在Mdm2/MdmX-p53途径中，Mdm2(murine double minute 2,又称为Hdm2)作为p53的下游靶基因，通过两种机制调节p53。首先N-Mdm2(Mdm2的N端p53结合域)与p53 TAD区域(转录激活结构域)结合阻碍p53的转录激活；其次Mdm2作为E3泛素化酶，可以介导p53的泛素化降解及其空间定位。MdmX(murine double minute X,又称为Hdm4)也可以通过其N端的p53结合域(Mdm2的同源域)与p53相互作用。MdmX可以作为Mdm2的泛素化靶蛋白被降解，也可以与Mdm2形成异源二聚体Mdm2/MdmX复合物(这与两者的锌指结构域有关，构成了p53泛素化的重要的E3连接酶)。Mdm2/MdmX-p53途径在一些USP(ubiquitin specific protease)家族去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)作用下，可以稳定这三种蛋白质，通过去泛素化的差异性，使调节更为精确^[1]。p53能够诱导Mdm2的表达，在某些选择条件下也可以诱导MdmX的表达^[2]，也就是说p53能够诱导产生它的负调控因子。在转录修饰水平上，为应对细胞压力，会产生Mdm2和MdmX的相关剪切异构体，如Mdm2-ALT1和MdmX-ALT2，因为p53结合区域丢失也就丧失了对p53的调控^[3]。在翻译后修饰水平，相应伴随着p53的脱乙酰化及去磷酸化作用，可维持Mdm2/MdmX-p53的动态平衡^[4]。肿瘤的发生与这种平衡的破坏密切相关，因此，针对Mdm2、MdmX 在N端的p53结合域的分子抑制剂的研发早已成为肿瘤药物开发的热门。Mdm2的专一性抑制剂研究已取得了较大进展，但MdmX的专一性抑制剂研究进展缓慢。由于Mdm2和MdmX在N端的结构相似性，Mdm2/MdmX双抑制剂的设计也成为了一种药物设计策略。建立新型的药物筛选蛋白模型，在天然化合物库中筛选出全新的药物骨架，结合蛋白质与药物的构效关系，改造成全新的抗癌药物可以作为今后Mdm2/MdmX-p53靶向治疗的有前景的方向。

肿瘤抑制因子p53不仅在细胞正常生长过程中发挥关键作用，其基因变异或功能性失活还与多数人类肿瘤发生紧密相关^{[5, 6, 7]}。在正常细胞生长过程中，p53有着“分子警察”的作用，当基因受损时，p53暂停细胞分裂，让细胞获得足够时间修复受损基因，如果基因无法修复，则激活细胞自我凋亡机制(apoptosis)，避免细胞癌变(图 1)。在近半数人类癌症细胞中，p53基因发生变异，造成p53失活^[8]，在另外近半数癌症细胞中，p53基因并没有发生变异，但p53蛋白活性受到过量表达的负调控因子Mdm2和MdmX抑制，过量的Mdm2泛素化作用也进一步降低p53浓度^{[9, 10]}，不论p53因突变失活还是其活性受到抑制，都会失去对基因组的保护，细胞无法修复受损基因，进入恶性分裂而诱变癌症。

图 1 Mdm2/MdmX-p53信号途径调控机制 Fig. 1 Mdm2 / MdmX-p53 signaling pathway regulating mechanism Loss of p53 activity (as gene mutation) or decreased activity (as unduly inhibition of Mdm2/MdmX) will can't protect the integrity of the genome and cause cells to become cancerous

图选项

从结构特征上分析，Mdm2和MdmX二者的构成和构象高度相似，其中只有其N端结构域(约有110个氨基酸序列)与p53的N端15个氨基酸短肽序列结合(在此所指Mdm2和MdmX特指其N端结构域)，但二者通过既相互协同又相对独立的调控机制精确地控制细胞中p53的浓度和活性，确保细胞分裂生长平衡。MdmX主要控制p53蛋白活性，而Mdm2则控制p53蛋白结构的稳定性^{[11, 12]}，但是，过多的Mdm2和MdmX不仅抑制p53蛋白活性，而且会导致p53基因进一步突变或缺失，恶化细胞癌变^[5]。因此，Mdm2/MdmX-p53相互作用位点是当今世界上癌症药物设计热门靶点之一，为通过以激活p53蛋白活性而杀死癌细胞为原理治疗癌症提供了一种新的途径。临床研究结果表明，含有野生型p53蛋白的肿瘤细胞对放射疗法和化学疗法更敏感，对癌症治疗有更好的疗效^[13]。

在发现MdmX之前,Mdm2抑制剂设计已取得了很大进步，最有代表的是nutlin和MI-219。过去认为只要抑制了Mdm2就足以恢复癌细胞中p53蛋白的活性，但越来越多的研究表明，只使用Mdm2抑制剂不仅达不到预期效果^{[5, 12]}，而且癌细胞会产生抗药性，产生抗药性原因之一在于细胞迅速启动补偿途径，包括p53变异^{[14, 15]}和诱发MdmX过表达^[16]。突变试验证明，MdmX比Mdm2更能有效控制p53的活性^[17]。更重要的是，临床研究表明，许多癌症，包括肝癌、喉癌、视网膜癌，神经母细胞瘤和乳腺癌等主要是由过多表达的MdmX引发的(表 1)^{[5, 18]}。目前，有关Mdm2/MdmX调控机制与肿瘤的关联性仍然是炙热领域，2013~2015年美国NIH就批准129立项(不包括其他机构资助项目)，与2013年NIH项目性质相比，近年来的重点已转向于Mdm2/MdmX抑制剂在各种肿瘤中对信号途径调控机制影响的研究，以及双功能抑制剂设计和抗肿瘤研究。同样，在国内，自1997年国家基金批准第一项关于Mdm2基因与肿瘤相关性研究以来，2013~2015年获批项目呈指数增长，有关抑制剂的研究已引起研究人员重视。因此，靶向Mdm2/MdmX-p53相互作用位点的有效抗癌药物应该能够分别或同时抑制癌细胞中的Mdm2和MdmX^{[5, 19]}。

随着Mdm2/MdmX在肿瘤发生过程中作用的逐渐明确，研究人员更感兴趣Mdm2/MdmX靶向抗肿瘤药物的设计及临床应用。虽然通过基因疗法引入活性p53^{[20, 21, 22]}和通过药物恢复变异p53活性^{[8, 23]}激活细胞自我凋亡机制、杀死癌细胞等策略具有临床意义，但对近半数含有野生型p53的癌症，解除Mdm2和MdmX对p53的抑制、增加癌细胞中活性p53的含量、激发细胞自我凋亡机制而杀死癌细胞，更是近10年来靶向抗癌药物设计的热点。通过高通量筛选小分子化合物库和虚拟化合物库，Mdm2抑制剂设计取得了很好的进展^{[24, 25]}，许多已进入临床研究(表 2和www.ClinicalTrials.gov)。Roche公司最先开发出有效Mdm2抑制剂nutlin-3a分子，这种顺式咪唑(cis-imidazoline)框架结构化合物能够高效抑制Mdm2与p53的结合(Kd值大约为19nM)，癌症动物实验证实nutlin-3a能够有效减小肿瘤体积^[26]，其改进型分子(RG7112)即将进入II期临床研究^[27]。其他机构也开发出不同结构框架的Mdm2抑制剂，包括 Michigan大学的MI-219和MI-773小分子^[28]，J&J 公司的TPD222669小分子^[29]、Pittsburgh 大学和Max Blanck生化研究所共同研发的PXN727^[30]、Amgen公司的AM8553分子^[31]，Zhuang等设计的新型抑制剂^[32]和Wang等^[33]合成的小分子抑制剂。令人遗憾的是，这些抑制剂仅对Mdm2具有高亲和力，与MdmX的结合作用非常微弱。近期，Roche团队设计出一种新型小分子双抑制剂，可促进Mdm2和MdmX形成二聚体^[34],这为同时有效抑制Mdm2和MdmX提供了一种新策略。另外，基于优化p53多肽设计的多肽双抑制剂对Mdm2和MdmX都有较高亲和力^[35]，但由于多肽的药代动力学存在局限性，其临床研究还没有引起重视。

尽管Mdm2和MdmX结构高度相似，但高通量筛选高亲和力MdmX抑制剂依然没有进展，依据Mdm2抑制剂设计MdmX抑制剂也无明显进展，其主要原因在于：

(1)二者的结合区域具有不同的构象特征；

(2)Mdm2抑制剂的刚性框架结构不顺应MdmX的结合面；

(3)过去抑制剂筛选的策略在于追求高亲和力先导化合物，忽视可能存在着多种不同结构框架的潜在化合物，这些潜在化合物的亲和力在微摩尔浓度范围，但却是药物分子设计的最佳先导化合物。因此，新型MdmX/Mdm2抑制剂的筛选和设计应当改变策略，在实施新设计策略过程中，应当充分了解Mdm2和MdmX与现有Mdm2抑制剂的构效关系，建立新型高通量筛选用蛋白模型。对p53多肽与Mdm2和MdmX结合特点分析发现，MdmX与Mdm2构象非常相似，蛋白质表面存在三个特征性结合位点，分别与p53p的三个氨基酸残基F19、W23和L26结合，因此，分别命名为F19、W23和L26结合位点[图 2(a)、(b)]。Vassilev等^[26]测定了Mdm2与nutlin-2a(一种nutlin-3a类似物)的复合物晶体结构，结果显示，Mdm2与nutlin-2a结合界面与p53肽的结合界面非常相似，Mdm2蛋白表面存在较深的刚性界面，nutlin-3a分子的三个官能团与p53p的三个重要残基非常匹配[图 2(c)]，但Mdm2的L26的结合点发生明显变化(主要发生在Tyr99残基构象)。Sanchez等^[36]利用核磁共振技术分析MdmX与nutlin-3a的相互作用时，发现MdmX构象与Mdm2有明显差异，在自由态时MdmX构象比Mdm2柔软。尽管p53肽可以很好地与MdmX表面结合，但nutlin-3a分子仅能与MdmX部分表面结合。通过高分辨率NMR结构分析，我们观察到MdmX和Mdm2与nutlin类似物作用时，两者结合界面存在显著不同的特征，与MdmX/p53肽复合物结构比较，MdmX与nutlin类似物结合时蛋白质构象发生了较大的变化，主要变化发生在L26结合位点^[37]。Popowicz等^[38]首次测定了MdmX与一种非nutlin类似物的小分子化合物(WW298)的复合物晶体结构，结构显示，MdmX与小分子分子的结合界面与MdmX与p53肽的结合界面在L26结合位点有所不同，这些特征性变化表明不同分子与MdmX结合时，会诱导MdmX蛋白构象发生变化。可见，小分子与Mdm2和MdmX结合时存在着不同的结合机制。这种结合机制差异为进一步探讨小分子与蛋白质相互作用靶点的结合机制、设计新型抗癌药物提供了研究机遇。因此，设计MdmX抑制剂和Mdm2/MdmX双抑制剂非常具有挑战性，新的思路应当首先考虑依据Mdm2和MdmX结构相似性和差异性(尤其是L26结合位点)，应该考虑新的筛选方式，也应考虑利用新型化合物库(如中药天然化合物库和微生物药物库)和片段库筛选新型框架结构先导化合物及功能结构片段，还应考虑利用热力学、动力学和结构生物学原理进行合理设计等策略。

图 2 Mdm蛋白与相关抑制剂的复合物结构模型 Fig. 2 The structure modeling of Mdm proteins complex with inhibitors The three binding sites of Mdm2 (a) or MdmX (b) and p53 peptide (p53p),are usually named L19，W23 和F26. Both of the structural models respectively are taken from lycr and 3dab of PDB database,drawn by Pymol software. The Mdm2/nutlin-3a crystal structure (c) shown that the three functional groups of nutlin-3a are very match with the key amino acid of p53p. The nutlinagalogue H109 also quite match with the three binding sites (This structure is a schematic diagram of the molecular docking structure[33],the crystal structure is being tested)

图选项

基于nutlin-3a对Mdm2有较强亲和力的优点，充分利用MdmX与Mdm2蛋白结构相似性特点，探索研究Mdm2与MdmX之间结构和功能差异性，比较这两种蛋白质与nutlin-3a及其类似物结合机制的差异性对开发新型抗癌药物有非常重要的指导意义。近期，本课题组依照nutlin-3a的结构框架，以增强nutlin官能团的疏水性和引入分子间氢键为目的，同时采用结构生物学数据对nutlin-3a分子进行优化，尽管没有获得MdmX专一性抑制剂，但得到了一种高亲和力Mdm2/MdmX双抑制剂(命名为H109，表 3)，H109能有效活化癌细胞中的p53，激活癌细胞自我凋亡^[39]。H109分子设计成功为进一步探讨如何设计MdmX专一性抑制剂提供了可行性。

表 3 比较H109、nutlin-3a和p53肽与Mdm2和MdmX的结合力(Kd，μm) Table 3 Compare the binding force between H109,nutlin-3a,p53p and Mdm2,MdmX (Kd,μm)

Name	Structure	Mdm2/MdmX
nutlin-3a		0.019/6.5
H109		0.006/0.027
p53-peptide	SQETF19SDLW23KLL26PEN	0.13/0.42
Nate:Data above comes from our group

表选项

许多现代药物都是基于天然产物而开发的，预计天然产物在未来一段相当长时间内仍继续作为新药先导化合物的主要来源^[40]。近年来，海洋天然产物在新药发现中的利用也引起了重视^{[41, 42]}。另外，微生物次级代谢产物也能提供巨大的天然产物资源，随着微生物基因组学和代谢工程学研究的突飞猛进，微生物天然产物将在新药发现中表现出巨大潜力^{[43, 44]}。许多天然产物对细胞生长周期有专一性靶向抑制作用，已有不少抗癌药物就是基于这些先导化合物开发出来的^{[45, 46]}。相比传统的高通量筛选方法，有效的药物开发策略将在于先导化合物和生物活性介导的结构优化相结合的设计策略^[45]。尽管目前普遍接受组合化学在先导化合物的发现过程中已不再如预期的那样万能，但利用组合化学合成方法改造天然产物先导化合物仍将是新药设计的有用方法^[40]。近期，我们利用组合化学方法对Mdm2抑制剂nutlin分子进行小规模优化文库筛选，已成功设计出几种Mdm2/MdmX双抑制剂^[39]。随着我国中药天然成分库(上海和昆明基地)及微生物天然产物库(武汉基地)的建立和壮大，将增强我国自主开发创新药物的能力。今后，以设计新型MDM2/MdmX靶向抗癌药物为目的，建立利用结构生物学、热力学、动力学及药物分子的多价效应等原理筛选和优化天然药物先导物的新策略，也许能够加快靶向新药设计进程。

今后对Mdm2/MdmX-p53的研究将集中在以下几个方面。在细胞分子方面，某些精确调控Mdm2/MdmX-p53途径的发现及机制研究，如某些重要靶蛋白的发现将为药物的设计提供新的靶点，补充动物模型及生物信息学相关的作用网络，使分子相互作用图谱更为完善；在药物设计方面，通过结构生物学研究，以现有药物骨架为基础筛选出亲和力更高的药物，或以天然产物库为基础筛选出全新的药物骨架，综合生物、化学、物理等方面理论，设计新型药物，如stapled peptide (SAH-p53 peptide)，弄清现有药物的构效关系和作用机制，对解决药物抗性、临床应用等问题都有重要意义；另外，今后关于MdmX的专一性抑制剂的研究将会是Mdm2/MdmX-p53途径抑制剂的重点及难点，且MdmX的专一性抑制剂和Mdm2/MdmX双抑制剂的临床研究也会为癌症的治疗提供新型药物。