2015, Vol. 35文章信息
- 尹守亮, 张玉秀, 张琪, 豆梦楠, 杨克迁
- YIN Shou-liang, ZHANG Yu-xiu, ZHANG Qi, DOU Meng-nan, YANG Ke-qian
- 无机磷酸盐对链霉菌合成次级代谢产物的影响
- The Effect of Inorganic Phosphate on the Biosynthesis of Secondary Metabolites in Streptomyces
- 中国生物工程杂志, 2015, 35(9): 105-113
- China Biotechnology, 2015, 35(9): 105-113
- http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20150915
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文章历史
- 收稿日期: 2015-04-14
- 修回日期: 2015-04-30
2 中国科学院微生物研究所 微生物资源前期开发国家重点实验室 北京 100101
2 State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
临床上使用的抗生素多数来源于放线菌合成的次级代谢产物，其中60%主要来源于链霉菌属[1, 2]，这些次级代谢产物，包括[无抗生素活性的化合物，如比卡菌素(bikaverin)及某些麦角生物碱(ergot alkaloids)类物质[3,4]的合成一般会受到生长环境中无机磷酸盐的影响，当环境中的无机磷酸盐浓度低于一定的阈值时，链霉菌开启次级代谢合成基因簇表达，大量合成次级代谢产物[5, 6]。研究证实，当培养环境中存在过量的无机磷酸盐时，超过32种的链霉菌“关闭”次级代谢产物的合成[7, 8, 9]。本文就无机磷酸盐与链霉菌合成次级代谢产物之间的关系和分子调控机制进行综述，希望有助于本领域读者开展相关的科学研究。
1 无机磷酸盐与次级代谢产物合成之间的关系链霉菌合成次级代谢产物需要一个适宜的磷酸盐浓度范围[10, 11]，不同种属链霉菌合成次级代谢产物所需的最适宜磷酸盐浓度不同(表 1)。通常环境中0.3~500mmol/L浓度的无机磷酸盐能够促进链霉菌生长，但是超过10mmol/L的磷酸盐会显著抑制绝大多数链霉菌的次级代谢产物合成，同时研究还发现磷酸盐浓度过高会明显延迟链霉菌孢子形成(数据未发表)。无机磷酸盐作为一种信号分子或营养因子通过以下代谢活动影响链霉菌次级代谢产物合成。
1.1 无机磷酸盐促进链霉菌初级代谢，抑制次级代谢磷酸盐作为一种效应因子控制链霉菌初级生长代谢活动中绝大多数酶的催化活性反应。例如，DNA合成、RNA合成、蛋白质合成、糖类物质代谢、细胞呼吸作用及维持ATP的总量水平等代谢活动，都涉及无机磷酸或磷酸盐的参与。无机磷酸盐或参与大分子物质结构组成(核酸)，或参与有关的酶促催化反应(磷酸化和去磷酸化)。研究发现，在低浓度磷酸盐的发酵培养基中，链霉菌生长到指数期间，核酸和蛋白质的合成速率明显快于指数后期抗生素的合成阶段[12, 13]。Perlman和Wagman[14]实验证明，培养环境中过量的无机磷酸盐显著抑制灰色链霉菌(Streptomyces griseus)链霉素(streptomycin)的合成，却极大提高了葡萄糖的利用率。向正在合成金霉素(chlortetracycline)的金色链霉菌(Streptomyces aureus)发酵液中加入过量的无机磷酸盐，继续发酵培养，检测发现葡萄糖的消耗速率迅速上升，同时还发现金色链霉菌菌丝体DNA、RNA及蛋白质的合成速率加快，生物量明显增加；在该条件下检测金色链霉菌的磷酸戊糖代谢途径和金霉素的合成活性则大大降低[15]。这表明在链霉菌合成次级代谢产物期间，补加入一定量的无机磷酸盐，能迅速改变链霉菌的新陈代谢活动，扭转次级代谢活动为初级代谢。环境中的营养物质(如碳源、氮源及磷酸盐等营养因子)的含量随着链霉菌生长(生物量增加)过程而逐渐被消耗减少，当环境中残存的磷酸盐的含量降低到一定阈值时，即不能适配链霉菌的生长速率、打破了营养物质消耗速率与生长速率的平衡关系，链霉菌将减弱初级代谢，降低自身生长速率，转而开启次级代谢途径，而一旦环境中营养物质(包括磷酸盐)供给恢复，初级生长代谢水平又开始旺盛，合成抗生素的代谢途径关闭。
| Secondary metabolites | Producer | Concentration of inorganic orthophosphate (mmol/L) |
| A-9145 | Streptomyces griseolus | 0.28~2.24 |
| Actinomycin | Streptomyces antibioticus | 1.4~17 |
| Amphotericin B | Streptomyces aureofaciens | 1.5~2.2 |
| Ayfactin | Streptomyces griseus | 1~17 |
| Candicidin | Streptornyces viridoflavus | 0.5~5 |
| Cephamycin | Streptomyces clavuligerus | 25 |
| Chlortetracycline | Streptomyces aureofaciens | 1~5 |
| Cycloheximide | Streptomyces griseus | 0.05~0.5 |
| Kanamycin | Streptomyces kanamyceticus | 2.2~5.7 |
| Levorin | Streptomyces levoris | 0.3~4 |
| Monamycin | Streptomyces jamaicensis | 0.2~0.4 |
| Mycoheptin | Streptoverticillium mycoheptinicum | 3.5 |
| Novobiocin | Streptomyces niveus | 9~40 |
| Nystatin | Streptomyces noursei | 1.6~2.2 |
| Oleandomycin | Streptomyces antibioticus | 0.5 |
| Oxytetracycline | Streptomyces rimosus | 2~10 |
| Streptomycin | Streptomyces griseus | 1.5~15 |
| Tetracycline | Streptomyces aureofaciens | 0.14~0.2 |
| Vancomycin | Streptomyces orientalis | 1~7 |
某些次级代谢产物，如链霉素、紫霉素(viomycin)、新霉素(neomycin)和万古霉素(vancomycin)等，其合成过程中的某些中间代谢产物会有不同程度的磷酸化修饰，这些磷酸化了的中间代谢产物需要相应磷脂酶的剪切作用才能形成无磷酸化的最终产物，而过量的无机磷酸盐则通过反馈抑制作用抑制磷脂酶的剪切活性。虽然目前还没有直接的文献报道：过量磷酸盐抑制某个磷脂酶活性从而终止某类次级代谢产物合成，但是实验研究发现，当加入过量磷酸盐后发酵产物中磷酸化的中间产物明显增多。例如，链霉素的合成途径中至少产生4种磷酸化的中间代谢产物：O-磷酰基-N-脒基-肌醇胺(O-phosphoryl-N-amidino-scyllo-inosamine)、D-肌醇-磷酸(D-myo-inositol-P)、O-磷酸化的链霉亲和素(O-phosphoryl-streptidin)和磷酸链霉素(streptomycin-phosphate)。在链霉素合成阶段，向发酵培养基里补加过量无机磷酸盐，链霉素的合成停止，而这些磷酸化或磷酯化的中间产物则大量积累[16, 17]。与链霉素相比，磷酸化的链霉素杀菌的生物活性大幅度降低，根据这一点，也有学者推测[18]，当外界磷酸盐含量增多时，灰色链霉菌为了避免已合成的链霉素对自身产生毒害作用，因而将其转化为无毒性的带有磷酸化基团的形式(streptomycin-phosphate)，灰色链霉菌通过这样的一种磷酸化机制做自我保护，同时利用回补的营养因子恢复初级生长代谢途径。
与链霉素合成过程相似，弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)合成新霉素(neomycin)的过程中需要碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)的去磷酸化作用，而研究发现碱性磷酸酶一般在弗氏链霉菌生长后期才开始合成，碱性磷酸酶作用于磷酸化的Neomycin-B和Neomycin-C，最终形成有抗菌活性的新霉素终产物[19]。在弗氏链霉菌发酵培养液里可以检测到发生焦磷酸化的Neomycin-B和Neomycin-C的中间代谢产物。然而Mertz和Doolin[12]在研究磷酸盐抑制东方链霉菌(Streptomyces orientalis)合成万古霉素(vancomycin)的过程中，检测不到磷酸化的万古霉素中间产物，但仍能发现过量磷酸盐会明显抑制碱性磷酸酶的活性。
1.3 无机磷酸盐抑制次级代谢产物合成所需的前体物对于某些抗生素，如四环素类抗生素，聚烯、非具烯类大环内酯抗生素及其他聚酮类抗生素，其生物合成的前体物多为乙酰辅酶A或/和丙二酸单酰辅酶A，而聚酮类抗生素相对其他类抗生素来说，其合成过程对无机磷酸盐的浓度感应更为敏感。聚酮类抗生素合成的延伸单位多为丙二酸单酰辅酶A或/和甲基丙二酸单酰辅酶A，这些延伸单位一般由乙酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1 .2 )或甲基丙二酸单酰辅酶A羧基转移酶(EC 2.1.3.1)催化合成，其催化转移的羧基来源于草酰乙酸，而草酰乙酸由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(EC 4.1.1.31)催化合成，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶为反应限速酶，过量无机磷酸盐和ATP会大大抑制该酶的催化活性，导致草酰乙酸合成减少[20]。
链霉素分子由链霉胍、链霉糖和N-甲基-L-葡萄糖胺三部分组成，其中肌醇为链霉素合成的前体物，该前体物由D-葡萄糖-6-磷酸醛羧酶(D-glucose-6-phosphate-cycloaldolase，EC:1.1.1.49，NAD+依赖性)催化合成，该酶催化葡萄糖-6-磷酸转化为1-磷酸肌醇，高浓度的多聚磷酸盐是该醛羧酶的竞争性抑制剂，抑制1-磷酸肌醇的合成，使链霉素生物合成的底物变少[21, 22]。过量的无机磷酸盐通过反馈作用抑制某些关键限速酶的催化活性，使次级代谢产物合成的前体物减少，导致关闭或终止次级代谢产物的合成。
1.4 多聚磷酸盐除前文所述外，当链霉菌周围生长环境中存在过量的无机磷酸盐时，细胞摄取过量磷酸盐转变成多聚磷酸盐(polyphosphate)的形式储存于细胞质内，或在细胞膜附近结晶[23]。多聚磷酸盐的详细功能目前还不是很清楚，但推测可能是作为一种磷酸盐的储藏器，细胞自身新陈代谢先消耗环境中的磷酸盐，当环境中磷酸盐耗尽时才开始同化利用多聚磷酸盐；多聚磷酸盐也可能是作为一种细胞内的缓冲成分，维持细胞特定稳态环境，该稳态环境有利于链霉菌生长的各种酶促代谢反应，当磷酸盐被消耗，浓度降低到一定阈值时，该稳态环境受到破坏，链霉菌开始减慢初级代谢并开启次级代谢合成途径。
2 无机磷酸盐影响链霉菌次级代谢产物合成的分子调控机制如前文所述，自20世纪60年代开始主要是在代谢水平上对无机磷酸盐和链霉菌次级代谢产物之间的联系进行研究，而且一些理论的提出尚缺乏更深入直接的实验证据。一般来说，抗生素及其他次级代谢产物的合成在链霉菌生长时期的稳定期才开始进行，并持续到生长的后期，这有着很明显的时序特征，这种时序性特征可能是通过链霉菌胞内特定“感应系统”感应环境中的营养信号(如无机磷酸盐)，进而激活和抑制一系列相关基因的转录变化来实现的。20世纪初期至今，是分子生物学技术迅猛发展的时期，有越来越多的文献研究开始在基因调控水平上，真正揭示磷酸盐对链霉菌初级代谢和次级代谢的影响。
2.1 双组分信号转导系统PhoR-PhoP调控机制调控是一种适应机制，是指在微生物的整个生长发育分化周期过程中(初级代谢—生长和次级代谢—产抗生素和繁殖孢子)，促使其快速的适应生存环境的各种机制。生物信息学比对分析发现，几乎所有的链霉菌都是通过双组分信号系统转导系统PhoR-PhoP来感应环境中的无机磷酸盐信号，进而引起一系列的基因转录表达变化，影响链霉菌的初级代谢和次级代谢活动的[24]。Sola-Landa等[25]对变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)的PhoP和PhoR-PhoP分别进行了敲除，得到的这两个基因缺失突变株其生长表型基本一致，均对无机磷酸盐敏感性降低，摄取和转运胞外无机磷酸盐能力下降，只有在含有非常高浓度的磷酸盐培养基中才能生长；与野生型出发株相比，这两个缺失突变株的另一个显著特征是合成的次级代谢产物，如放线菌紫素Act(actinorhodin)和十一烷基灵菌红素Red(undecylprodigiosin)的产量明显增加，这表明PhoR-PhoP双组分信号转导系统能够影响链霉菌次级代谢产物的合成。
2.1.1 PhoR-PhoP双组分信号转导系统在绝大多数链霉菌中，phoR和phop基因高度保守，其编码序列在基因组上是相邻同向排布，这两个基因的编码序列之间仅隔5bp。PhoR为一种跨膜结构蛋白，其N端为一个大的疏水跨膜区，横跨细胞膜并固定在细胞膜上，其中His-165为磷酸化位点[26, 27]，推测其功能是感应外界环境的无机磷酸盐信号并发生磷酸化；PhoP蛋白N端的Asp-6、Asp-49和 Lys-98可能是发生磷酸化的氨基酸残基[28]，C端是具有OmpR家族特征的DNA结合结构域[29]。当环境中无机磷酸盐的浓度较低时，链霉菌生长逐渐处于一种磷酸盐“饥饿”状态，PhoR蛋白发生磷酸化(PhoR~Pi)，PhoR~Pi将自身的磷酸基团转移给PhoP，PhoP属于OmpR家族的调控蛋白，含有一个很明显的HTH (Helix-turn-helix)结构的DNA结合结构区域，磷酸化的PhoP蛋白特异结合到某些靶基因的启动子区域，进而激活或抑制靶基因的转录表达。例如，磷酸化的PhoP蛋白能够特异性结合到phoR启动子区，加强phoR的转录表达[30]。Sola-Landa等[31]对PhoP~Pi结合的靶基因的启动子区进行特征分析，发现这些启动子区一般都含有一个相似的正向重复序列(direct repeat upstream sequences，DRus)，该正向重复单元为11nt[G
TCAYYYR
G(Y：嘧啶碱基；R：嘌呤碱基)]，通过体外EMSA(electrophoretic mobility shift assay)实验证实每个启动子区域至少要存在两个DRus，才能保证PhoP~Pi与该启动子区结合，某些基因的启动子区含有数个DRus，如phoD基因(编码胞外碱性磷酸酶，降解含磷酸的有机化合物释放出磷酸)启动子区域含有6个DRus[32]。PhoR-PhoP双组分信号转导系统“感应”周围环境的无机磷酸盐信号，活化了的调控蛋白PhoP识别靶基因前特异结构的启动子核酸序列，进而影响该靶基因的转录表达。
体外实验验证和软件统计分析共得到的26个基因的启动子区域含有明显的PhoP特异性结合的DRus核酸序列；利用生物信息学对整个天蓝色链霉菌基因组序列信息进行粗略比对分析发现，约含有2 088个DRus结构的核酸位点，平均分布在基因的编码区和非编码区；Allenby等[24]开展的染色体免疫共沉淀-芯片数据研究显示，约有470个基因受到PhoP的调节影响，在这470个基因中约有150个基因含有明显的DRus结构区域，包括上述已被发现和证实的26个基因中的20个基因的启动子区，表明PhoP是一种全局性的调控因子，可能控制链霉菌多种生物行为。
2.1.2 PhoP调控次级代谢产物合成相关基因转录表达不同种属链霉菌PhoR-PhoP的调控机制可能不同。例如，纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)PhoP或PhoR-PhoP缺失后，合成的匹马菌素产量增加了80%[33]；在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans JI 1326)中，PhoP缺失株合成Act和Red的产量也明显提前和增加[25]，而在天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor M145)中，PhoP缺失却导致Act和Red产量降低[34]。总之，PhoR-PhoP双组分信号转导系统确实能够影响链霉菌次级代谢产物的合成。Chip-on-chip的数据分析发现，PhoP并不直接结合和作用于次级代谢产物合成基因簇，而是通过间接影响某些转录调控因子(afsS、atrA和scbR-scbA等)来控制Act、Red及其他次级代谢产物的合成。AfsS是一种全局性调控因子(见2.2部分)，过表达AfsS能显著增加次级代谢产物的产量[34]。Uguru等[35]研究发现，AtrA能够激活途径特异性调控基因actII-orf4转录表达从而促进Act的合成。PhoP还能够结合到scbR-scbA基因之间的区域，目前对其激活或抑制作用还不明确。但ScbA主要作用是催化合成γ-丁酸内酯，γ-丁酸内酯作为链霉菌胞内信号分子能够特异性结合到相应的受体蛋白ScbR上。文献报道ScbR蛋白能够控制一系列与次级代谢产物合成相关基因的转录表达[36]。因此可推知，PhoP控制次级代谢产物合成可能并不是直接作用于次级代谢产物合成基因簇上，而是通过影响上述多种全局性或多效性调控基因转录表达的共同结果。
2.1.3 PhoP抑制参与链霉菌中心代谢活动的某些基因的表达Chip-microarray芯片数据及生物信息学统计分析发现[24]，PhoP能够抑制胞内参与呼吸作用过程中氧化磷酸化的部分基因的转录表达。例如，编码NADH脱氢酶复合体(SCO4562-SCO4575)、F型ATP合酶(SCO5366-SCO5374)、细胞色素c和细胞色素b氧化酶复合体(SCO2148、SCO2151和SCO2155-SCO2156)、琥珀酸脱氢酶(SCO4855-SCO4858)等基因的表达水平与PhoP缺失突变株相比明显降低，这些基因的表达变化将直接影响胞内能量的总量水平；除此之外，PhoP还能够抑制glgp(编码糖原磷酸化酶)的转录表达，降低糖原的分解代谢；抑制编码合成嘌呤(purF-purM)和嘧啶(pyrH、pyrR)的基因表达，降低核酸的合成速率；抑制有关蛋白质的合成；等等[37]。总之，当生长环境中的磷酸盐浓度较低时，磷酸化的PhoP下调参与链霉菌的重要中心代谢活动(如呼吸作用、核苷酸和蛋白质合成等)相关酶的表达活性，其结果是减慢链霉菌初级代谢活动，降低营养因子和能量的消耗，为次级代谢产物合成准备条件。
2.1.4 PhoP促进参与合成细胞壁多聚物相关基因的转录表达当链霉菌处于磷酸盐“饥饿”状态时，PhoP蛋白上调合成细胞壁或胞外多聚物(extracellular polymer)相关基因的转录表达。例如，在SCO4873-SCO4881和SCO6021-SCO6025 基因簇中，SCO4873编码的差向异构酶负责合成N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸(GlcNAc-6-P)，用于细胞壁的合成；SCO4874能够编码细胞壁合成的糖基转移酶，向细胞壁上转移多糖残基；SCO6021-SCO6025基因簇主要是负责合成细胞壁上的多聚糖(polysaccharide)，这些基因转录水平上的变化与链霉菌的形态表型相吻合，天蓝色链霉菌phoP基因缺失突变株由于缺少细胞壁多聚物，导致其在琼脂平板上表现出极大地脆弱性；与野生型菌株相比，phoP敲除株菌体表面极易发生脆裂[24]。
PhoP促进细胞壁上多聚物的合成，这些多聚糖类物质磷酸含量一般较低，目前只能推测是替代细胞壁上含磷酸较丰富的磷壁酸(teichoic acid)，因为有学者认为磷壁酸、核酸和多聚磷酸盐是细胞内的磷酸储藏器，含有丰富的磷酸。例如，在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中，当环境中磷酸盐浓度较低时，PhoP蛋白抑制磷壁酸的生成，用合成的糖醛酸来代替细胞壁上磷壁酸[38]。因此推断，在链霉菌胞内也可能存在与芽孢杆菌相似的作用机制，同时推测磷壁酸降解释放出的磷酸也可以回补胞内磷酸盐的消耗。
2.1.5 PhoP激活参与无机磷酸盐摄取和转运基因的转录表达由于生长代谢的消耗，链霉菌胞内磷酸盐浓度降低，并逐渐处于一种磷酸盐“饥饿”的状态，为了继续维持自身生长或形态发育分化的需要，链霉菌开始激活参与摄取外界无机磷酸盐的相关基因的表达，首先PhoR-PhoP系统“感应”低浓度磷酸盐的“饥饿”信号，进而发生磷酸化的PhoP调控蛋白作用于基因组上与无机磷酸盐摄取和转运相关的靶基因，诱导链霉菌自身产生胞外水解酶，如碱性磷酸酶SCO1565和SCO1968，其中SCO1968编码甘油磷酰二酯酶降解参与水解磷脂质类物质，释放出无机磷酸[32]，与此同时激活和强化无机磷酸盐的转运系统(pstSABC操纵子)，具有磷酸盐高亲和性的转运蛋白能够将无机磷酸盐转运到细胞内，补偿胞内消耗掉的无机磷酸盐[39, 40]。
2.1.6 PhoP抑制氮代谢和形态发育分化磷酸化的PhoP能够结合到glnR的启动子区抑制该基因转录表达，GlnR为正向调控蛋白，主要是负责调节链霉菌胞内氮的同化作用[41]，当磷酸盐浓度较低不足以继续维持链霉菌的正常生长时，氮的代谢也将会减慢。Chip-on-chip数据显示，天蓝色链霉菌PhoP缺失株与野生型菌株相比，前者参与链霉菌形态发育分化的一系列bld基因(bldA、bldC、bldD、bldK和bldM)和rpoZ基因的转录水平明显提高[24, 42, 43]。与PhoP缺失株相比，野生型天蓝色链霉菌的sigU基因的转录水平增加明显[37]，Gehring等[44]研究发现，在天蓝色链霉菌中过表达sigU，导致气生菌丝形成延迟，因此推断PhoP能够抑制链霉菌的形态发育分化。
综上所述，在基因调控水平上，低浓度的无机磷酸盐通过PhoR-PhoP双组分信号转导系统影响链霉菌的中心代谢活动、次级代谢产物的合成、氮的代谢及形态发育分化等过程，同时激活磷酸盐的摄取和转运系统，从外界环境中补充磷酸盐进入到胞内(图 1)。
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| 图 1 PhoP控制链霉菌多种代谢途径及形态发育分化 Fig. 1 Overview of the breadth of pathways and morphological differentiation processes controlled by the PhoP transcription factor |
从生长时期来看，链霉菌生长一般进入到稳定期(或静止期)时，才开始合成次级代谢产物，而绝大多数次级代谢产物合成基因簇转录表达都需要一个转录调控蛋白，通常称为抗生素调控蛋白或途径特异性调控蛋白。例如，ActII-ORF4和RedD的功能主要是促进天蓝色链霉菌放线菌紫素Act和十一烷基灵菌红素Red合成基因簇的转录表达。但这些途径特异性调控基因的启动子区域并不含有PhoP所结合的典型的 DRus结构序列。体外EMSA实验同样证实PhoP并不能与这些调控基因的启动子区结合，因此，PhoP对于次级代谢产物合成的控制是通过影响其他调控途径完成的。绝大多数链霉菌中一般都拥有若干全局性调控因子，全局性调控因子能够控制链霉菌的多种生命代谢活动，如抗生素生物合成和形态发育分化等。其中全局性调控因子AfsR/AfsS在链霉菌中高度保守，并且与PhoP之间以及次级代谢产物合成之间关系最为紧密。
2.2.1 AfsR/AfsS促进链霉菌次级代谢产物合成AfsR蛋白主要包括3部分结构。N段的DNA结合区域，与途径特异性调控蛋白ActII-ORF4和ReD具有较高的同源性，发生磷酸化的AfsR与DNA的结合能力明显增强。中部为ATPase结构，主要功能是水解ATP释放能量，释放的能量用于推动RNA聚合酶的转录活性，对中端ATPase区进行敲除并不影响AfsR与DNA的结合，但能抑制AfsR调控的靶基因的转录，如afsS的转录。发生磷酸化的AfsR除了与DNA有较强的结合能力，还能显著促进ATPase的水解能力。Tanaka等[45]在体外实验证明AfsR正是通过招募RNA聚合酶促进afsS的转录。C段为TPR结构域[tetratrico peptide repeat (TPR) domain]，TPR基序或结构域是由3个或4个氨基酸残基组成的序列单元(一般为3~16个)串联重复排列组成。TPR结构域一般参与许多重要的生命活动，如细胞周期调控、转录控制、线粒体和过氧化物酶体的运输等，AfsR的TPR区域主要是负责招募RNA聚合酶[45]。AfsS为分子质量(63个氨基酸)较小的调控因子，能参与多种抗生素的生物合成，但其调控抗生素合成的方式目前还不是很明确。在天蓝色链霉菌AfsR敲除株中，afsS转录水平显著下降，表明AfsR能够激活和促进afsS的转录，体外EMSA实验也证明AfsR能够与afsS启动子区域特异性结合[46]。
过表达AfsR或AfsS均能显著提高天蓝色链霉菌Act和Red的产量，转录分析发现Act和Red产量提高的原因是调控这两个基因簇的途径特异性调控基因actII-orf4和redD的转录水平明显增强。对AfsS敲除突变株进行发酵，虽然能检测到一定量的Act和Red，但产量与出发株相比明显降低；与AfsS敲除突变株相比，AfsR敲除株中Act和Red的产量更低，只有微量色素生成，这表明AfsR在一定程度上是通过促进afsS转录表达，来促进次级代谢产物生成；但在AfsS敲除株中过表达AfsR能大幅度回补Act和Red产量，表明AfsR除了能够促进afsS转录来调控次级代谢产物合成外，还能通过其他途径促进Act和Red的合成[46]。在actII-orf4和redD敲除突变株中，过表达AfsR不能回补Act和Red的合成，相反在AfsR敲除突变株中过表达actII-orf4和redD却能明显回补和提高Act和Red的产量，表明AfsR对次级代谢产物Act和Red的合成主要还是依赖于途径特异性调控基因的调控作用[47]。
2.2.2 AfsR/PhoP/AfsS三者相互协调机制通过生物信息学分析和体外EMSA实验研究发现，在天蓝色链霉菌中磷酸化的PhoP能够特异性结合到全局性调控因子afsS启动子区(该区域含有PhoP特异结合的DRus序列结构)。而AfsR通过招募RNA聚合酶也能结合到afsS启动子区并启动该基因的转录，AfsR结合afsS启动子的区域与PhoP结合afsS启动子的区域仅相差一个碱基[48]，这说明AfsR和PhoP都能够对AfsS起到调控作用；Santos-Beneit等[34]体外实验证明，AfsR除了与afsS启动子区结合外，还能与phoR和pstS(参与磷酸盐转运，同时含有PhoP特异结合的DRus序列结构)的启动子区特异性结合，对phoR和pstS起抑制作用。前期的一些研究结果认为PhoP对afsS的调控行为是抑制作用[34]，但近期研究结果表明，在AfsR敲除背景下，磷酸化的PhoP也能促进afsS转录，但强度低于AfsR，推测可能在不同的时期阶段或不同的环境条件(磷酸盐浓度变化)，PhoP和AfsR先后调控afsS转录，AfsS调控因子进而影响次级代谢产物的合成[48]。体外EMSA实验也进一步证实：随着PhoP蛋白浓度增加，PhoP能够将AfsR从afsS启动子区解离下来[34]。AfsR/PhoP/AfsS三者之间相互影响(图 2)，当链霉菌胞内磷酸盐充足时，AfsR发挥主要作用，抑制phoR-phoP和pstS的转录表达；当链霉菌处于磷酸盐“饥饿”状态时，PhoP蛋白被活化，作用于含有特异性结构(DRus)的基因启动子区，包括与AfsR竞争性的结合到afsS基因的启动子区，启动afsS的转录。
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| 图 2 AfsR/PhoP/AfsS三者之间的调控网络关系 Fig. 2 Cross-talk regulation of the AfsR/PhoP/AfsS systems |
磷酸盐是所有微生物的一个重要结构组分，贯穿链霉菌的整个生命活动周期中。与初级代谢相比，链霉菌的次级代谢途径并不是必需的，但从进化的角度来看，当环境中的营养因子，如磷酸盐含量逐渐降低，出现“饥饿”状态且不能够继续维持链霉菌自身正常的生长时，链霉菌开始合成抗生素或其他次级代谢产物，这些抗生素可能作为一种拮抗剂杀死其他的微生物，减少消耗营养物质的竞争者，帮助链霉菌度过营养匮乏的生存环境。链霉菌主要是通过PhoR-PhoP双组分信号转导系统感应环境中的磷酸盐，磷酸化的PhoP蛋白一方面激活参与摄取和转运磷酸盐的一系列基因的表达，向胞内补充无机磷酸盐；另一方面短暂的降低中心代谢活动和形态发育分化，间接的抑制次级代谢产物合成，从而减慢无机磷酸盐的消耗。在工业生产方面，既要保持工业菌株良好的生长态势，又要为了获得更高产量的抗生素，所以发酵培养基中无机磷酸盐的含量及比例显得尤为重要，本文对链霉菌理性工程改造磷酸盐信号通路提高抗生素产量具有一定的指导意义。
链霉菌具有复杂的形态发育分化过程，并且能够合成丰富多样的次级代谢产物，如抗生素、免疫抑制剂、杀虫剂和多种胞外水解酶等，其中以抗生素药物最为突出，接下来对链霉菌次级代谢产物的筛选、挖掘和定向改造仍然是链霉菌领域研究的核心和热点[49]。随着DNA测序技术的发展，越来越多的链霉菌基因组被公布、越来越多的次级代谢合成基因簇包括大量隐性基因簇被发现，同时人们也在不断地揭示链霉菌自身存在的非常庞大复杂的调控网络，包括多种代谢调控途径，如全局性调控、多效性调控和途径特异性调控等[50]。总之，这些都将有助于人们未来在链霉菌中发现越来越多新的有价值的天然产物。
致谢：感谢中国科学院微生物研究所王为善助理研究员和李肖博士对本文的修改和提出的宝贵建议！
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