中国生物工程杂志  2015, Vol. 35 Issue (10): 13-19

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辛婧, 徐银胜, 张芳, 盛望
XIN Jing, XU Yin-sheng, ZHANG Fang, SHENG Wang
MicroRNA-124对人宫颈癌的抑制作用及机制研究
The Function and Mechanism of MicroRNA-124 in Human Cervical Cancer
中国生物工程杂志, 2015, 35(10): 13-19
China Biotechnology, 2015, 35(10): 13-19
http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20151002

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收稿日期: 2015-04-28
修回日期: 2015-07-08
MicroRNA-124对人宫颈癌的抑制作用及机制研究
辛婧, 徐银胜, 张芳, 盛望     
北京工业大学生物工程与生命科学学院 北京 100124
摘要: 宫颈癌的发病率在女性恶性肿瘤中占第二位。miR-124的表达在宫颈癌组织中显著下调。目前,发现在宫颈癌细胞中高表达miR-124可显著抑制宫颈癌细胞的生长、迁移与侵袭能力。此外,miR-124在宫颈癌细胞中的高表达还可显著抑制Cdcp1 基因的表达。Luciferase实验结果表明Cdcp1 是miR-124的直接下游靶标基因。在转染miR-124的宫颈癌细胞中高表达CDCP1蛋白可抵消由于miR-124引起的肿瘤抑制作用。这对揭示microRNA在宫颈癌发生、发展中的作用机制及基于microRNA的宫颈癌临床治疗具有一定的潜在意义。
关键词: microRNA-124     宫颈癌     CDCP1    
The Function and Mechanism of MicroRNA-124 in Human Cervical Cancer
XIN Jing, XU Yin-sheng, ZHANG Fang, SHENG Wang     
College of life Science and Bio-engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China
Abstract: Cervical cancer is the second most common malignant tumor in women around the world. The expression of miR-124 is significantly down-regulated in cervical cancer. The results showed that exogenous expression of miR-124 could remarkably suppress the proliferation and migration of cervical cancer cells. Luciferase analysis showed that CUB domain containing protein 1 gene (Cdcp1) is a direct down-stream target of miR-124 and restoration of CDCP1 counteracted the tumor suppressive effects of miR-124. The results have a great potential for not only the understanding of the relationship between miRNA and cervical cancer, but also microRNA-based anti-cervical cancer therapy.
Key words: microRNA-124     Cervical cancer     CDCP1    

子宫颈癌(宫颈癌)是最常见妇科肿瘤之一,在女性恶性肿瘤中发病率仅次于乳腺癌居第二位[1, 2]。我国宫颈癌的发病率占世界总发病率的28%[3],高危型乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)的持续感染是宫颈癌的主要危险因素之一

① WHO(2014),Comprehensive Cervical Cancer Control:A Guide to Essential Practice.

MicroRNA(miRNA)是近几年在真核生物中发现的,一类内源性长度为20~25个核苷酸的具有多种调控功能的单链非编码RNA,它们主要通过与mRNA 3′-非编码区(3′-UTR)结合在转录后水平上对基因表达进行调控[4]。通过调节靶基因的表达,miRNA可参与生命过程中一系列重要调控进程,如早期胚胎发育、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞衰老、脂肪代谢等[5, 6]。近年来大量研究表明miRNA的异常表达与宫颈癌的发生、发展及转归密切相关。通过对比正常宫颈组织和宫颈癌组织中miRNA的表达情况,研究人员发现miR-199a、miR-21、miR-93、miR-106a、miR-185和miR-224等miRNA在宫颈癌组织中显著上调[7, 8, 9]。miR-29a、miR-34a、miR-124、miR-126、miR-145、miR-218、miR-424、miR-450 和miR-455等miRNA在宫颈瘤组织中表达明显下调,发挥着抑癌基因的作用[8, 10, 11, 12]

研究发现miR-124的表达在包括宫颈癌在内的多种肿瘤组织中明显降低,如鼻咽癌、胃癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌等癌症[13, 14, 15, 16, 17]。在鼻咽癌的研究中,高表达miRNA-124可以通过抑制Foxq1基因的表达来抑制肿瘤的生长和转移[13]。亦有报道显示miR-124的低表达与结直肠癌的预后息息相关。此外,miR-124 还可以调控Rock1、Myo10和Prrx1等基因的表达[14, 16, 17]。本研究发现,在宫颈癌中,Cdcp1是miR-124的下游靶标基因。miR-124可以通过调控Cdcp1基因的表达来调节子宫颈癌细胞的迁移和生长。

1 材料与方法 1.1 材 料

人宫颈鳞癌细胞系SiHa购自中国科学院细胞库,293细胞来自中国疾病预防控制中心病毒预防控制所。细胞培养试剂、Lipofectamine® 2000转染试剂、杀稻瘟菌素(Blasticidin S HCL)、BLOCK-iTTM Pol II miRRNAi表达载体试剂盒、Ambion® mirVanaTM miRNA分离试剂盒以及TaqMan® MicroRNA Assay均购自Life Technology公司。CCK8细胞增殖试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。人工外基质胶(Matrigel)购自BD公司。miR-124 mimics购自广州锐博生物科技有限公司。Dual-Luciferase®双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司。BCA蛋白定量试剂盒购自天根生化科技有限公司。CDCP1和GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology公司(美国)。

1.2 SiHa细胞的培养与增殖检测

将购得的细胞悬液离心后重悬于5 ml PBS溶液中,使用血球计数板计数后,取1×105个细胞注入含有15 ml预热的DMEM培养基中。该培养事先加入10%FBS和1%青霉素-链霉素双抗溶液。整个操作于无菌超净工作台内进行。然后将细胞培养瓶置于37℃,5% CO2无菌孵育箱内培养,至细胞生长汇合至90%左右传代或冻存。

本研究使用了碧云天公司的Cell Counting Kit-8(CCK8)试剂盒评价过表达miR-124细胞的增殖情况。

1.3 miR-124表达载体的构建

表1合成miR-124前体寡聚核苷酸(oligonucleotide),经退火反应得到双链目的片段。将所得目的片段按照带有EmGFP的 BLOCK-iTTM Pol II miRRNAi表达载体试剂盒要求插入pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR质粒,命名为pcDNA6.2-miR-124载体;同时建立插入片段为乱码序列的对照载体,命名为pcDNA6.2-miR-N.C (插入的乱码序列为5′-UCCACACGAGUCAGAUUAAUCA-3′)。

表 1 miR-124寡聚核苷酸链序列 Table 1 The sequence of miR-124 oligonucleotides
Top链TGCTGTAAGGCACGCGGTGAATGCCGTTTTGGCCA
CTGACTGACGGCATTCAGCGTGCCTTA
Bottom链CCTGTAAGGCACGCTGAATGCCGTCAGTCAGTGGC
CAAAACGGCATTCACCGCGTGCCTTAC

为进一步探索miR-124对Cdcp1基因的作用方式,本研究将Cdcp1基因的开放阅读框区域(open reading frame,ORF)克隆于pcDNATM3.1(+)载体上,构建能够表达CDCP1蛋白的pcDNA3.1/CDCP1重组载体,并与pcDNA6.2-miR-124重组载体共转染SiHa细胞。

1.4 pcDNA6.2-miR-124载体的稳定转染

使用Lipofectamine® 2000试剂转染细胞,每35 mm培养皿转染4 mg 重组载体。重组载体中具有杀稻瘟菌素抗性(Blasticidin),使用经过浓度优化的杀稻瘟菌素(1.5μg/ml)能够筛选出重组载体转染阳性的细胞。转染后可通过荧光显微镜观察GFP绿色荧光的表达情况初步判断重组载体的转染情况,根据荧光强度挑选单克隆细胞培养,以得到纯化的miR-124高表达细胞株SiHa/miR-124。同样,经pcDNA6.2-miR-N.C稳定转染的对照组细胞命名为SiHa/N.CmiR。

1.5 TaqMan® MicroRNA的检测

首先,通过Ambion® mirVanaTM miRNA分离试剂盒提取细胞中的小RNA,使用TaqMan® MicroRNA Assays试剂盒中miR-124特异性反转录引物,将提取的RNA反转录为cDNA,最后以U6基因为内参基因,通过Real-time PCR检测miR-124的表达,并根据2-△△Ct值计算miR-124表达相对提高倍数。

1.6 Transwell实验检测细胞的迁移与侵袭能力

本研究选用8 μm孔径的Transwell小室进行肿瘤细胞迁移和侵袭能力的检测。对于细胞迁移能力检测实验,每个Transwell上室中加入100 μl含1×105个细胞的无血清细胞培养液,下室加入500 μl含10%FBS的DMEM培养基作为诱导物;对于侵袭能力检测实验,使用4℃无血清DMEM培养基将5 mg/ml的Matrigel稀释为1 mg/ml,并分别取60 μl小心涂抹在每个Transwell上室的聚碳酸酯膜上面。调整细胞数量,以每孔3.5×105个细胞接种于Transwell上室,并将下层培养基中血清浓度提高至20%以提高诱导能力。培养24 h后,使用4%多聚甲醛固定细胞,并用0.2%结晶紫溶液染色。染色结束后,将小室浸泡在PBS中并于显微镜下观察,对于每个小室,显微镜下取8个随机视野拍照并计数。

1.7 细胞划痕实验

培养细胞,当细胞生长汇合至90%收集细胞。调整细胞数量,接种于六孔细胞培养板,每孔接种数为3.5×105个。继续培养细胞,直至细胞长满整个平板后,移除培养液。在细胞板中央使用200 μl移液枪枪头垂直于平板划出一条直线,并使用预热37℃的PBS轻轻冲洗掉枪头划线的边缘非贴壁细胞,最后加入预热37℃的无血清DMEM培养基并于显微镜下拍照。24 h和48 h后再次使用显微镜下拍照记录实验结果。

1.8 Western blot 检测蛋白表达

将培养好的贴壁细胞使用预冷的PBS清洗三次,加入含终浓度为1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液裂解细胞。使用干净的细胞刮刀将细胞裂解液刮至培养瓶一侧,用移液枪将裂解液移至干净的离心管中,4℃、12 000 r/min离心15 min。将上清液吸出到新的离心管中,细胞蛋白在上清中。使用BCA蛋白定量试剂盒对提取蛋白进行浓度测定。配制10%分离胶进行Western blot实验。

1.9 双荧光素酶荧光报告实验

为验证miR-124与Cdcp1(CUB domain containing protein 1)基因的3′-UTR是否为靶定关系,本研究将Cdcp1基因中含有与miR-124预测靶定部位的3′-非编码区片段插入pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target表达载体上,并命名为pmiR-GLO-CDCP1。其中Cdcp1 3′-UTR引物为:5′-ATCAGAGCTCCTTGATCCATTCCAG-3′(正义链);5′-AGCCTCTAGAAGCTTGAAATGGCAA-3′(反义链)。将pmiR-GLO-CDCP1与miR-124 mimics共转染293细胞,72 h后,通过萤光光度计检测并计算荧光素酶活性。无miR-124靶定的Cdcp1 3′-UTR序列插入pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target表达载体作为参照,命名为pmiR-NC。

1.10 统计学分析

实验数据均采用SPSS分析软件分析,结果表示为每组平均数±标准差。方差齐检验、单因素方差分析比较样本数据有无显著性差异(*P < 0.05)和极显著性差异(** P < 0.01)。

2 结 果 2.1 miR-124在宫颈癌细胞中的表达

miR-124在宫颈癌中表达显著降低,为研究miR-124在宫颈癌细胞中的调节作用,首先构建了表达miR-124的载体,并将其转染于SiHa细胞中,通过杀稻瘟菌素筛选获得稳定表达miR-124的SiHa细胞。检测结果如图1所示,与对照组细胞相比,miR-124在SiHa细胞中的表达量显著增高(约36倍)。

图 1 TaqMan® MicroRNA检测miR-124的表达 Fig. 1 MiR-124 expression detected by qRT-PCR using TaqMan® MicroRNA assay Data were presented as means ± SD (n = 3),** P < 0.01
2.2 miR-124对宫颈癌细胞增殖能力的影响

本研究首先利用CCK8定量实验研究了miR-124对宫颈癌细胞生长的调节作用。细胞增殖是生物体重要的生命特征,但癌症细胞具有能够无限增殖的能力。实验结果如图2所示。细胞生长曲线显示随着培养时间的推移,miR-124可显著抑制宫颈癌细胞的生长。在培养96 h时,对细胞生长的抑制率达到50%。

图 2 MIR-124抑制宫颈癌细胞的增殖 Fig. 2 MiR-124 suppresses proliferation of cervical cancer cells (a) Cell proliferation curve of SiHa transfected by pcDNA6.2-miR-124 and pcDNA6.2-miR-N.C (b) Quantitative determination of cell proliferation performed in triplicate was presented as mean±SD,** P < 0.01
2.3 miR-124对宫颈癌细胞侵袭迁移能力的影响

本研究利用Transwell实验评价miR-124对宫颈癌细胞迁移及侵袭能力的影响。如图3所示,miR-124的高表达可显著抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力,明显削弱了转染miR-124宫颈癌细胞穿过人工基质膜层的能力,并降低了癌细胞瓦解细胞外基质的侵袭能力。

图 3 MIR-124抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭 Fig. 3 MiR-124 suppresses migration and invasion of cervical cancer cells (a) Photomicrographs of transwell filters showed that the cells crossed through an 8-μm pore size membrane through migration without matrigel 200× magnification. Quantitative determination of cell migration performed in triplicate was presented as means±SD,** P < 0.01 (b) Photomicrographs of transwell filters showing the cells which across an 8μm pore size membrane with matrigel 200× magnification. Quantitative determination of cell invasion performed in triplicate was presented as means±SD,** P < 0.01

伤口愈合实验是最简单直接的检测肿瘤细胞迁移能力的实验方法之一。为进一步验证miR-124抑制宫颈癌细胞迁移的能力,本研究采用这一实验方案进行验证。图4结果显示,过表达的miR-124不仅能够抑制宫颈癌细胞的生长,并能够抑制其迁移。

图 4 细胞划痕实验结果 Fig. 4 Results of wound-healing assay Results of wound-healing assays in SiHa/miR-124,SiHa/N.C miR and SiHa cells are shown,indicating decreased migratory capacity in cells over-expressing miR-124
2.4 CDCP1是miR-124的直接靶基因

本研究利用生物信息学技术手段,结合TargetScan(http://www.targetscan.org)、PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de)和miRanda(http://www.microrna.org) 等数据库的数据对miR-124在宫颈癌细胞中的下游靶点基因进行了研究。其中,Cdcp1是miR-124的一个潜在靶点,Cdcp1与miR-124的作用方式如图5a所示。

图 5MiR-124直接靶定CDCP1 3′-UTR从而抑制其表达 Fig. 5 MiR-124 suppresses CDCP1 expression by directly binding to its 3′-UTR (a) The putative miR-124 binding sequences in CDCP1 3′-UTR (b)Luciferase activity assay was performed for the SiHa cells co-transfected with reporter vectors containing CDCP1 3′-UTR sequences and miR-124 mimics The normalized luciferase activity in blank reporter vector was set as relative luciferase activity. Data were presented as means ± SD (n = 3),** P < 0.01 (c)CDCP1 protein were determined in SiHa/N.C miR cells and SiHa/miR-124 cells compared with normal SiHa cells as negative control by Western blot

本研究进一步利用萤火虫荧光素酶实验研究miR-124的靶点基因。首先构建含有Cdcp1基因3′-UTR区域的pmiR-CDCP1的载体,该载体含有萤火虫荧光素酶报告基因和多聚腺苷酸尾的pmirGLO Dual-Luciferase® microRNA目标表达载体。SiHa细胞含有低水平的内源miR-124,将miR-124 mimics和pmiR-CDCP1双荧光素酶报告质粒在该细胞系中进行共转染后,以海肾荧光素酶为内部参照发现,与对照pmiR-NC相比,pmiR-CDCP1质粒表达出的荧光活性明显降低约1.4倍(图5b)。采用Western blot进一步对CDCP1蛋白的表达进行检测,发现CDCP1蛋白在过表达miR-124的SiHa/miR-124细胞中表达水平明显降低(图5b)。实验结果表明,miR-124通过与Cdcp1基因3′-UTR位点结合从而抑制其表达。

2.5 CDCP1高表达拮抗miR-124在宫颈癌细胞中对细胞迁移与侵袭的调节作用

miRNA与预测靶基因的3′-UTR区中一个或多个种子区的互补并不能完全作为预测该基因直接受microRNA调控的直接证据。由于microRNA所介导的转录后翻译抑制无法调控mRNA水平的改变,因此,本研究还从蛋白水平验证miR-124对CDCP1蛋白表达的调控,以进一步确定miR-124与Cdcp1的作用方式。将编码CDCP1蛋白开放阅读框(open reading frame,ORF)的野生型基因克隆到pcDNATM3.1(+)质粒上,使其得到外源性表达,与pcDNA6.2-miR-124载体共转染宫颈癌细胞(命名为miR-124 + pcDNA/CDCP1)。空载体pcDNATM3.1(+)与pcDNA6.2-miR-124、pcDNA6.2-miR.N.C载体分别共转染宫颈癌细胞作为对照组(分别命名为miR-124 + pcDNA3.1、N.C miR+pcDNA3.1)。

Transwell实验测定结果显示,对照组miR-124 + pcDNA3.1中,宫颈癌细胞侵袭和迁移能力受到抑制(分别为59%,47%);而miR-124 + pcDNA3.1转染组细胞相对侵袭和迁移能力分别增长了约36%和25%。表明恢复细胞中CDCP1的表达,可以部分抵消miR-124对宫颈癌细胞的迁移能力(图6a,c)和侵袭能力(图6b,c)的抑制效果。

图 6 恢复CDCP1蛋白表达拮抗miR-124对宫颈癌细胞中细胞迁移与侵袭的调节作用 Fig. 6 The effects of CDCP1 restoration in miR-124-transfected cervical cancer cells (a) Representative results of cell migration across membranes without matrigel (b) Representative results of cell invasion across membranes with matrigel (c) The percentage of cells across membranes was indicated by histogram Data were expressed as means±SD (n = 3),** P < 0.01
3 结 论

本研究利用外源性高表达miR-124的方式探讨miR-124在宫颈癌中的调节作用及机制。研究发现miR-124在宫颈癌细胞中具有抑制细胞生长、迁移和侵袭的功能。调控机制研究显示CDCP1是miR-124在宫颈癌细胞中的下游直接靶标蛋白。荧光素酶实验结果说明miR-124可以作用于Cdcp1基因的mRNA3′-非编码区。在宫颈癌细胞中高表达miR-124可以明显抑制CDCP1蛋白的表达。CDCP1是一种由836个氨基酸组成的I型跨膜糖蛋白[18],其高表达与肿瘤转移密切相关。有研究表明[18, 19],CDCP1的过量表达能够增强前列腺癌细胞与鳞状细胞癌的转移潜能。而在结肠癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤细胞中均检测到CDCP1的异常表达[20, 21, 22, 23]。经肿瘤活组织检测结果为CDCP1的表达高调的肺癌、胰腺癌和肾脏上皮细胞癌病人生存率有所降低[20, 24, 25]

CDCP1作为一种新型受体型细胞标志物和潜在肿瘤预期与诊断治疗靶点被广泛认可。作为上皮来源的肿瘤抗原,Cdcp1基因不仅与细胞迁移相关,还可能通过与细胞内不同种类蛋白质相互作用发挥其功能。例如,CDCP1通过细胞-细胞、细胞-细胞外基质间相关蛋白直接作用调节细胞运动性和附着性。有研究表明[26],CDCP1能够与钙粘蛋白N-cadherin、P-cadherin、粘着斑蛋白(Focal Adhesion Protein)syndecan-1、syndecan-4发生免疫共沉淀,说明CDCP1与这些癌细胞转移、增殖相关蛋白相互结合。此外,研究表明[23, 24],CDCP1能够调节粘附肿瘤细胞的细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)。利用Anti-CDCP1抗体处理结肠癌细胞系DLD-1,结果导致细胞迁移能力提升[27]。通过RNAi降低CDCP1的表达,同样能够抑制胰腺癌细胞系BxPc3和胃癌细胞系44As3和58As9的侵袭和迁移能力[20, 23]

为研究CDCP1是否与miR-124的肿瘤抑制功能相关,本研究通过外源性表达而提高CDCP1蛋白表达量。实验结果显示外源性表达CDCP1可以部分拮抗miR-124抑制宫颈癌细胞迁移和侵袭的能力。该实验结果说明miR-124可以通过抑制Cdcp1基因的表达来抑制宫颈癌细胞的生长、迁移和侵袭。本研究为揭示miRNA在宫颈癌发生发展中的作用及为今后宫颈癌的临床治疗进行了有益的探索。

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