中国生物工程杂志  2015, Vol. 35 Issue (10): 53-58

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裴智勇, 侯仙慧, 桂小柯, 陈禹保
PEI Zhi-yong, HOU Xian-hui, GUI Xiao-ke, CHEN Yu-bao
Primer Spanner:一个高效的定点突变PCR引物设计在线工具
Primer Spanner: A Web-based Platform to Design PCR Primers for High Efficient Site-directed Mutagenesis
中国生物工程杂志, 2015, 35(10): 53-58
China Biotechnology, 2015, 35(10): 53-58
http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20151008

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收稿日期: 2015-06-05
修回日期: 2015-07-02
Primer Spanner:一个高效的定点突变PCR引物设计在线工具
裴智勇1,2, 侯仙慧3,4, 桂小柯1, 陈禹保1     
1. 北京市科学技术研究院北京市计算中心 北京 100094;
2. 中国科学院北京基因组研究所 北京 100101;
3. 北京大学北京核磁共振中心 北京 100871;
4. 北京大学化学与分子工程学院 北京 100094
摘要: 基于PCR的实验策略在生物工程研究中具有广泛应用,如定点突变(site-directed mutagenesis, SDM),DNA拼接和载体构建。引物设计是这类实验技术中的关键一环,因其直接影响扩增效率和PCR产物的拼合。在嵌合式引物设计方法(一对突变引物在5'端具有互补序列)的基础上,开发了一个在线工具Primer Spanner (PS),可简单高效获得设计定点突变引物。PS可应用于单碱基或连续多碱基替换、插入、敲除等突变形式。通过大量突变实验与测序验证,结果表明该工具设计的引物进行的定点突变效果良好1)
1) 用户可通过http://PS1.biocloud.org.cn 免费访问PS并实现在线引物设计。
关键词: PCR     定点突变     引物设计     在线工具    
Primer Spanner: A Web-based Platform to Design PCR Primers for High Efficient Site-directed Mutagenesis
PEI Zhi-yong1,2, HOU Xian-hui3,4, GUI Xiao-ke1, CHEN Yu-bao1     
1. Beijing Computing Center, Beijing Academy of Science and Technology, Beijing 100094, China;
2. Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
3. Beijing Nuclear Magnetic Resonance Center, Peking University, Beijing 100871, China;
4. College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking University, Beijing 100871, China
Abstract: PCR-based strategy provides economical and efficient application in site-directed mutagenesis (SDM) and DNA assembling such as PCR based vector construction. In these processes, primers are extremely important as they determing amplification efficiency of the target DNA fragments,also influencing circularization of the new plasmids. So this web-based software Primer Spanner (PS) was developed to design primer pairs with partially complementary 5'-ends, which is a special tool for chimeric primer designing. Primers designed by this tool are applied to substitution, insertion and deletion for single-site or multi-site mutagenesis. The performance of the software had been verified by designed experiment and DNA sequencing. The PS primer designing engine is freely accessible at: http://PS1.biocloud.org.cn.
Key words: PCR     Site-directed mutagenesis (SDM)     Primer design     Web tool    

作为一项成熟的、强有力的生物技术手段,PCR在现代分子生物学中具有广泛的应用,如定点突变,不使用连接酶的载体构建、线性DNA片段拼接等[1]。定点突变(SDM)技术在DNA序列修饰、体外定向进化、蛋白结构与功能研究等方面有着广泛的应用。近三十年来,不断有新的工作改进这一实验技术[2, 3, 4, 5, 6, 7, 8]。目前,最为常用的方法之一是使用QuikChange®(Agilent Technologie)定点突变试剂盒,将该实验分为三个简单的步骤完成,即基于PCR的突变链合成,模板质粒的DpnI酶切降解和突变质粒的转化。其中突变引物设计需要用户根据目标序列要求自行完成,该公司也提供了在线的引物设计工具 (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp)帮助注册的用户进行突变引物设计。然而,该工具设计的每对引物是完全反向互补的,突变位点位于引物序列的中间区域,造成引物序列较长,因而在PCR退火过程中引物间更倾向于形成二聚体,而不是与模板结合。这一情况在需要进行多个突变时更为严重。该试剂盒的说明书指出,对3个位点同时突变时,成功率只有55%。目前,也有其它设计突变引物的在线工具如PrimerX (http://www.bioinformatics.org/primerx/index.htm),但采取的是相同的设计策略,同样存在形成引物二聚体的问题。此外,该方法设计的引物容易与模板错配,特别是在一对引物中引入多个突变的情况下,极易造成PCR不成功。

为了提高定点突变的效率,克服引物二聚体的形成非常重要。本工作采用5′端部分重叠(partial overlapping)的策略来设计突变引物,两条引物的3′端分别与模板完全匹配。已有一些报道,如 Zheng等[9]和Liu等[10]的工作描述相似的设计思路。然而,他们并没有提供易用化的工具。本工作提供了一个基于网页的在线工具Primers Spanning(http://PS1.biocloud.org.cn/),可以根据用户的目标序列和拟突变位点自动化地设计定点突变引物。同时,引物的相关参数,如Tm值、GC百分比、序列长度、二级结构等也纳入设计考虑中。可实现的突变类型包括一个或多个碱基的替换、插入和删除。经过我们的实验验证,PS设计的引物具有很高的突变成功率。

1 材料与方法 1.1 引物设计

拟设计的引物,在5′端部分互补,因此,两条引物分为与模板完全互补的CM区(completely match region)和彼此反向互补的OL区(over lapping region),如图 1所示,图 1a为突变引物及相对位置示意,图 1b为引物各区段划分及命名,其中CM表示 3′端完配对区;OL表示 5′端重叠区。对于不同突变类型,OL区序列确定方法有所区别(图 2)。Tm值计算在引物设计中具有重要地位。PCR缓冲液中的离子强度对DNA退火温度计算影响很大[11, 12],其中Mg2+浓度影响最大[13].本工作采用Ahsen等[11]改进过的经验公式,基于nearest-neighbor (N-N)模型[14]并用 monovalent cation,Mg2+,dNTPs 和DMSO的浓度进行了校正:

图 1 引物设计示意 Fig. 1 Schematic diagram for mutation primer designing (a) The relative position of a pair of mutation primers (b) The crosses represent mutation sites CM: 3′-complete matching part; OL: 5′-overlapping part
图 2 不同突变类型示意图(方框中为OL区) Fig. 2 Primer designing diagram for different types of mutations OL: Overlapping part, indicated by box

其中,

该公式中,[Monovalent cations]是PCR缓冲液中Na+,K+ 和Tris+ 等一价阳离子的浓度。

关于参数控制,CM区的Tm值在58~68℃(长度约为18~24bp),保证PCR过程中引物与模板良好匹配;OL区的Tm在45~53℃(长度约为9~14bp),一方面避免引物二聚体形成,另一方面在PCR结束后两条产物的OL区可以退火形成缺刻的质粒,在模板被DpnI切割后,可以直接转化大肠杆菌。

1.2 实验验证材料及方法

本工作中用到的引物合成和质粒测序由AuGGT DNA-SYN Biotechnology (Beijing)完成;质粒模板是从大肠杆菌TOP10菌株中扩增提取;KOD Plus高保真扩增酶购于TOYOBO公司(Japan);DpnI内切酶购于NEB公司(USA)。文中定点突变实验分两步进行,第一步PCR扩增目的质粒,20μl 反应体系中含有10ng模板质粒,0.5U KOD DNA 扩增酶,0.2mmol/L的dNTPs,2μl 10×KOD 反应缓冲液,2mmol/L MgSO4,以及0.25μmol/L由PS设计的突变引物。PCR 反应程序如下: 94℃预变性 2min,之后16到18个扩增循环,94℃ 25s变性,55℃ 25s退火,68℃延伸时间为“N”min,N由模板长度和KOD扩增速度(1kB/min)确定,最后,加68℃后延伸10min。第二步用Dpn1消化质粒模板,反应体系中含有9μl PCR产物和1μl 10×反应缓冲液和 0.5μl DpnI (NEB)。37℃消化1h以上,此产物可以直接转化感受态大肠杆菌细胞。

2 结 果 2.1 PS用户界面介绍

在PS的主界面(图 3),用户需要输入原始的DNA序列,并在突变代码(Mutation code)中填写待突变的核苷酸字母和序号。突变代码是拟进行突变的位置和类型的描述,须按照指定规则填写。主页面给出了例子对不同类型的突变代码给出了直观的解释。如“A30”,表示原始序列中的第30位碱基为A。

图 3 Primer Spanner主页用户界面 Fig. 3 Main interface of Primer Spanner

表 1中有对各种突变代码的详细描述,包括单个碱基突变和连续多碱基突变。在连续多碱基突变的代码中,数字为连续待突变碱基的第一个碱基的序号。对于替换和插入突变,可突变的序列长度,受限于引物的长度,一般不超过50nt。对于删除突变,长度没有特别限制。

表 1 各种不同突变类型及突变代码的表述方式示例1) Table 1 Examples for each type of mutation code expression and their description
2.2 引物评估

根据用户输入的原始序列和拟突变位点,可能会初步生成几十甚至几百对可能的引物。因而一个重要的步骤是对初步设计的待选引物进行评估排序,从而给出最好的引物对供用户选择。在本工具中,PS采用了一系列的标准对初选引物打分排序,最终将排名前5对引物在网页中呈现。引物评价标准包括GC百分含量,两条引物CM区Tm值间的差值,引物序列3′端稳定性和特异性,二级结构形成可能性,引物长度等 ,都进行了加权打分。其中二级结构形成可能性,包括序列形成发夹结构的可能性和局部引物二聚体的可能性,这些都会影响扩增效率和突变成功率,因此在打分时,关于二级结构形成可能性,给于较大的权重。

引物得分的计算公式如下:

其中,N1和N2分别为两条引物各自形成发夹结构的最多核苷酸数,M代表引物之间形成二聚体的最多核苷酸数,PolyX代表完全相同的核苷酸数,3′Stability 代表 3′端稳定性(计算3′端5个核苷酸的ΔG),Tmlow 和Tmhigh 分别为两条引物CM区的Tm值,L1 和 L2 分别为两条引物核苷酸数。

关于引物二聚体形成的不同类型,在评估中也做了考虑,包括同二聚体和异二聚体,以及不同方向形成二聚体的可能性。 设计中考虑的另一个重要影响因子是3′端的稳定性。在本工作中,我们计算了3′端末5个碱基的热动力参数[15]。最后将以上各项打分加和后对各个引物对排序,给出得分最高的前5对引物,在页面中返回。

2.3 突变引物设计

为了展示PS设计的突变引物的特征,在表 2中,我们给出了三种类型的突变引物示例,分别为替换、插入和删除。这些引物都已通过实验验证,具有非常高的扩增效率。

表 2 用于替换、删除和插入的突变引物示例2) Table 2 Primer examples designed for substitution, deletion and insertion
2.4 定点突变实验验证

我们应用PS进行了大量突变引物设计和测试实验,达到很高的成功率。下面为两个定点突变实例,待突变的序列为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的ArsC基因,该基因已连入pET-28a (+) 载体,针对Lys97和Arg98设计突变引物,分别将Lys97突变为Glu,Arg98突变为Met,突变引物序列如下(加粗斜体字母标识突变位点):

K97E_F:5′-ACATGTAGAACGTGAGCATTGGGGTTT-3′

K97E_R:5′-CACGTTCTACATGTGGAGGCGTCATC-3′

R98M_F: 5′-GTAAAAATGGAGCATTGGGGTTTTGATG-3′

R98M_R: 5′-TGCTCCATTTTTACATGTGGAGGCGTC-3′

两对引物均可扩增出相应大小的目的载体片段,如图 4a所示,PCR产物经过DpnI酶切消化后不需要进行胶回收,直接转化大肠杆菌感受态细胞,分别挑取一个单克隆进行测序,结果显示二者均成功突变成目标序列,如图 4b图 4c所示。

图 4 应用PS设计引物进行定点突变实验验证结果 Fig. 4 The results of site-directed mutagenesis experiments examination using primers designed by PS (a)Primers PCR (b)Lys97 mutation DNA sequencing (c)Arg98 mutation DNA sequencing

经过测序验证,如图 4所示,图 4a为两对ArsC突变引物的PCR结果图,泳道1是用Lys97突变引物扩增得到的目的DNA电泳图,泳道2是Arg98突变引物扩增得到的目的DNA电泳图,对应的条带大小如泳道M标示;图 4b图 4c分别为目的DNA经过DpnI酶切消化后转化大肠杆菌感受态细胞,挑取其中一个单克隆的测序结果,所测序列与野生型相同的部分用“/”表示,不同的位置显示相应碱基,测序结果与目标序列一致。

3 结 论

引物在基于PCR的实验技术中起着十分重要的作用。本工作中,我们采用了一种基于Tm计算的策略设计非对称突变引物。在此基础上,我们开发了PS 在线工具,能够自动化地完成突变引物的设计。该工具设计的引物可以高效地完成PCR扩增,并且可以完成替换、插入、删除等不同类型的定点突变。经过实验验证,该工具设计的引物成功率非常高,并且不需要加入特殊酶的处理,简单高效。在未来的工作中,我们将进一步开发并扩展PS的功能及应用,如线性DNA拼接、载体构建等。

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