黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)包含8个血清学亚群，由70多种病毒组成，其中40多种病毒与人类疾病相关，包括登革病毒(dengue virus,DENV)、乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)、黄热病毒(yellow fever virus,YFV)、墨莱河谷脑炎病毒(Murray Valley encephalitis virus,MVEV)和蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)等，其中大多数为蚊媒病毒。我国流行的蚊媒黄病毒主要包括乙脑病毒和登革病毒。乙脑病毒在我国除新疆、西藏和青海外，其他各省(自治区、直辖市)均有发病和流行，该病毒主要引起流行性乙型脑炎，感染人群以儿童为主，病死率高，近年来，青壮年和老年感染病例增多，引起了公共卫生领域的广泛关注。人感染登革病毒后可出现登革热(dengue fever,DF)、登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF)、登革休克综合征(dengue shock syndrome,DSS)。DF广泛分布于热带、亚热带的60多个国家和地区^[1]，近年来东南亚和美洲地区疫情日益严重，2012年，DF被列为全球最重要的蚊虫传播性疾病^[2]。

病毒复制子载体是在病毒全长cDNA感染性克隆的基础上，将大部分结构蛋白基因缺失或由外源基因替代，同时保留了病毒复制和翻译必需的重要元件组成的病毒亚基因组，在缺失大部分结构蛋白基因的同时克隆入多克隆位点(multiple cloning site,MCS)供外源基因插入。近年来，研究人员利用病毒独特的复制和基因表达策略将报告基因引入病毒基因组，缺失病毒某些元件构建病毒缺陷型复制子，这种缺陷型复制子导入细胞后，只有当某种特定病毒进入细胞后才会引发一系列病毒特异反应，进而启动报告基因的表达。通过报告基因的表达与否，实现对特定病毒的检出。因此该策略为我们提供了一种简单、快速并且更为特异的检测方法。Tzeng等^[3]构建了含有绿色荧光蛋白报告基因的病毒缺陷型RNA复制子，并对麻疹病毒的临床样本进行了检测，具有较高的特异性。Hossain等^[4]构建了含有荧光素酶报告基因质粒，经过筛选获得用于检测甲型流感病毒的MDCK细胞系。鉴于此，本研究以登革病毒4型感染性cDNA克隆P4质粒为分子基础，筛选获得了可用于蚊媒黄病毒检测的细胞BHK-Flavivirus。以细胞系为基础的检测方法可通过红色荧光蛋白mCherry报告基因表达与否，来实现对未知病毒细胞培养物中蚊媒黄病毒的快速鉴定。

Acc65 I限制性内切核酸酶购自NEB公司；BsiW I、Xho I等限制性内切核酸酶购自Fermentas公司；X-tremeGENE HD Transfection Reagent转染试剂购于Roche公司；DMEM培养基和胎牛血清、0.25%胰蛋白酶购于Gibco公司；SOC液体培养基购自索来宝公司；T4 DNA连接试剂盒、DNA Marker、PCR相关试剂均为TaKaRa公司产品。

以登革4型病毒的感染性克隆P4为模板，以△prME- F：5′-CGGGCGCGCCACGGCGTTACCAGAAACTCAGAAGGT-3′(下划线部分为Asc I酶切位点，未标记序列为P4基因组的5′端部分序列)和△prME-R：5′-CGCTCGAGCGTACGTGACCTTATTCTCCCCTTCAAG-3′(下划线部分分别为Xho I、BsiW I酶切位点，波浪线部分为保护性碱基，未标记序列为登革病毒结构基因C的3′端部分序列)为上、下游因引物，将PCR扩增的△prM-E基因片段和P4质粒经Asc I/Xho I双酶切后相连结获得缺陷型复制子P4-△prME。

以缺陷型复制子P4-△prME为骨架，将由质粒 pmCherry-N1经PCR扩增的红色荧光蛋白mCherry报告基因插入后获得含有红色荧光蛋白mCherry报告基因的缺陷型登革病毒复制子载体P4-△prME-mCherry。

将含有mCherry报告基因的真核表达质粒pCDNA3.1-P4-mCherry转染BHK-21细胞，使用脂质体法进行细胞转染，以终浓度600μg/ml的G418进行压力筛选14天后，将存活的阳性克隆扩大培养。取部分混合克隆细胞，使用系列稀释法筛选阳性克隆，如图 1所示，将200μl浓度为5.0×10⁴ cells/ml的细胞加至A1中，由A1向H1对倍稀释，即取A1中100μl细胞悬液至B1，依次稀释至H1；随后由A1向A12对倍稀释，其余行同A行依次稀释。对生长良好的阳性克隆持续扩大培养，PCR鉴定正确的单克隆细胞可用于后续研究。

图 1 96孔板系列稀释方法示意图 Fig. 1 Sketch map of dilution in 96-well plate

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将筛选到的用于黄病毒检测的细胞系细胞培养至24孔板，1.0×10⁵cells/孔，用PBS洗涤细胞两次，加入200μl 4型登革病毒液，置于37℃ 5% CO₂培养箱中使病毒充分吸附细胞，吸附1h后，加入300μl维持液(含2% 胎牛血清的DMEM培养液)，于37℃ 5% CO₂培养箱中继续培养，检测报告基因mCherry的表达。

以黄病毒属的乙脑病毒(P3)和4型登革病毒(814669)，甲病毒属的辛德毕斯病毒(XJ-160)，布尼亚病毒属的塔希纳病毒(XJ0625)分别感染所制备的阳性细胞系和正常BHK-21细胞对照，具体的感染方法可参考1.2.4中的描述，在感染后48h测报告基因mCherry的表达。

登革4型病毒全基因组感染性克隆 P4 质粒中，自身酶切位点AscI和XhoI间，包含prME基因序列共2 552bp，以P4质粒为模板，从AscI起始设计上游引物△prME-F，缺失prME基因3′端部分序列，即使用引物△prME-F/R扩增prM-E基因缺失片段607bp(图 2)，缺失 P4质粒prME基因的同时引入单酶切位点BsiW I，便于后续的克隆操作。利用质粒自身存在的双酶切位点AscI和XhoI，将△prME基因缺失后的片段重新克隆到 P4质粒，缺失prME基因1 945bp。挑取单克隆使用引物△prME- F2/R进行PCR鉴定，扩增目的片段816bp，测序正确的即为缺失prM-E基因的登革病毒复制子载体，命名为P4-△prME(图 3)。

图 2 P4-△prME-mCherry构建流程 Fig. 2 Flow chart for constructingP4-△prME-mCherry

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图 3 重组质粒P4-△prME的构建和鉴定 Fig. 3 Construction and identification of P4-△prME M1：DNA marker DL2000；1,2：△prME-R fragments；3~9：PCR identification of clones；10：Positive control；11：Negative control；M2：λ-EcoT14 I digest DNA marker；12：Deleted P4-△prME

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以质粒pmCherry-N1为模板，mCherry-F1/R1为引物，扩增红色荧光蛋白mCherry报告基因780bp，并在PCR产物两端引入BsiW I酶切位点。用BsiW I单酶切PCR产物后，将该片段克隆到已构建好的P4-△prME载体中，即可制备含有mCherry基因的复制子载体，其构建策略和流程如图 2所示。

经过转化、挑克隆后，菌落PCR鉴定阳性的重组子进行测序，序列正确的重组子即为含有红色荧光蛋白mCherry报告基因的登革病毒复制子载体，命名为P4-△prME-mCherry(图 4)。

图 4 P4-△prME-mCherry的PCR鉴定 Fig. 4 PCR identification of P4-△prME-mCherry M：DNA marker DL2000；1：Postive control；2：Negative control；3~7：PCR results of clones

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以所构建的含有红色荧光蛋白报告基因的复制子载体P4-△prME-mCherry为模板，Pmc-F1/ R1为引物，扩增融合基因片段A，长度1 197bp。另以Pmc-F2/ R2为引物，扩增融合基因片段B，长度为384bp，分别回收基因片段A和B[图 5(a)]。以Pmc-F1/ R2为引物，基因片段A和B为模板，进行融合PCR扩增，获得目的基因片段C，全长为1 559bp，连接克隆载体pMD18-T后，挑取单克隆测序，选取测序正确的阳性克隆命名为pMD18T-Pmcherry，与pCDNA3.1+载体经BamH I/Xho I双酶切后连接，转化E.coli DH5ɑ感受态细胞，菌液PCR鉴定结果如图 5(b)所示，选取测序正确的克隆，即用于黄病毒检测细胞筛选的缺陷型真核表达质粒，命名为pCDNA3.1-P4-mCherry。

图 5 pCDNA3.1-P4-mCherry的构建与鉴定 Fig. 5 Construction and identification of recombinant pCDNA3.1-P4-mCherry (a)Amplification of template fragments M：DNA marker DL2000；1：A fragment；2：B fragment (b) PCR results of pCDNA3.1-P4- mCherry M：DNA marker DL2000；1~12：Monoclones；13：Postive control；14：Negative control

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以含有红色荧光蛋白mCherry报告基因的、用于黄病毒检测细胞筛选的缺陷型真核表达质粒pCDNA3.1-P4-mCherry转染BHK-21细胞，使用脂质体法进行细胞转染，转染48h后加入浓度为600μg/ml的G418进行筛选，连续压力筛选14天后，获得混合克隆。使用96孔板稀释法对混合克隆进行二次筛选，降低G418浓度至300μg/ml作为维持浓度，并逐步扩大培养，最终获得的细胞系细胞暂命名为BHK-Flavivirus，在细胞形态上，多数细胞贴壁后呈梭形，也有部分细胞呈多角形，或形态不规则，或边缘不清晰，这部分细胞无法增殖，在生长过程会发生细胞自溶现象(图 6)。

图 6 BHK-Flavivirus细胞形态 Fig. 6 Morphology of BHK-Flavivirus (a)BHK-Flavivirus (B)Nomal BHK-21

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将筛选到的用于黄病毒检测的BHK-Flavivirus细胞培养至24孔板，感染4型登革病毒48h后，荧光显微镜下并未观察到红色荧光蛋白mCherry的表达，60h后可观测到少量红色荧光信号，随着感染时间的延长，能够观察到红色荧光信号的范围有所扩大(图 7)。说明经G418筛选获得的细胞系细胞BHK-Flavivirus能够用于外源登革病毒的检测。

图 7 黄病毒检测细胞感染4型登革病毒后的检测结果 Fig. 7 Fluorescent results from BHK-Flavivirus engineering cellsinfected by P4 virus

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为分析黄病毒检测细胞系BHK-Flavivirus的特异性，选择黄病毒属的4型登革病毒(DENV-P4)、乙脑病毒(JEV-P3)、甲病毒属的辛德毕斯病毒(SINV-XJ-160)以及布尼亚病毒属的塔希纳病毒(THAV-XJ0625)进行检测。荧光显微镜下红色荧光蛋白mCherry的检测结果显示，黄病毒属的乙脑病毒、登革病毒感染BHK-Flavivirus后，能够检测到红色荧光信号，而甲病毒属病毒及布尼亚病毒属感染后则未检测出红色荧光信号(图 8)。结果表明，筛选到的用于蚊媒黄病毒检测的BHK-Flavivirus能够针对黄病毒进行检测，而非黄病毒无法启动红色荧光蛋白mCherry的表达，因而不能检出。

图 8 BHK-Flavivirus对不同种属病毒的检测结果 Fig. 8 Fluorescent results from BHK-Flavivirus engineering cells infected by different virues

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病毒复制子载体是在病毒全长cDNA感染性克隆的基础上，将大部分结构蛋白基因缺失或由外源基因替代，同时保留了病毒复制和翻译必需的重要元件组成的病毒亚基因组，在缺失大部分结构蛋白基因的同时克隆如多克隆位点(MCS)供外源基因插入。目前已报道的黄病毒复制子包括KUNV、WNV、TBEV、YFV和DENV。由于黄病毒复制子无感染性，转染的细胞不产生明显的细胞病变，同时亚基因组 RNA 在宿主细胞质中可自主复制并稳定表达外源蛋白；将外源报告基因插入到病毒结构蛋白缺失的位置，构建含有报告基因的复制子，可实时检测复制子复制和翻译水平的改变。本研究以登革病毒感染性克隆为分子基础，制备了含有红色蛋白报告基因，但缺失了整个非结构基因和绝大部分prM-E基因的慢病毒颗粒，经转染构建的黄病毒检测细胞系细胞只有在外源黄病毒反式补给作为复制酶的非结构蛋白时，才能启动报告基因的表达。据此，本研究所构建的细胞系可以用以检测未知样本中的黄病毒。

登革病毒存在4个血清型(DEN1~DEN4)，由其感染所引起的疾病，从无症状感染、一般性发热和较温和的DF到严重的DHF/DSS。其中DHF/DSS病情凶险，死亡率较高，通常登革2型病毒的感染较其他血清型更为严重^[5]。本研究中选用的P4质粒，来自于减毒表型明确的登革4型病毒疫苗株814669株的感染性克隆，对细胞毒性较其他黄病毒弱。以登革4型病毒感染性克隆P4作为分子基础，缺失了结构基因prM/M 基因的全部序列，只保留与NS1蛋白成熟有关的E基因C端NS1蛋白信号序列，构建结构基因部分缺失的登革病毒复制子P4-△prME，插入红色荧光蛋白mCherry报告基因，在mCherry报告基因的C端，引入了口蹄疫病毒(FDMV)2A 顺式水解酶元件序列，FMDV 2A长度仅为60bp，便于操作^[6]，同时FMDV 2A调控的上、下游基因共表达较均衡^{[7, 8]}，引入方法简单，只需去除上游外源基因C端的终止密码子，直接加入FMDV 2A序列融合即可。另外在报告基因的选择上，使用了红色荧光蛋白mCherry。mCherry是较早开发出的红色荧光蛋白DsRed的一种突变体，以水果命名，此种红色荧光蛋白mCherry成熟快、单体特性好，已被广泛应用，但它的亮度较DsRed略低^{[9, 10]}，另外选择红色荧光蛋白mCherry，能够和本科室构建蚊媒甲病毒检测中的报告基因绿色荧光蛋白EGFP有效区分，为最终将筛选到用于蚊媒病毒(甲病毒和黄病毒)检测工程细胞系细胞奠定基础。蚊媒病毒检测工程细胞系在进行未知病毒检测时，可根据荧光蛋白颜色的不同，判断未知样本是甲病毒或是黄病毒。