嘧啶核苷包括胞嘧啶核苷和尿嘧啶核苷。胞苷作为嘧啶核苷，具有多方面生理活性，尤其在生物体内生理生化过程中起着重要的调控作用。胞苷不仅是很多抗病毒、抗肿瘤和抗艾滋病药物的良好中间体，也是基因工程研究的重要原材料。胞苷具有非常广泛的应用前景，胞苷的产量需求也逐年递增。胞苷生产方法主要有RNA化学合成和微生物发酵^{[1, 2]}。化学合成法是目前国内外制备胞苷的主要方法，即以胞嘧啶和核糖或者以尿苷为主要原料制备胞苷，但化学合成法存在许多问题，如反应条件苛刻、反应步骤多、环境污染大及原料成本高等。微生物发酵法生产胞苷具有成本低、条件简单、产率高、周期短等优势，已逐渐成为生产胞苷的研究热点^[3]。目前国内尚无胞苷生产企业，仍需从国外进口，而国外胞苷发酵已达到工业化水平。因此，急需找出一种高效生产胞苷的方法，以期解决我国胞苷发酵中存在的问题，不断提高胞苷发酵水平。据报道，微生物发酵法生产嘧啶核苷的菌株与生产嘌呤核苷的菌株具有很多相似之处，都要求菌株中具有很强的天然磷酸单酯酶活力^[4]，而解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)具备这一特性，并且解淀粉芽孢杆菌全基因组测序已经完成，遗传背景清晰，嘧啶代谢通量大，适合作为胞苷生产的出发菌株^[5]。

本文主要以解淀粉芽孢杆菌作为出发菌株进行研究，分析了该菌的胞苷合成代谢调控机制，提出构建胞苷高产菌株的育种策略，为大规模、单一地发酵生产胞苷，降低其生产成本，加快其工业化进程提供参考。

嘧啶核苷主要用于药物中间体，对于嘧啶核苷高产菌选育的研究报道比嘌呤核苷要晚^[6]。从20世纪90年代中期开始，随着嘧啶核苷的需求量不断加大，对胞苷代谢的研究也逐渐深入，发酵法生产胞苷得到广泛的重视，国内外围绕着嘧啶生物合成的代谢调控机制和核苷产生菌的遗传改造等方面开展了广泛的研究，胞苷代谢的研究逐渐成为国内外研究的热点。

胞苷发酵是典型的代谢控制发酵。国内在胞苷发酵和利用代谢工程选育胞苷生产菌的研究起步较晚，特别是在胞苷合成转录调控方面^[7]。国内有文献报道了利用枯草芽孢杆菌、大肠杆菌选育嘧啶核苷高产菌的研究和运用发酵法选育胞苷生产菌^{[3, 6, 7]}。盛春雷等^[8]以紫外诱变、5 -氟胞苷(5FCR⁺)和2-杂氮尿嘧啶(2AU⁺)对胞苷脱氨酶缺失突变株进行抗性筛选，筛选得到的突变株可稳定发酵。黄艳辉等^[9]通过诱变筛选得到的胞苷产生菌株的胞苷产量可达1.873 g/L。魏志强等^[10]通过METATOOL 软件分析枯草芽孢杆菌由葡萄糖生物合成胞苷的代谢途径，表明以代谢途径分析为指导，通过调整外界环境因子，可使胞苷的产量得到明显提高。张春艳等^[11]选育得到的枯草芽孢杆菌胞苷脱氨酶缺失突变株可提高胞苷发酵单位，同时又对间歇补料分批发酵方式研究，发现培养120h胞苷产量可达5.58 g/L。李登奎等^[12]以枯草芽孢杆菌胞苷脱氨酶缺失菌株为出发菌株进行亚硝基胍 (NTG)诱变，利用6-杂氮尿嘧啶 (6-AU)、5-氟胞苷和 3-杂氮尿嘧啶 (3-DU) 三种嘧啶结构类似物进行抗性筛选，筛选得到的突变株发酵80 h可积累胞苷612 mg /ml。苏静等分别敲除了大肠杆菌MG3028^[13]和枯草芽孢杆菌^[14]基因组上的胞苷脱氨酶基因(cdd)，结果表明：使胞苷流向尿苷的代谢途径被阻断，胞苷产量提高了近2倍，产量达到了1.72 g/L。方海田等^[15]利用定点突变构建了大肠杆菌的ATCase突变酶，结果表明ATCase定点突变可以在不同程度上使胞苷的合成累积途径得到强化。分别敲除了大肠杆菌AU39上的胞苷脱氨酶基因 (cdd)和高丝氨酸脱氢酶基因(thrA)，构建得到的突变菌株AU39 (Δcdd)和AU39 (ΔcddΔthrA)的胞苷产量分别提高了近 2 倍，表明通过阻断胞苷降解通路和高丝氨酸途径对提高胞苷浓度是有必要的^[16]。吴晓娇等^[17]以E.coli AU39 (Δcdd) 基因组为模板克隆carAB和pyrBI并构建重组质粒，分别转化到菌株A39(Δcdd)中，获得工程菌E. coli A39-AB和A39-BI，摇瓶发酵结果显示胞苷产量分别提高了85.3%、29.7%，表明过表达carAB基因和pyrBI基因均可促进胞苷的积累。

国内外对胞苷选育研究大多采用对特定微生物进行诱变处理的方法，解除胞苷代谢调节中的反馈阻遏和反馈抑制，选育营养缺陷型及核苷类似物抗性突变株。近年来，逐渐开始通过基因克隆、基因敲除等基因工程手段定向改造胞苷生产菌株，以拓宽胞苷的合成代谢途径。

从20世纪80年代中期到90年代中期国外大量报道了发酵法生产腺苷、尿苷、胞苷的诱变育种，特别是后两种嘧啶核苷的菌种选育获得了突破性成果。20世纪90年代，Satoru等^[18]通过化学诱变法对胞苷高产菌的菌种选育进行了研究，表明诱变后筛选得到的突变菌株能够提高胞苷发酵单位。此外，对胞苷脱氨酶基因同源重组使胞苷的产量进一步增加^[19]。对嘧啶核苷酸从头合成合成代谢途径优化表明：合成中间代谢产物尿苷酸(UMP)的酶受UMP及衍生物的阻遏；合成途径中第一个酶氨甲酰磷酸合成酶受UMP及衍生物的抑制；胞苷三磷酸(CTP)合成酶受CTP及衍生物的阻遏与抑制；通过增强PRPP合成途径中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶与PRPP合成酶剂量也能有效提高胞苷的产量^[20]。

分析解淀粉芽孢杆菌嘧啶核苷酸生物合成途径(图 1)，可以看出从头合成UMP是通过6个酶依次催化完成的，而编码这些酶的嘧啶生物合成基因的表达受到过量的尿嘧啶阻遏并表现出协同调节。在这些参与嘧啶核苷酸代谢的酶中，氨甲酰磷酸合成酶和天冬氨酸氨甲酰转移酶是嘧啶核苷酸生物合成途径的关键酶^[21]，天冬氨酸氨甲酰转移酶是典型的变构酶，主要催化嘧啶核苷酸生物合成的第2个限速反应。氨甲酰磷酸合成酶受尿苷酸的反馈抑制，氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸氨甲酰转移酶、二氢乳清酸酶、二氢乳清酸脱氢酶、乳清酸磷酸核糖转移酶、乳清酸脱羧酶均受到尿苷酸的阻遏调控，胞三磷合成酶受到三磷酸胞苷的严格反馈调控。因此，在育种过程中只有解除这些反馈抑制或阻遏作用，才能获得胞苷高产菌株。

图 1 解淀粉芽孢杆菌胞苷生物合成途径 1：氨甲酰磷酸合成酶；2：天冬氨酸氨甲酰转移酶；3：二氢乳清酸；4：二氢乳清酸脱氢酶；5：乳清酸磷酸核糖焦磷酸化酶；6：乳清酸单磷酸脱羧酶；7：尿苷酸激酶；8：胞三磷合成酶；9：5′-核苷酸酶；zwf编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶；gnd编码6-磷酸葡糖糖酸脱氢酶；prs编码PRPP合成酶；cdd编码胞苷脱氨酶 Fig. 1 Cytidine biosynthetic pathway and metabolic regulation pathways of B. amyloliquefaciens

图选项

解淀粉芽孢杆菌通过嘧啶操纵子机制来实现胞苷合成基因的表达与调控，嘧啶操纵子同时受到多种调控机制的平衡调控，主要有三种调控方式：阻遏作用、弱化作用及反馈抑制作用。弱化作用是嘧啶操纵子调节基因内部弱化子的作用，起到终止转录而抑制基因表达的作用。解淀粉芽孢杆菌嘧啶操纵子包括10个基因(如图 2所示)，依次为pyrR、pyrP、pyrB、pyrC、pyrAA、carB、pyrK、pyrD、pyrF、pyrE。解淀粉芽孢杆菌弱化调节机制通过3个弱化子来实现，分别位于操纵子上游5′端，即pyrR基因之前的非翻译区、 pyrR基因与pyrP基因之间和pyrP基因与pyrB基因之间的多顺反子区。pyrR基因编码PyrR弱化调节蛋白。PyrR蛋白是一种双功能蛋白，不仅编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶，而且在嘧啶生物合成转录水平中起重要的调控作用^[22]。在弱化调控机制中，PyrR调节蛋白通过作用于pyr操纵子非翻译区域的三段转录终止位点，即位于pyr mRNA 的上游转录弱化区域内，起到控制转录的作用，如图 2所示。研究表明，UMP是PyrR弱化调节蛋白的效应因子，通过产生protein-RNA机制起到提前终止转录的作用^[23]。当UMP浓度升高时，会促进UMP和PyrR蛋白紧密地结合，使细菌操纵子转录效率降低并提前终止转录，从而降低操纵子下游结构基因的表达水平，当尿嘧啶UMP含量低时，PyrR无法与UMP结合，没有与RNA结合的活性，前导RNA形成反终止结构，而转录不停止^[24]。

图 2 解淀粉芽孢杆菌嘧啶操纵子结构示意图 pyrR编码pyr弱化调节蛋白；pyrP编码尿嘧啶透性酶；pyrB编码天冬氨酸转氨甲酰基酶；pyrC编码二氢乳清酸酶；pyrAA编码氨甲酰磷酸合成酶谷氨酰胺酶亚基；carB编码氨甲酰磷酸合成酶催化亚基；pyrK编码二氢乳清酸脱氢酶电子迁移亚基；pyrD编码二氢乳清酸脱氢酶催化亚基；pyrF编码乳清酸单磷酸脱羧酶；pyrE编码乳清酸磷酸核糖焦磷酸化酶 Fig. 2 The map of pyr operon in B. amyloliquefaciens

图选项

胞苷发酵的先决条件是设计、构建和优化微生物嘧啶核苷代谢网络，定向选育具有胞苷高效合成能力的生产菌种。综合分析胞苷代谢途径和文献报道，胞苷过量生物合成受到诸多因素的影响。因此，为获得胞苷发酵高产菌株，基于嘧啶生物合成代谢调控和转录弱化调控机制，通过基因重组和定向进化，提出6种解淀粉芽孢杆菌嘧啶操纵子转录调控区域改造代谢育种策略。因此选育胞苷高产菌株时，除考虑胞苷脱氨酶缺陷的影响外，还有解除代谢产物的反馈抑制或阻遏，以及增加关键酶的表达剂量。

pyrR基因编码PyrR弱化调节蛋白。在弱化调控机制中，UMP浓度升高会促进UMP和PyrR蛋白紧密结合，使嘧啶操纵子转录效率降低并提前终止转录，从而降低操纵子下游结构基因的表达水平。有研究证实，敲除pyrR基因可引起嘧啶生物合成基因簇的连续表达^[25]。已有研究报道PyrR蛋白的转录弱化调节机制，但pyrR基因敲除对胞苷产量的影响作用尚不清楚。所以可采用基因敲除技术，失活调节蛋白PyrR，致使UMP无法与PyrR蛋白结合，当细胞内UMP浓度增加时，PyrR蛋白与RNA结合的活性失去作用，前导RNA形成反终止结构，使转录继续进行，从而提高嘧啶操纵子下游结构基因的表达剂量，以期增加胞苷的合成量。

解淀粉芽孢杆菌嘧啶操纵子中有三段转录弱化区域，分别位于pyrR基因之前的非翻译区、pyrR基因与pyrP基因之间和pyrP基因与pyrB基因之间。这三个弱化子严格调控结构基因的转录水平，若将编码这三段弱化区域的基因敲除，可能会改变嘧啶操纵子的转录，从而增加结构基因(pyrR、pyrP、pyrB、pyrC、pyrAA、carB、pyrK、pyrD、pyrF、pyrE)的表达剂量，增强嘧啶合成途径的代谢流量，对胞苷的过量合成产生重要的作用。

正常菌株细胞中，胞苷被分解为尿苷，不会有胞苷积累。在胞苷分解代谢中，起关键作用的是由cdd基因编码的胞苷脱氨酶。有研究表明通过基因敲除使胞苷脱氨酶基因cdd失活或缺失，胞苷有了不同程度的提高^{[13, 14, 16]}。所以可通过同源重组的方法构建胞苷脱氨酶缺失突变株，有效阻断由胞苷流向尿苷和尿嘧啶的嘧啶代谢通量，继而阻断胞苷继续代谢，达到使胞苷的积累量增加的目的。

解淀粉芽孢杆菌嘧啶生物合成途径的补救合成途径由尿嘧啶磷酸核糖转移酶催化尿嘧啶和5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)生成尿苷酸。有研究报道通过增强磷酸戊糖途径，可积累胞苷产量^[26]。所以可使6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf、6-磷酸葡糖糖酸脱氢酶基因gnd和PRPP合成酶基因prs过表达，以增强磷酸戊糖途径和提高PRPP合成酶活性，从而进一步提高胞苷产量。

通过对解淀粉芽孢杆菌途径分析可知，葡萄糖以6-磷酸葡萄糖的形式进入细胞内，通过糖酵解途径(EMP)和磷酸戊糖途径(PPP)进入胞苷代谢网络。一部分葡萄糖通过EMP途径生成丙酮酸，丙酮酸进入TCA循环分解成CO₂，另一部分葡萄糖通过 途径发生分解形成NADPH，C4或C5等碳架物质^[10]。所以可通过对6-磷酸葡萄糖脱氢酶进行节堵，过量表达转酮醇酶，使TCA循环减弱，避免生成CO₂造成的浪费，从而增强中心碳代谢流，达到使胞苷过量合成的目的。

天冬氨酸和氨基甲酰磷酸盐是胞苷的合成前体，为了阻塞分支代谢途径，通过选育不产生蛋氨酸和苏氨酸的丝氨酸脱氢酶缺失突变株，将有更多的天冬氨酸参与胞苷的生物合成。同时可敲除高丝氨酸脱氢酶基因thrA，以增强天冬氨酸向嘧啶合成途径的分流量，阻断天冬氨酸向高丝氨酸、苏氨酸的分流途径，即可提高胞苷的产量^[15]。

胞苷是一种亲水性分子，不能自由通过细胞膜的脂质双层结构。核苷转运蛋白在胞苷的分泌过程起着重要的作用，同时对于核苷酸的从头合成也是极其重要的。其中主要是由扩散性核苷转运蛋白(equilibrative nucleoside transporter，ENT)介导其由胞内分泌到胞外，该转运蛋白是根据浓度梯度将胞苷从浓度高的一侧转运到浓度低的一侧^[27]。可通过提高核苷转运蛋白的表达水平，增强胞苷由胞内向胞外转运的能力。

有研究报道在L-谷氨酸发酵过程中，通过控制生物素、油酸、甘油及温度等改变细胞膜结构，使谷氨酸由细胞内渗透到细胞外^[28]。由此推断，是否也可通过这些方法增强细胞膜的通透性，使胞苷从胞内流出胞外，从而提高胞苷产量。另外，日本学者发现Mn²⁺离子对产氨短杆菌核苷酸的细胞膜通透性起着关键的调节作用，Mn²⁺限量时可引起细胞形态变化，促使细胞膜通透性发生改变，使生成的肌苷酸也分泌到细胞外，导致肌苷酸的产量增加^[28]。因此，可通过控制离子的种类和浓度来改变细胞膜的通透性，加快胞苷不断由胞内向胞外分泌，以此提高胞苷产量。

随着基因工程和分子生物学的兴起，不同种类微生物基因序列和遗传背景的不断明晰，依据胞苷代谢调控机制，采用基因敲除等手段构建胞苷高产菌株的育种策略将会在胞苷生产菌代谢调控育种中占有重要地位。目前我国的胞苷尚无生产企业，仍需从国外进口，而国外胞苷生产水平已达到了工业化水平。因此，今后的主要任务是依据代谢调控育种原理，利用现代微生物遗传育种技术选育高产稳定的胞苷生产菌株，从而解决目前胞苷工业化生产中存在的问题，对于加快实现国内胞苷产业化的进程具有重要的意义。