脂肪酶(EC3.1.1.3.,lipase)是一类重要的水解酶，它可以催化水解、酯化和转酯化等反应，广泛用于食品、医药、化工及造纸等工业领域^[1]。枯草芽孢杆菌是常用的一种原核表达体系，适合于表达原核生物来源的脂肪酶^[2]，与大肠杆菌相比，具有安全性高和分泌性好等优点^[3]。

如何提高脂肪酶在枯草芽孢杆菌体系的分泌表达量是目前的研究热点。研究人员已经在改造宿主菌降低胞外蛋白酶水解作用^[4]，优化载体表达元件^[5]，改变表达方式提升表达系统稳定性^[6]，及发酵条件优化^[7]等方面进行了很多研究工作，显著提高了脂肪酶的分泌表达量。在脂肪酶表达分泌过程中，表达载体上的启动子影响着脂肪酶的转录效果，进而控制着蛋白质的表达量，而信号肽则影响着脂肪酶的分泌效率。因而选择合适的启动子和信号肽能有效提高脂肪酶分泌表达水平。沈兴中^[8]通过原位修饰方法将基因组上脂肪酶LipA基因启动子突变为强启动子序列后，分泌量提高了4.2倍。Lu等^[9]引入蔗糖诱导型启动子PsacB并在启动子上游添加增强子degQ，实现了酵母来源脂肪酶的高效表达。夏雨等^[10]以枯草芽孢杆菌自身外分泌脂肪酶LipA为模式酶，筛选宿主中常见的信号肽NprE、Bpr和YweA，结果显示Bpr信号肽优于其它信号肽，分泌量提高到原来的3.29倍。崔静等^[11]筛选枯草芽孢杆菌中的PdhA、SodA和Eno信号肽，结果显示使用PdhA信号肽后分泌表达量提高了21%。总体而言，目前枯草芽孢杆菌分泌表达脂肪酶研究报道中所选用的信号肽种类较少，也未见有系统性研究信号肽结构对脂肪酶外分泌效果影响的报道。

脂肪酶LipS是来自于嗜麦芽糖窄食单胞菌的脂肪酶(GanBank Accession Number: KC01461 6)，是一种耐溶剂脂肪酶，可高选择性拆分薄荷醇，具有很高的工业价值。为了实现脂肪酶LipS高效分泌表达，本文按信号肽结构的不同，对Sec途径中pel、ybpg、NprB、yvbx、lipB和yqfz信号肽，以及Tat途径中lipA和phoD信号肽进行了筛选，将最优的信号肽构入到诱导型表达体系中，提高总表达量后进一步对信号肽进行优化，提高分泌效率，显著提高了脂肪酶LipS的分泌水平。

表达宿主为Bacillus subtilis WB800、Bacillus subtilis WB800N，克隆宿主为E.coli DH5α，表达载体为pMA5、pHB43(pHT43突变得到)，质粒pMAlipSL(pMA5为载体，融合有lipS信号肽的脂肪酶LipS插入到Nde I和Nhe I之间)为实验室保存，而质粒pMApelL、pMAypbgL、pMANprBL、pMAyvbxL、pMAlipBL、pMAyqfzL、pMAlipAL、pMAphoDL、pHBphoDL、pHBphoDDRL、pHBphoDDFRL均为本文所构建。

实验中使用的PCR酶、限制性内切核酸酶、T4连接酶、DNA Marker等购自TaKaRa公司；卡那霉素、氯霉素和IPTG等药品购自上海生工生物工程有限公司；4对薄荷醇底物为实验室自行合成；其他化学试剂购自国药集团。

LB培养基和感受态制备所用培养基配方详情见参考文献^{[12, 13]}。

引物见表 1。

详细提取操作见Axygen细菌基因组提取试剂盒。

大肠杆菌和枯草芽孢杆菌感受态制备分别参照文献进行^{[12, 13]}。

以载体pMAphoDL构建为例，采用重叠PCR方法，以枯草杆菌B.subtilis WB800基因组为模板，用引物phoDAF/phoDAR克隆出信号肽片段，再以质粒pMAlipSL为模板，用引物phoDBF/phoDBR克隆出脂肪酶LipS基因片段，将两者分别纯化回收后，同摩尔比混合后充当模板，再以phoDAF/ phoDBR为上、下游引物，将片段融合，克隆出全长基因，片段前后酶切位点如图 1所示，纯化回收所需大小的片段后，与载体pMA5分别用内切酶Nde I和Nhe I双酶切，再次纯化回收，进行酶连操作，转化入大肠杆菌DH5α中，在抗性LB平板上筛选，经测序正确后的载体，转化入B.subtilis WB800菌株中，即得重组菌株。其他信号肽的表达载体只需要酶切替换掉phoD信号肽即可。所选取信号肽及特征见表 2。

图 1 穿梭分泌表达载体pMAphoDL的构建路线图 Fig. 1 The construction of the shuttle expression-secretion vectors

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构建方法与上述pMAphoDL构建方法类似，只是全长片段中引入的酶切位点不相同。使用引物序列见表 1中的phoD2AF/phoD2AR和phoD2BF/phoD2BR，全长片段与载体pHB43分别经内切酶Bam HI和Aat II双酶切后，插入到位点之间，经测序验证后，得到正确的重组质粒。

重组质粒pHBphoDDRL的构建，是以pHBphoDL为模板，用引物TUDRF/ TUDRR将原信号肽第25位上的天冬氨酸Asp突变为精氨酸Arg，经测序验证得到pHBphoDDRL载体。而重组质粒pHBphoDDFRL的构建，则以突变后的pHBphoDDRL为模板，用引物TUDFF/ TUDFR进一步将29位苯丙氨酸Phe突变为精氨酸Arg后得到。

重组质粒转化枯草芽孢杆菌方法参照文献^[13]。

组成型和诱导型表达载体液体培养条件均为37℃、200r/min，抗生素浓度分别为卡那霉素50μg/ml、氯霉素25μg/ ml，培养方式：挑单菌落入5ml含有对应抗生素LB液体中培养。12h后，以2%接种量转入到50ml含对应抗生素LB培养基中继续培养。组成型重组表达菌株，继续培养28h后，取样测定；诱导型重组表达菌株在OD₆₀₀达到0.80时，加入诱导剂IPTG至终浓度0.8mmol/L，在37℃，200r/min条件下继续培养20h，取样测定。

培养条件优化时，以上述培养条件为基础，对诱导剂IPTG浓度、诱导时机、诱导温度和诱导时间逐一进行优化，每一步最优条件带入下一步继续优化。

脂肪酶粉末制备：在发酵液或破胞液上清液(50mmol/L,pH 8.0的PBS缓冲液)中分别加入9.5%(m/V)乳糖做保护剂后，先预冻12h，再在－48℃、6Pa条件下冷冻干燥制得酶粉。活力测定：转酯活力测定方法参考文献^[14]。酶活力单位(U)定义：在测定条件下每分钟催化生成1.0μmol的l-薄荷醇乙酸酯所需要的酶量。

本实验室保存的含信号肽lipS的表达载体pMAlipSL，其信号肽与成熟蛋白质基因之间没有酶切位点，给后续载体构建工作带来不便，于是使用重叠PCR的方法，在中间引入Bam HI酶切位点，构建得到pMAphoDL表达载体。含其他信号肽载体构建只需要将对应信号肽片段插入到Nde I和Bam HI之间即可。阳性克隆PCR电泳验证图谱见图 2。条带大小均为1 600bp左右，测序也与对应序列一致，构建成功。

图 2 带有不同信号肽分泌表达载体阳性克隆PCR验证图 Fig. 2 PCR validation of the vectors with different signal peptides 1: LipS with pel; 2: LipS with ybpg; 3: LipS with NprB; 4: LipS with yvbx; 5: LipS with lipB; 6: LipS with yqfz; 7: LipS with lipA; 8: LipS with phoD

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在枯草芽孢杆菌中进行脂肪酶异源分泌表达时，常常遇到信号肽与所表达蛋白质不匹配的问题^[15]。如表 2第一行所示，脂肪酶LipS的信号肽lipS在枯草体系中并不能很好地引导脂肪酶LipS外分泌，胞外活力只占总活力的10.49%。因此本文首先对脂肪酶LipS分泌表达所适合的信号肽进行筛选，主要针对的是枯草中Sec和Tat途径信号肽，Sec分泌途径类型的信号肽约占总信号肽数的90 %，结构上分为带正电荷的N端，含有大量疏水氨基酸的H段和信号肽酶作用位点C端，筛选该类型信号肽时，由于有超过50%的该类信号肽N端电荷数为2^[16]，因此本文筛选时选取的Sec途径信号肽N端电荷数均为2，而选取不同H段疏水氨基酸数的信号肽；Tat途径信号肽是目前枯草杆菌分泌表达研究热点之一，因为该类型信号肽可以分泌表达折叠迅速和紧密的蛋白质，甚至可以分泌多亚基结构的蛋白质^[17]，该途径信号肽总数较Sec途径少，信号肽之间结构上的差异，规律性并不明显，因此本文选择研究较多的phoD和lipA信号肽为筛选对象。

如表 3所示，在Sec途径中，H疏水段长度为19的信号肽yvbx分泌效率最高达到20.43%，而H疏水段长度为18的信号肽NprB对脂肪酶LipS的分泌效果最好，此时发酵液酶活达到7.68U/L，分泌效率能达到19.26%。而该途径中过短与过长的疏水段长度的信号肽，对脂肪酶LipS分泌的效率都不是很高，含信号肽pel、ybpg、lipB和yqfz的重组菌分泌效率均在16%以下。在分泌过程中，H段疏水氨基酸会形成螺旋结构插入到细胞膜中^[18]，而脂肪酶LipS所融合的Sec分泌途径信号肽H段疏水氨基酸数在18个左右时，可能更有益于这个过程地进行，从而带来了更高的分泌效率。

从表 3最后两行结果可知，Tat分泌途径信号肽分泌效率普遍高于Sec分泌途径信号肽，均在20 %以上。其中使用phoD信号肽的重组菌分泌效果最好，胞外酶活力达到9.82U/L，分泌效率为24.29%，如图 3泳道9所示，分泌量要明显优于其他重组菌。经分析，各重组菌胞内脂肪酶也具有转酯活力，这说明胞内已经有折叠为正确结构的脂肪酶LipS存在了。这部分脂肪酶使用Tat途径信号肽进行分泌更具优势。

图 3 不同信号肽表达载体重组表达LipS发酵液上清SDS-PAGE分析 Fig. 3 SDS-PAGE analysis of recombinant expressed LipS with different signal peptides 1: WB800 (pMA5); 2: WB800 (pMApelL); 3: WB800 (pMAypbgL); 4: WB800 (pMANprBL); 5: WB800 (pMAyvbxL); 6: WB800 (pMAlipBL); 7: WB800 (pMAyqfzL); 8: WB800 (pMAlipAL); 9: WB800 (pMAphoDL)

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由于诱导型表达体系表达过程可控、短时间大量表达的特点而得到广泛应用。本文所用的pHT43就是广泛使用的一种诱导型表达载体^{[19, 20, 21]}，由于该载体携带的抗性与B.subtilis WB800自身抗性冲突，因此本节选用菌体特征相似，仅自身所携带抗性不同的B.subtilis WB800N作为诱导表达的宿主。结果如表 5所示，诱导型表达体系总活力得到明显提升，达到57.51U/L。

值得注意的是，对比表 4中的前两行数据，我们发现，改变表达方式后，分泌效率得到显著提升，由24.29%提升到61.26%。诱导表达体系产酶时间为20h，而组成型表达体系为28h，脂肪酶LipS是一种低温脂肪酶^[22]，在37℃下稳定性较差。诱导型表达体系，短时间内分泌表达，使得发酵液中脂肪酶LipS在高温下暴露时间缩短，胞外活力得到显著提升，表观分泌效率显著上升。为了证明温度是影响分泌效率的一个重要原因的假设，本文降低组成型表达体系培养温度到30℃，发现表观分泌效率确实得到显著提升。实验结果佐证了前文的假设。

研究表明，信号肽phoD能较好地将脂肪酶分泌到胞外，但仍然有一部分脂肪酶没有得到有效分泌，因此本文对phoD信号肽进行了突变，来进一步提高其分泌效率，从而提升分泌量。Pop等^[23]研究发现phoD信号肽中片段“DRRKFIQ GAG”对蛋白质分泌过程中发挥着重要作用，在对这10个氨基酸饱和突变时，发现+1位天冬氨酸“D”和+5位苯丙氨酸“F”突变为正电荷氨基酸精氨酸“R”时，可以很好地增强蛋白质前体与通道蛋白TatA_d的亲和性。因此本文利用该研究成果来增强蛋白质前体与通道蛋白的亲和性来提高脂肪酶LipS的分泌效率。选取前文所述两位点依次进行突变，得到重组载体pHBphoDDRL和pHBphoDDFRL，具体序列及活力数据见表 5。经研究发现，重组菌发酵液活力获得一定的提升，其中重组菌WB800N(pHBphoDDRL)发酵液酶活力达到39.53U/L，分泌效率提高到65.10%，重组菌WB800N(pHBphoDDFRL)发酵液酶活力最高，达到40.43U/L，分泌效率提高到66.30%，结果表明前体蛋白与通道蛋白之间亲和性的提升确实能够提高信号肽的分泌效率。

除了分子水平上的操作可以提升脂肪酶的胞外分泌量外，培养条件的改变也可以很直接地提高脂肪酶的胞外分泌量^[7]。本文通过对诱导表达过程中诱导剂IPTG浓度、诱导时机、诱导温度和诱导时间的优化，进一步提升了胞外分泌量。优化过程数据见图 4，最终优化条件为转接后在OD₆₀₀达到0.8时，加入IPTG终浓度至0.8mmol/L时，在30℃、200r/min摇床诱导培养25h时，发酵液活力达到最高，为62.07U/L，为原始重组菌株WB800 (pMAlipSL)的14.7倍，效果十分显著。

图 4 重组表达菌株表达条件优化酶活数据图 Fig. 4 Optimization of the lipase’sexpression condition of the WB800N (pHBphoDDFRL) (a) Effect of IPTG concentration on lipase production (b) Effect of induction opportunity on lipase production (c) Effect of temperature on lipase production (d) Effect of inducting time on lipase production

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优化的4个条件中，IPTG浓度最适为0.8mmol/L，过低无法充分诱导产出脂肪酶，过高则对菌体生长产生影响；诱导时机过晚比过早对表达的影响更大；诱导温度对优化前后影响最为明显，原始诱导温度为37℃、诱导20h时胞外酶活只有41.02U/L，而温度降低到30℃时，胞外酶活提升到56.02U/L，当温度提升到42℃时，胞外酶活大幅度降低，只有12.23U/L，由此可见诱导温度对脂肪酶LipS分泌表达具有显著影响，这种现象的发生与脂肪酶LipS的性质有一定关系，前文做过一定阐述；30℃下诱导25h发酵液活力最高，之后胞外活力变化不明显，脂肪酶LipS在该温度下较稳定。

本文以脂肪酶LipS为模式酶，结合信号肽结构特点对枯草芽孢杆菌体系中两个主要分泌途径共8种信号肽进行了筛选，并对Tat途径信号肽phoD进行了进一步突变优化，提高了该信号肽对脂肪酶LipS的分泌效率。此外，通过诱导型表达体系的替换与培养条件优化，显著地提高了表达量，进而提高了胞外发酵液中脂肪酶LipS的分泌量。

本文的研究工作为外源基因在枯草中进行分泌表达提供了思路，也丰富了枯草芽孢杆菌表达体系。此外，Tat分泌途径由于其可分泌大分子质量和多亚基结构蛋白等优点^[16]，成为了分泌表达研究的热点领域，而phoD信号肽是目前唯一确定严格采用Tat途径进行分泌的信号肽，对它的研究也越来越多^{[24, 25]}，相信以phoD信号肽为代表的Tat分泌途径信号肽将在蛋白质分泌表达研究中发挥更大作用。