微小RNA(miRNA)是一类高度保守的、长18～25个核苷酸的内源性单链非编码小分子RNA^[1]。miRNA广泛存在于真核生物中，本身不具有开放阅读框架，不编码蛋白质；miRNA具有成簇排列特点，簇生的基因常常具有协同表达的特性^[2]；miRNA在物种间还具有高度的保守性、时序性和组织特异性。已有令人信服的证据表明某些miRNA会直接参与肿瘤的形成^[3]。近年来，随着人类基因组计划的实施和大规模测序平台广泛应用，人们对非编码RNA的理解逐渐加深：人类基因组绝大部分都被转录成RNA，细胞内非编码RNA的数量是编码RNA的上百倍。这促使许多科学家认为生物体复杂性隐藏在它们所输出的非编码RNA内，而不是编码序列内。这类具有调节作用的小RNA分子成为近年来研究的一大热点。本文就miRNA在肿瘤诊断和治疗中的国内外研究进展作一概述。

血清中的miRNA习惯上称为循环miRNA，循环miRNA的来源目前尚不完全清楚，最新的研究结果提示，循环miRNA可能来源于组织细胞的主动分泌。Valadi等^[4]研究发现。成熟的miRNA在细胞内被脂质或脂蛋白包被成外泌体exosome，然后分泌至胞外并进入血液，进入血液的exosome经细胞内吞进入受体细胞并去包被，释放出miRNA发挥生物学功能。exosome介导的细胞间miRNA的交换，是细胞通信的一种新的途径，对维持体内微环境的平衡有重要作用。与其他肿瘤检测方法相比，循环miRNA具有较高的特异性，能比较明显地区别正常人群和肿瘤患者；检测方法简便、易行且成本低。循环miRNA具备肿瘤标志物的特点：首先，miRNA参与肿瘤发生、转移的各个阶段，且在每一个阶段都有相应的基因表达变化，同时也有调控这些基因的miRNA发生变化，同一种肿瘤在发生、发展不同分期阶段具有不同的miRNA表达谱^[5]；其次，不同肿瘤具有各自特异性的miRNA表达谱，这些表达谱能够反映肿瘤组织的发展与分化状态，并可根据特异性miRNA的表达水平确定大多数低分化肿瘤的组织或器官来源。再者，循环miRNA提供了一种非损伤性的肿瘤诊断手段。

研究表明，循环miRNA表达的变化与多种肿瘤关系密切，如血清miR-195在患乳腺癌女性中表达增高。与淋巴结阴性乳腺癌相比，血清let-7a水平在淋巴结阳性乳腺癌女性中降低，而与雌激素受体(estrogen receptor，ER)阳性乳腺癌对比，血清miR-10b和miR-21水平在ER阴性乳腺癌中增高^[6]。进展期乳腺癌患者血清miR-21水平高于早期乳腺癌患者^[7]，此外，血液中的miR-21在肺癌^[8]、食管癌^[9] 中高表达。Huang等^[10]证实，相对于健康人，结肠癌患者血清中有69种特异性miRNA存在。此外，他们还证实了一组由14种循环miRNA组成的独特表达谱在结肠癌中表达，却不在肺癌中表达。与健康志愿者相比，结肠癌患者血清中miR-17-3p和miR-92水平显著增加。特别是，miR-92在激惹性肠疾病中表达不增高，在腺瘤和结直肠癌中表达增高，而且在晚期结肠癌中明显增高。Chen等^[11]在对400例非小细胞肺癌和220例正常人的血清对比研究中发现：miR-20a、 miR-24、 miR-25、 miR-145等10个miRNA显著差异表达，进一步的分析表明，这些差异表达和肿瘤的分级密切相关，这10个miRNA可以作为潜在的临床诊断标志物。

Kota等^[12]报道肝脏中有多种miRNA与肝细胞癌发生相关，其中miR-15a、miR-16、miR-26a表达显著下调；这些差异表达的miRNA可作为预诊断肝细胞癌的指标。Ji等^[13]通过对455例接受治疗的乙肝病毒感染的肝癌患者的跟踪研究发现，在miR-26表达较低的患者接受干扰素治疗后，5年生存率由30%左右提高到65%左右，而miR-26表达较高的患者无论是否接受干扰素治疗，5年生存率相似。miR-26的表达水平可以作为判断肝癌患者是否适宜接受干扰素治疗的重要筛选指标。此外，循环miRNA在胃癌^[14]、前列腺癌^[15]、食管癌^[16]、膀胱癌^[17]、卵巢癌^[18]、鼻咽癌^[19]等多种肿瘤的早期诊断中均有研究报道。

虽然大量研究表明miRNA在肿瘤中表达失调，但要揭示miRNA在肿瘤中的基因调节作用并将其用于改善治疗的方法，仍需要对其生物学与分子功能进行评估，以及对其潜在临床应用进行深入研究。接下来我们就近年来以小鼠肿瘤模型为研究对象，通过过表达或敲除某些特定的miRNA来研究其在肿瘤或癌细胞转移中的生物学及分子功能的相关研究作一综述。同时概述近年来关于将这一重要调节方式用于临床治疗的研究，包括直接治疗肿瘤及作为传统化疗中使肿瘤细胞增敏的手段两个方面。

在许多不同疾病中个别miRNA会发生失调，并逐渐明确了miRNA在不同肿瘤中所发挥的作用。目前，已培育出一系列缺失或过表达的肿瘤相关miRNA的小鼠(表 1)，值得注意的是，大多数miRNA失调的小鼠模型存在免疫缺陷，同时这些模型中有些会发展形成造血系统肿瘤，在某些环境下形成实体瘤。

目前普遍认为miRNA的异常表达与肿瘤密切相关，小鼠模型更为这些miRNA与肿瘤之间存在联系这一观点提供了证据。越来越多的研究表明，这些miRNA分子有可能作为一种有效的肿瘤治疗靶点。下面列举一些最有希望用于体内的基于单一miRNA的疗法。

肿瘤抑制基因的缺失是肿瘤发生过程中非常普遍的现象。重新表达缺失的肿瘤抑制性miRNA在肿瘤治疗中有极大的应用前景。一个常见的例子就是let-7，其在多种肿瘤中表达下调^[35]。let-7的基因缺失及其合成过程损伤是导致成熟let-7水平下降的两个原因^[36]。因此，在某些肿瘤治疗中恢复let-7的表达能起到良好的疗效。非小细胞肺癌(NSCLC)可诱导的Kras^LSL-G12D/+原生性模型中，在Kras^G12D表达的同时能将let-7a或let-7g传递至肺部^[36]，这能将肿瘤体积减少66%。通过向肿瘤内传递let-7b能明显减小异种移植瘤的体积^[37]，与通过慢病毒颗粒于鼻内递送let-7a或用基于中性脂质体的于全身递送let-7b^[37]对Kras^G12D/+肺部肿瘤大小的影响类似。对其他异种移植瘤的研究也进一步支持了let-7替代疗法在肿瘤治疗上的潜在应用^[38]。

在肿瘤中，一些靶向癌基因KRAS的miRNAs，级联激活KRAS，活化RAS反应原件结合蛋白(RREB1)，这直接抑制了包括编码miR-143和miR-145的miRNA簇的转录。在一种正向反馈机制中，miR-143和miR-145分别抑制了RREB1和KRAS的表达^[39]，通过转录上调细胞内的miR-143和miR-145或脂质体的递送系统在皮下或异种移植瘤中下调了KRAS和RREB1的表达^[39]。在正常的细胞中，需要一种miR-143/145和KRAS之间精细调控的平衡，而在胰腺癌、膀胱癌、肺癌、结直肠癌中失去了这一miRNA簇^[36]，或者KRAS水平的升高扰乱了这一平衡，导致了肿瘤的发生。

与其他一些miRNA相比，miR-143和miR-145的角色因细胞类型而异，在肝癌和不同复发病例的乳腺癌组织中，miR-143的表达显著上升。然而，在对一个744例肿瘤样本的分析中发现，miR-143/145是普遍缺失的簇，这表明：这个miRNA簇的癌基因的角色是例外的。显然，在利用这些相反结论的miRNAs用于治疗之前有必要进行个体化的miRNA表达谱研究。

p53通路中涉及的多个miRNA已经被用于评估治疗效果。被p53转录诱导后，miR-34刺激凋亡或细胞衰老，诱导细胞周期G₁期阻滞进而防止肿瘤转移。类似于let-7，miR-34被多种机制所抑制，包括启动子甲基化而导致的表观沉默、基因组不稳定性导致的等位基因的丢失和p53突变^{[40, 41]}。由于miR-34在各种肿瘤中经常表达下调，不同的实验室已经开展了miR-34替代治疗的研究^[36]。

不仅在肺癌研究中开拓性的使用了miR-34，在包括像前列腺癌、胰腺癌等有p53突变或者miR-34低表达的其他肿瘤中也可以考虑miR-34替代治疗^[36]。从异种移植瘤和原位肿瘤分离纯化出来的前列腺癌干细胞亚群中，miR-34的表达水平是下调的。在肿瘤干细胞中增加miR-34的表达抑制了细胞的克隆形成、肿瘤再生和转移。

miR-26a在肝癌中的表达也是降低的^[36]。在肝癌模型中miR-26a有效的阻碍了疾病的进程^[12]。同样，miR-26a的表达水平在鼻咽癌和淋巴瘤中也是降低的^[36]，在这两种类型的肿瘤中，miR-26a的恢复通过G₁期细胞阻滞，并通过组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶EZH2，来降低细胞增殖和克隆形成能力。相反，miR-26a是通过抑制PTEN促进T-ALL的5个单独的miRNA之一。在Notch1激活突变的情况下，miR-26a的过表达比包括miR-20、miR-19、miR-92等在内的其他较强致癌性的miRNA更能降低T-ALL的潜伏期。实际上，在利用miR-26a进行体内治疗型应用时应考虑本文中所提到的miR-26a的功能。

miR-122是一个与高血浆胆固醇水平相关的miRNA，被认为可以减少肝癌转移^[36]。降低的miR-122水平与肝癌的肝内转移及肝功能损伤有关。虽然在原位肝癌模型中，重新表达miR-122减少了肿瘤发生、血管生成和转移潜能，但在肿瘤中以小鼠为研究对象系统性递送miR-122的研究尚未见报道。然而，已经在HCV感染的非人灵长类动物中^[42]系统递送miR-122反义序列实现抑制丙型肝炎病毒血症，并在小鼠体内降低血浆胆固醇水平^[43]。

尽管miRNA在大多数肿瘤中的表达经常是下调的，但是针对一些表达上调的miRNA，如miR-10b,可以采用miRNA反义序列作为体内治疗的方式。早在2005年，Krutzfeldt等^[44]通过静脉注射miR-10b的反义抑制剂在多个器官削弱了多个miRNA的功能。此外，miRNA在丙型肝炎病毒感染的非人类灵长类动物的沉默是成功的，且无毒性^[42]。最近，在体内研究的证据也支持在肿瘤中使用反义抑制剂序列能有效地抑制肿瘤。全身静脉递送antagomir-miR-10b到高表达miR-10b的荷瘤小鼠，抑制了4T1乳腺癌细胞的肺转移。miR-10b拮抗剂在治疗原发肿瘤上并没有明显的效果，但减少>80％肺部转移^[45]。miR-10b拮抗剂治疗的关键是在肿瘤外渗前的几个阶段。因此，miR-10b拮抗剂可以阻止miR-10b升高的高侵袭性肿瘤的转移，但可能对已有的转移性病灶无效。

由于使用单一miRNA治疗肿瘤的可能性已被广泛研究，接下来对多种miRNA联合疗法的研究将受到更多的关注。使用多种肿瘤抑制性miRNA靶向单个基因或一系列基因能增强疗效，因为这样可以减少癌细胞的耐药性。例如，一个致癌基因3′UTR的单突变能扰乱其与特定miRNA的结合；然而，混合2种或3种miRNA靶向同一个基因则可减少这种突变引起的耐药性的可能。此外，使用miRNA拮抗剂技术同时靶向上调的miRNA证明具有良好的疗效。

由于miRNA具有在肿瘤中经常影响信号通路的能力，miRNA或antagomirs在常规肿瘤治疗中用于增敏抗性细胞的潜力逐渐成为研究的热点。

miRNA靶向涉及编码肿瘤中的多药耐药基因，这能够增加肿瘤细胞对化疗的敏感性。多耐药抗性通常涉及一个通过ATP-结合盒转运蛋白增加药物的外排。其中两个蛋白质，ABCC3和ABCC6，直接由SOX2诱导^[46]。因此，SOX2表达升高时，细胞间接地将药物泵回细胞外环境中。最近Kim和他的同事们鉴定出miR-9是SOX2的一个负调控者，在一个化疗抗性的胶质瘤细胞中表达miR-9^*抑制了SOX2的表达(SOX2也是能够诱导多能干细胞的几个转录因子之一)，导致了ABC转运子表达的抑制，因此提高了药物的维持力。

已有研究证明miRNA能够增加肿瘤细胞对他莫昔芬治疗的敏感性，他莫昔芬是一种广泛使用的选择性雌激素受体调节剂(SERM)。他莫昔芬治疗虽然对许多人有效，但它可能会导致乳腺癌复发。Erα表达的丢失或降低导致抗性的增加，这对过表达酪氨酸激酶受体ERBB2的肿瘤患者是个大问题，它能够促进生长和分化，ERBB2诱导生存的一个机制涉及肿瘤抑制者miR-15、miR-16，miR-15和miR-16的直接抑制，致使抗凋亡基因Bcl-2的恢复表达^[47]。ERBB2也诱导oncomir miR-21，这表明miR-21的拮抗剂也可能进一步增敏他莫昔芬对肿瘤细胞的作用。miR-342具有类似的研究结果，miR-342在他莫昔芬抗性的细胞中是低表达的；过表达miR-342增加了他莫昔芬诱导的凋亡^[48]。此外，高表达的miR- 221/222簇通过下调细胞周期抑制剂p27^kip1，恢复他莫昔芬诱导的细胞凋亡^[50]。如果这些数据在体内得到证实，miR-15、miR-16、miR-342及anti-miR -221/22可用于增强他莫昔芬的敏感性。

在化疗抗性的肿瘤中，靶向细胞生存信号通路的miRNA经常是降低的，它们的再表达为肿瘤的化疗提供了一个良好的机会。例如，过表达miR-23a增加了细胞对小分子表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂gefitinib的抗性^[50]。吉非替尼往往是一线治疗EGFR阳性肿瘤的药物，尤其是对有些肺癌和乳腺癌，通过抑制RAS和PI3K下游的信号，从而防止不可控的生长和增殖。然而，内表皮生长因子受体点突变，或激活RAS和PI3K信号通路的变化，可以减少吉非替尼的疗效^[51]。在肿瘤中，它的靶标是PI3K通路，但是有报道称，miR-126的水平在多西紫杉醇抗性的乳腺癌细胞中也有所下降^[52]，因此miR-126的替代治疗，也是对常规化疗药物的增敏。另外，使用let-7可以增加肿瘤细胞对吉非替尼的敏感，特别是那些具有KRAS等位基因激活的患者，因为let-7可以抑制这个通路^[54]，并且已知在体外能够增加对肺癌细胞的敏感性^[36]。

紫杉类药物治疗赋予药物抗性而导致的各种基因表达改变，已经发现其中的许多基因被miRNA所调控，如致癌的靶分子、有丝分裂原和应激活化蛋白激酶1(MSK1;受miR-148a调控)、CASP8和FADD样细胞凋亡的调节者(CFLAR，也称为C-FLIP，受miR-512-3P调控)，BCL- 2拮抗剂1(BAK1;受miR-125B抑制)，SIRT1和BCL-2(受miR- 34调控)及INO-sitol monophosphatase1(IMPA1;受let-7家族成员调控)^{[54, 55, 56]}。在所有的这些例子中，过表达单个的肿瘤抑制性miRNA能够增加肿瘤细胞对紫杉醇的敏感。相反，oncomir miR-135a的水平在卵巢癌、非小细胞肺癌和耐药紫杉醇子宫细胞中显著升高，然而，anti-miR-135的治疗在紫杉醇抗性的非小细胞肺癌异种移植瘤中恢复了对紫杉醇的敏感性，部分是通过直接抑制腺瘤息肉病杆菌(APC)的表达^[57]。

研究表明，5-氟尿嘧啶(5-FU)能够改变蛋白质编码基因的丰度。对5-FU处理的大肠癌细胞的miRNA表达进行了全面的研究，结果表明：miR-21的水平也可以预测治疗的反应，高的miR-21水平与差的治疗结果相关^[58]，一些治疗产生抗性的原因是miR-21介导的核心错配修复增变基因的下调^[59]。类似的结果在肺癌和前列腺癌中被发现^[60]。同样地，miR-21拮抗剂能够增加培养细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性^[59]。

此外，还有许多研究报道miRNA及其反义抑制剂能够增敏肿瘤的化疗^[61]。这种认识的进步将有助于指导临床发展基于miRNA在体内系统致敏的化疗。

虽然大量的研究报道循环miRNA可以作为潜在的肿瘤标志物，但目前尚存在以下几大问题：①miRNA表达谱尚不完善，需要更多的基础研究来充实；②大多miRNA在不同肿瘤均有相同的表达，尚需找到某种肿瘤特异表达的单个或多个miRNAs；③缺乏大样本、多中心的联合检测数据。miRNA与临床相关的研究领域起步还不到10年，miRNA作为一种潜在的肿瘤标志物，目前的迫切任务是规范这些研究所用的实验方法并探索实践新的检测方法，使其能被大多数研究机构接受。此外，还需进一步证实其坚实的可信性，以此获得权威部门的认可。相信不久的将来，随着越来越多的可靠数据的出现，miRNA作为肿瘤诊断的重要分子标志将会得到极大程度的认可和推广。

在肿瘤治疗方面，我们可以看到在不远的将来极有可能将基于miRNA的治疗引入临床。这些基因调控的关键分子不再是被曾经描述为“奇特”的新分子。它们类似于在调节许多生存信号通路上的蛋白质编码基因，本身受到诱变，在各种疾病状态中经常有矛盾的角色；区别在于它们不同的治疗潜力。从本质上讲，miRNA替代疗法可以做蛋白质编码基因替代疗法所做的，但相比较而言有较少的障碍需要克服。miRNA比编码蛋白基因小得多，因而，其细胞内的递送可以使用无潜在致病性的病毒或非病毒载体为基础的递送机制，而相对较大的蛋白质编码基因则需要使用基于病毒的递送机制。

针对miRNA的特异和安全的系统沉默有效工具已经开发出来。这些被看成是miRNA海绵的antagomirs吸收体内的miRNA，引起miRNA的降解，因而上调其靶基因^[62]。与标准反义miRNA序列的靶相比，反义miRNA序列抑制miRNA功能的能力有限，并且往往会产生毒性。迄今为止，antagomirs已被证明有效和有选择性的沉默miRNA功能并且只有很小的副作用。典型的例子包括在灵长类动物和小鼠模型上全身递送的antagomir-miR-122^[36]，以及在小鼠模型上对抗转移型肿瘤的antagomir-miR-10b^[45]。

多个研究组已经采用靶向和独特的方式开发了有效递送miRNA的机制，并取得了很大的成功。由于这些递送策略在最近被作为siRNA递送方式而综述过^[63]。我们将最低限度地涵盖这些内容，虽然最初研究证明可使用腺病毒^[64]和慢病毒^[36]作为miRNA的递送工具，然而，在临床研究中仍需要开发安全有效的递送工具。例如，将成熟的miRNA包裹在脂质体纳米粒子中(中性的或带电荷的)局部或系统地递送到肿瘤组织，它们能够被发现在肺部^[54]、胰腺^[65]、前列腺^[66]等部位积累，并且有效地调控其靶基因的表达。作为这方面工作的拓展，将这些粒子经过化学的或物理的修饰方便了miRNA的靶向分布和连续可控的释放，包括脂质体、聚合物、树枝状偶联分子等在内的粒子都在临床研究之中^[67]。此外，外部基团，如适配体以及提高癌细胞的细胞摄取的配基，也正在开发成用来直接靶向某一个特定组织的粒子^[36]。现在面临的一个主要问题是如何进一步完善化学修饰使其跨越组织屏障，特别是那些治疗胶质母细胞瘤的miRNA，虽然在体外和异种移植瘤研究取得了很大的成功，但由于miRNA很难跨越血脑屏障，这方面的研究仍然进展缓慢。

当然，我们要谨慎这些小分子在人体试验中可能出现的不良反应—独立于递送试剂之外的不良反应，即使这些miRNA直接递送到肿瘤部位的情况下，miRNA也可能够逃脱肿瘤细胞，并进入全身各个部位，甚至通过微泡胞吐或分泌的miRNA-Argonaute2复合物的形式进入到其他细胞^[68]。虽然这种直接递送miRNA的方式对有过度表达的肿瘤抑制性miRNA是有价值，但仍需对这些miRNA进行有效的监测。此外，虽然这对有过度表达的肿瘤抑制性miRNA有价值，但对它进行监测也很重要。可以肯定的是，miRNA的过表达可能导致miRNA机制和非特异性效应的饱和。以前的研究表明，当miRNA和siRNA的水平升高时，miRNA沉默的两个关键元件，exportin5和Argonaute2会消失^[69]。此外，由于Dicer不是一个独立功能的肿瘤抑制者^[33]，过表达的miRNA可能挫伤Dicer功能和诱发肿瘤多发的环境。不过，因过表达单一miRNA而减少Dicer功能的例子还未见报道。此外，增加细胞内miRNA的浓度可能会减弱内源性miRNA对其低亲和力靶的抑制。与目前的化疗一样，浓度和剂量表需要根据疗效、毒性及治疗后的长期影响进行评估。虽然有大量的文献表明，在各种动物模型中这些miRNA的毒性是有限的，但对其他miRNA和antagomirs仍需要进行严格的评估。仍需要大量临床试验来进一步评估这些在临床前取得成功的miRNA能否真正用于人类的疾病治疗。