质粒的DpnI酶切降解和突变质粒的转化。其中突变引物设计需要用户根据目标序列要求自行完成，该公司也提供了在线的引物设计工具 (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp)帮助注册的用户进行突变引物设计。然而，该工具设计的每对引物是完全反向互补的，突变位点位于引物序列的中间区域，造成引物序列较长，因而在PCR退火过程中引物间更倾向于形成二聚体，而不是与模板结合。这一情况在需要进行多个突变时更为严重。该试剂盒的说明书指出，对3个位点同时突变时，成功率只有55%。目前，也有其它设计突变引物的在线工具如PrimerX (http://www.bioinformatics.org/primerx/index.htm)，但采取的是相同的设计策略，同样存在形成引物二聚体的问题。此外，该方法设计的引物容易与模板错配，特别是在一对引物中引入多个突变的情况下，极易造成PCR不成功。

为了提高定点突变的效率，克服引物二聚体的形成非常重要。本工作采用5′端部分重叠(partial overlapping)的策略来设计突变引物，两条引物的3′端分别与模板完全匹配。已有一些报道，如 Zheng等^[9]和Liu等^[10]的工作描述相似的设计思路。然而，他们并没有提供易用化的工具。本工作提供了一个基于网页的在线工具Primers Spanning(http://PS1.biocloud.org.cn/)，可以根据用户的目标序列和拟突变位点自动化地设计定点突变引物。同时，引物的相关参数，如Tm值、GC百分比、序列长度、二级结构等也纳入设计考虑中。可实现的突变类型包括一个或多个碱基的替换、插入和删除。经过我们的实验验证，PS设计的引物具有很高的突变成功率。

拟设计的引物，在5′端部分互补，因此，两条引物分为与模板完全互补的CM区(completely match region)和彼此反向互补的OL区(over lapping region)，如图 1所示,图 1a为突变引物及相对位置示意，图 1b为引物各区段划分及命名，其中CM表示 3′端完配对区；OL表示 5′端重叠区。对于不同突变类型，OL区序列确定方法有所区别(图 2)。Tm值计算在引物设计中具有重要地位。PCR缓冲液中的离子强度对DNA退火温度计算影响很大^{[11, 12]},其中Mg²⁺浓度影响最大^[13].本工作采用Ahsen等^[11]改进过的经验公式，基于nearest-neighbor (N-N)模型^[14]并用 monovalent cation,Mg²⁺,dNTPs 和DMSO的浓度进行了校正:

图 1 引物设计示意 Fig. 1 Schematic diagram for mutation primer designing (a) The relative position of a pair of mutation primers (b) The crosses represent mutation sites CM: 3′-complete matching part; OL: 5′-overlapping part

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图 2 不同突变类型示意图(方框中为OL区) Fig. 2 Primer designing diagram for different types of mutations OL: Overlapping part, indicated by box

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其中，

该公式中，[Monovalent cations]是PCR缓冲液中Na⁺,K⁺ 和Tris⁺ 等一价阳离子的浓度。

关于参数控制，CM区的Tm值在58~68℃(长度约为18~24bp)，保证PCR过程中引物与模板良好匹配；OL区的Tm在45~53℃(长度约为9~14bp)，一方面避免引物二聚体形成，另一方面在PCR结束后两条产物的OL区可以退火形成缺刻的质粒，在模板被DpnI切割后，可以直接转化大肠杆菌。

本工作中用到的引物合成和质粒测序由AuGGT DNA-SYN Biotechnology (Beijing)完成；质粒模板是从大肠杆菌TOP10菌株中扩增提取；KOD Plus高保真扩增酶购于TOYOBO公司(Japan)；DpnI内切酶购于NEB公司(USA)。文中定点突变实验分两步进行，第一步PCR扩增目的质粒，20μl 反应体系中含有10ng模板质粒，0.5U KOD DNA 扩增酶,0.2mmol/L的dNTPs,2μl 10×KOD 反应缓冲液，2mmol/L MgSO4，以及0.25μmol/L由PS设计的突变引物。PCR 反应程序如下： 94℃预变性 2min，之后16到18个扩增循环，94℃ 25s变性,55℃ 25s退火,68℃延伸时间为“N”min，N由模板长度和KOD扩增速度(1kB/min)确定，最后，加68℃后延伸10min。第二步用Dpn1消化质粒模板,反应体系中含有9μl PCR产物和1μl 10×反应缓冲液和 0.5μl DpnI (NEB)。37℃消化1h以上，此产物可以直接转化感受态大肠杆菌细胞。

在PS的主界面(图 3)，用户需要输入原始的DNA序列，并在突变代码(Mutation code)中填写待突变的核苷酸字母和序号。突变代码是拟进行突变的位置和类型的描述，须按照指定规则填写。主页面给出了例子对不同类型的突变代码给出了直观的解释。如“A30”，表示原始序列中的第30位碱基为A。

图 3 Primer Spanner主页用户界面 Fig. 3 Main interface of Primer Spanner

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表 1中有对各种突变代码的详细描述，包括单个碱基突变和连续多碱基突变。在连续多碱基突变的代码中，数字为连续待突变碱基的第一个碱基的序号。对于替换和插入突变，可突变的序列长度，受限于引物的长度，一般不超过50nt。对于删除突变，长度没有特别限制。

表 1 各种不同突变类型及突变代码的表述方式示例¹⁾ Table 1 Examples for each type of mutation code expression and their description

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根据用户输入的原始序列和拟突变位点，可能会初步生成几十甚至几百对可能的引物。因而一个重要的步骤是对初步设计的待选引物进行评估排序，从而给出最好的引物对供用户选择。在本工具中，PS采用了一系列的标准对初选引物打分排序，最终将排名前5对引物在网页中呈现。引物评价标准包括GC百分含量，两条引物CM区Tm值间的差值，引物序列3′端稳定性和特异性，二级结构形成可能性，引物长度等 ，都进行了加权打分。其中二级结构形成可能性，包括序列形成发夹结构的可能性和局部引物二聚体的可能性，这些都会影响扩增效率和突变成功率，因此在打分时，关于二级结构形成可能性,给于较大的权重。

引物得分的计算公式如下：

其中，N1和N2分别为两条引物各自形成发夹结构的最多核苷酸数，M代表引物之间形成二聚体的最多核苷酸数，PolyX代表完全相同的核苷酸数，3′Stability 代表 3′端稳定性(计算3′端5个核苷酸的ΔG)，Tmlow 和Tmhigh 分别为两条引物CM区的Tm值，L1 和 L2 分别为两条引物核苷酸数。

关于引物二聚体形成的不同类型，在评估中也做了考虑，包括同二聚体和异二聚体，以及不同方向形成二聚体的可能性。 设计中考虑的另一个重要影响因子是3′端的稳定性。在本工作中，我们计算了3′端末5个碱基的热动力参数^[15]。最后将以上各项打分加和后对各个引物对排序，给出得分最高的前5对引物，在页面中返回。

为了展示PS设计的突变引物的特征，在表 2中，我们给出了三种类型的突变引物示例，分别为替换、插入和删除。这些引物都已通过实验验证，具有非常高的扩增效率。

表 2 用于替换、删除和插入的突变引物示例²⁾ Table 2 Primer examples designed for substitution, deletion and insertion

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我们应用PS进行了大量突变引物设计和测试实验，达到很高的成功率。下面为两个定点突变实例，待突变的序列为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的ArsC基因，该基因已连入pET-28a (+) 载体，针对Lys₉₇和Arg₉₈设计突变引物，分别将Lys₉₇突变为Glu，Arg₉₈突变为Met，突变引物序列如下(加粗斜体字母标识突变位点)：

K97E_F:5′-ACATGTAGAACGTGAGCATTGGGGTTT-3′

K97E_R:5′-CACGTTCTACATGTGGAGGCGTCATC-3′

R98M_F: 5′-GTAAAAATGGAGCATTGGGGTTTTGATG-3′

R98M_R: 5′-TGCTCCATTTTTACATGTGGAGGCGTC-3′

两对引物均可扩增出相应大小的目的载体片段，如图 4a所示，PCR产物经过DpnI酶切消化后不需要进行胶回收，直接转化大肠杆菌感受态细胞，分别挑取一个单克隆进行测序，结果显示二者均成功突变成目标序列，如图 4b和图 4c所示。

图 4 应用PS设计引物进行定点突变实验验证结果 Fig. 4 The results of site-directed mutagenesis experiments examination using primers designed by PS (a)Primers PCR (b)Lys97 mutation DNA sequencing (c)Arg98 mutation DNA sequencing

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经过测序验证，如图 4所示，图 4a为两对ArsC突变引物的PCR结果图，泳道1是用Lys₉₇突变引物扩增得到的目的DNA电泳图,泳道2是Arg₉₈突变引物扩增得到的目的DNA电泳图，对应的条带大小如泳道M标示；图 4b和图 4c分别为目的DNA经过DpnI酶切消化后转化大肠杆菌感受态细胞，挑取其中一个单克隆的测序结果，所测序列与野生型相同的部分用“/”表示，不同的位置显示相应碱基，测序结果与目标序列一致。

引物在基于PCR的实验技术中起着十分重要的作用。本工作中，我们采用了一种基于Tm计算的策略设计非对称突变引物。在此基础上，我们开发了PS 在线工具，能够自动化地完成突变引物的设计。该工具设计的引物可以高效地完成PCR扩增，并且可以完成替换、插入、删除等不同类型的定点突变。经过实验验证，该工具设计的引物成功率非常高，并且不需要加入特殊酶的处理，简单高效。在未来的工作中，我们将进一步开发并扩展PS的功能及应用，如线性DNA拼接、载体构建等。