乙烯(ethylene)是一种植物激素，它在植物的种子萌发、生长发育、叶片和花器官的衰老、果实成熟、性别分化等整个生命周期中发挥着重要的作用，同时与逆境胁迫,如机械伤害、盐害、冷害、渍水、病原菌入侵等方面有关，并参与植物细胞的程序性死亡和DNA降解^[1]。ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1- carboxylate oxidase，ACO)是乙烯合成途径中最后一个关键酶，直接催化ACC合成乙烯，因此ACC氧化酶基因的表达是乙烯形成和应答的主要标志，对ACC氧化酶的研究将有助于了解乙烯的生物功能及其在植物生长发育及胁迫应答中的调控机制。目前，已在多种植物上克隆了ACC氧化酶基因，并对其调控植物的成熟衰老及逆境胁迫应答过程进行了研究^[2]。近年来，通过反馈调节、反义表达等技术调控乙烯的生物合成，从而达到调控植物生长发育、成熟衰老等生理过程及提高植物抗逆性^{[3, 4, 5]}等方面的研究取得了较大进展。

本研究采用的实验材料内葵杂4号，为内蒙古农牧业科学院向日葵课题组选育的油用向日葵杂交种^[6]，由于该品种综合性状优良、耐盐性极强^[7]，在生产上具有广阔的应用前景。ACO作为乙烯生物合成中的关键酶之一,而且又与逆境胁迫相关，因此克隆内葵杂4号中ACO基因并分析其在盐胁迫条件下的表达，对理解向日葵ACO生理功能并加强对ACO基因的利用具有重要意义。

向日葵耐盐品种内葵杂4号种子，由内蒙古农牧业科学院作物研究所提供。

RNAiso Reagen(植物总RNA提取试剂)、DNA A-Tailing Kit、反转录试剂盒cDNA Synthesis Kit(M-MLV)和PrimeSript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、SYBR Premix EX TaqⅡ(Tli RNaseH plus)购自TaKaRa公司；5′/3′RACE Kit-2nd Generation Kit、High Pure PCR Product Purification Kit为Roche公司产品；2xPfu Taq PCR Mix购自南京博尔迪生化试剂有限公司；pGM-T Cloning Kit、E.coli TOP10感受态细胞购自天根生化试剂(北京)有限公司；其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。引物合成和序列测定由南京金斯瑞生物工程技术服务有限公司完成，引物序列见表 1。

用于ACO基因全长cDNA和gDNA序列克隆的样品及材料处理同文献^[8]。按照该文献，将在1/2MS营养液中培养4~5天的幼苗，用0mol/L、120mol/L、150mol/L和180mol/L NaCl胁迫处理3天，分别取各浓度处理植株的根，同时分别取120mol/L NaCl胁迫处理3天植株的根、下胚轴和叶，以及处理0~8天植株的根，以上样品均于液氮中速冻，－70℃冰箱保存，分别用于不同浓度处理、不同器官及不同诱导时间的ACO基因表达分析。

用RNAiso Reagent提取不同处理样品的总RNA，具体方法按照说明书进行，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和纯度。

根据已获得的向日葵ACO基因中间序列4-4-7TDF^[8]设计5′RACE下游引物SP1、SP2和SP3，按照5′/3′RACE Kit的操作说明，以根总RNA为模板，用SP1作为反转录引物合成单链cDNA；用High Pure PCR Product Purification Kit对单链cDNA进行纯化；用5′/3′RACE Kit对纯化后的单链cDNA进行加“A”反应，具体步骤按照试剂盒说明书进行。第一次PCR反应，反应体系为：加“A”后的单链cDNA 5μl、上游引物为5′/3′RACE Kit中的Oligo(dT)-anchor primer(10μmol/L)1μl、下游引物SP2(10μmol/L)1μl、2×Pfu Mix 25μl，加ddH₂O至50μl。反应程序为94℃ 2min，94℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 40s，40个循环；72℃ 7min。第2次PCR反应，反应体系为：第一次PCR产物1μl，上游引物为5′/3′RACE Kit中的PCR anchor primer(10μmol/L)1μl、下游引物SP3(10μmol/L) 1μl，其余成分同第一次PCR。反应程序为94℃ 2min，94℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 40s，30个循环；72℃ 7min。取10μl PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，并将PCR产物回收纯化、加“A”尾(DNA A-tailing kit)后，进行TA克隆并测序，测得序列与中间序列拼接并比对。

根据中间序列设计3′RACE上游引物SP5和SP6，以根总RNA为模板，用Oligo(dT)-anchor primer作为反转录引物合成单链cDNA；第一次PCR反应体系为：单链cDNA 1μl、SP5(10μmol/L) 1μl、PCR anchor primer(10μmol/L)1μl、2×Pfu Mix 25μl，加ddH₂O至50μl。反应程序：94℃ 2min，94℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 40s，30个循环；72℃ 7min。第二次PCR反应体系为：第一次PCR产物1μl、SP6(10μmol/L) 1μl，其余组分及反应程序同第一次PCR。取10μl PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR产物回收纯化、加“A”，然后TA克隆并测序，测得序列与中间序列拼接比对。

将5′RACE序列、中间序列和3′RACE序列拼接，在其开放读码框两端设计1对特异引物GSP1和GSP2，以总RNA为模板，用特异引物进行RT-PCR扩增cDNA片段。同时以基因组DNA为模板，用特异引物扩增其对应的gDNA(genomic DNA)片段，cDNA和gDNA反应程序为94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min。同上分别进行TA克隆并测序。

通过在线分析软件(http://www.nc bi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析得到的全长cDNA序列的开放阅读框(ORF)，利用http: //us.expasy.org/tools/pi_tool.html软件推测其编码蛋白质的理论分子质量和等电点，通过NCBI的Blast程序对核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行比对分析，用DNAMAN软件对推导的氨基酸序列与已报道物种推导的氨基酸序列进行多重比对并进行系统进化分析，利用在线分析软件(http//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0)分析HaACO1跨膜结构域；将获得的gDNA核苷酸序列与cDNA核苷酸序列比对分析基因结构。

根据HaACO1基因cDNA的ORF序列设计实时荧光定量PCR引物QSP1和QSP2，以向日葵18S rRNA基因为内参基因。采用Real-time PCR分析120mmol/L NaCl处理3天的向日葵根、下胚轴和叶中的HaACO1表达量，并对该基因在不同浓度NaCl胁迫处理及不同胁迫处理时间点的表达量进行分析。用RNAiso Reagen提取各样品总RNA，并将其稀释到相同浓度200ng/μl；将总RNA反转录成单链cDNA，具体方法按照PrimeSript RT reagent Kit with gDNA Eraser说明书进行；Real-time PCR反应体系为SYBR Premix Ex TaqⅡ 10μl、cDNA 1μl、上下游引物各0.5μl(10μmol/L)，加水至20μl；反应程序为95℃ 30s；95℃ 15s，60℃ 30s，40个循环，3次重复；PCR反应在Light Cycler 480(Roche)实施时光定量PCR仪上进行，利用2^-ΔΔCT 法计算目的基因相对表达量。

用RNAiso Reagent提取NaCl处理的向日葵植株根总RNA，测得OD₂₆₀与OD₂₈₀比值为1.8，电泳显示28S条带的亮度为18S的2倍，表明提取的RNA完整性好、纯度高，完全满足下一步RACE实验的要求[图 1(a)]。根据前期获得的ACO基因序列设计5′ RACE和3′RACE引物，并进行5′RACE和3′RACE PCR扩增，分别获得长度约为500bp[图 1(b)]和600bp条带[图 1(c)]。将PCR扩增产物克隆后测序，测得的序列分别与已知序列拼接并进行比对分析，表明所获片段分别为向日葵ACO基因的5′端和3′端序列。

图 1 向日葵根总RNA和HaACO1 RACE扩增电泳图 Fig. 1 Electrophoretogram of total RNA and RACE amplification of HaACO1 in sunflower

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将5′RACE序列、已知序列和3′RACE序列拼接后，在其开放读码框两端设计1对特异引物，经RT-PCR扩增，获得约1 000bp大小的预期条带[图 2(a)]，测得序列与拼接序列完全一致，验证了拼接序列的准确性。HaACO1 cDNA全长1 135bp，包含一个942bp的开放阅读框(ORF)及77bp的5′Utr(5′端非编码区序列)和116bp的3′Utr。该基因编码313个氨基酸，推测其编码蛋白质的理论分子质量为35.84kDa，等电点为5.13，基因登录号为KP966508。通过Blast比对发现HaACO1基因与已报道的莴苣(AB158346)、猕猴桃(HQ293208)、牵牛花(EF127818)、天竺葵(U67861)和巨桉(AB479544)的ACO基因核苷酸序列相似性分别为83%、78%、77%、77%和76%，氨基酸序列相似性分别为88%、81%、80%、79%和77%。氨基酸序列多重比对发现HaACO1与以上5个物种ACO基因推导的氨基酸序列有许多高度的保守区域，以黑色方框表示(颜色越深，保守越高)(图 3)。利用DNAMAN软件将向日葵与莴苣、猕猴桃、天竺葵等10种双子叶植物ACO氨基酸序列进行系统进化分析，表明HaACO1与莴苣ACO基因亲缘关系最近，而与巨桉ACO基因亲缘关系最远(图 4)。TMHMM结果表明，HaACO1整条肽链都位于细胞膜外，不存在跨膜域，可能为细胞质蛋白。以基因组DNA为模板，用特异引物GSP1和GSP2扩增HaACO1基因cDNA对应的gDNA，获得大小为1 000bp左右条带[图 2(b)]。经序列测定发现该基因编码区自起始密码子ATG至终止密码子TAA长度为1 018bp，与cDNA编码序列比对结果表明该gDNA由2个外显子和1个内含子组成，2个外显子长度分别为111bp和831bp，内含子长度为76bp，内含子两端具有典型的GT/AG结构，将该基因命名为HagACO1，登录号为KP988289。

图 2 开放阅读框cDNA和gDNA扩增电泳图 Fig. 2 Electrophoretogram of ORF cDNA and gDNA amplification M: DL2000 Marker；1,3: CK—；2: ORF cDNA; 4: ORF gDNA

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图 3 向日葵HaACO1氨基酸序列与其他物种同源氨基酸序列多重比对 Fig. 3 Alignment of the deduced HaACO1 amino acid sequence and its homologus amino acid sequences from other species

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图 4 向日葵HaACO1氨基酸序列与其他物种同源序列的进化树分析 Fig. 4 Phylogenetic analysis of sunflower HaACO1 and other species

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实时荧光定量PCR分析表明，HaACO1在向日葵根、下胚轴和叶中均有表达，其中在叶片中的表达量最高，是根中表达量的3.65倍；其次为下胚轴，其表达量是根的1.27倍；根中的表达量最低(图 5)。用不同浓度NaCl处理幼苗，120mmol/L时根中HaACO1表达量最高，为对照的15.14倍；随着NaCl浓度的增加表达量逐渐降低，150mmol/L时HaACO1表达量为对照的3.29倍；180mmol/L时表达量最低，为对照的2.57倍(图 6)。用120mmol/L NaCl处理幼苗0~8天，HaACO1表达量呈现出先增加后降低又突然增加的趋势。在胁迫处理1天时根中HaACO1表达量增加，为对照的5.78倍；随后逐渐降低，但幅度不大；当胁迫到第7天和第8天时HaACO1表达量突然增加，分别达到对照的16.41倍和31倍(图 7)，以上说明HaACO1在向日葵中的表达存在时空表达特异性差异。

图 5 HaACO1器官特异性表达分析 Fig. 5 Expression analysis of HaACO1 in various organs of Sunflower

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图 6 HaACO1在不同浓度NaCl胁迫下表达分析 Fig. 6 Expression analysis of HaACO1 of Sunflower under different concentration stresses of NaCl

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图 7 HaACO1在胁迫不同时间下表达分析 Fig. 7 Expression analysis of HaACO1 of Sunflower in different time stresses of NaCl

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迄今，从多种植物中克隆了ACC氧化酶基因(ACO)，并对其受激素、环境胁迫，以及植物的开花、授粉、果实成熟、衰老等生育过程等诱导的表达进行了研究^{[9, 10, 11, 12, 13, 14]}，有关向日葵ACC氧化酶基因的克隆及受不同因素诱导表达的报道较少。Ouvrard等^[15]以向日葵耐旱品系R1和干旱敏感品系S1为研究对象，通过消减杂交技术从水分胁迫的向日葵叶中分离到一个长度为454bp(编码117个氨基酸)的ACC氧化酶基因sdi-10片段，表达分析表明，该基因在干旱诱导下转录水平较高，在外源ABA胁迫5h后表达水平高于应答干旱胁迫的表达。Liu等^[16]用甘蓝型油菜ACC氧化酶基因序列作探针从伤诱导的向日葵品种Dahlgren 131的下胚轴cDNA文库中筛选出ACC氧化酶基因ACCO1，该基因包含57bp的5′Utr、924bp的ORF和211bp的3′Utr；通过RT-PCR克隆了ACCO1的同源基因ACCO2；同时以Ouvrard等^[15]分离的sdi-10为基础克隆了ACCO3。Southern分析表明ACCO1、ACCO2和ACCO3属于向日葵ACC氧化酶基因家族的3个成员。进一步分析伤处理和银离子处理的ACO基因表达，表明ACCO3在叶、下胚轴和根中均有表达，但在ACO总的转录产物中只占了少量；而ACCO1和ACCO2在根、下胚轴和叶中存在差异表达，ACCO1 mRNA在根中的表达量最多，而ACCO2主要在叶和下胚轴中表达。向日葵ACO基因家族各个成员的表达差异可能是由于上游调控序列的差异所致^[17]。进一步研究表明，伤处理和银离子处理增加了下胚轴ACC氧化酶mRNA水平和ACC氧化酶的活性，该结果与乙烯生成量的增加是一致的。

本研究以作者前期通过cDNA-AFLP技术从盐胁迫的向日葵品种内葵杂4号根中分离的ACC氧化酶基因片段4-4-7TDF(KM823963)为基础，采用RACE方法获得了一个1 135bp完整的ACC氧化酶基因HaACO1序列，该基因与Ouvrard等^[15]获得的向日葵ACO基因sdi-10(X92651)同源性达96%，与Liu等^[16]报道的ACCO2基因的2个克隆子的序列同源性分别为84%(U62554)和98%(U62555)，表明ACO基因在向日葵不同品种中比较保守。

本研究进一步对向日葵HaACO1基因进行了盐胁迫下的表达分析，结果表明该基因受NaCl胁迫诱导表达，且在向日葵根、下胚轴和叶中均有不同程度的表达，其中在叶中的表达量最高，下胚轴中次之，根中最少，与Liu等^[16]研究的向日葵ACCO2的表达模式一致。ACC氧化酶基因在不同器官中的表达差异可能与其在这些器官中执行的生理功能不同有关。不同NaCl浓度(0mmol/L、120mmol/L、150mmol/L和180mmol/L)胁迫下，向日葵根中HaACO1的表达量表现为先升高后降低的趋势；不同胁迫时间(0~8天)下表现出先升高后降低又快速升高的趋势。正常情况下乙烯在植物组织内维持在一个极低的水平，胁迫刺激后产生的乙烯可以很快的向邻近组织扩散，使得乙烯可以快速、灵敏的应答逆境胁迫，将信号传递到效应部位引起一系列应激反应^[18]。因此，本研究中NaCl胁迫初期，HaACO1基因表达量升高可能是向日葵响应逆境因子的标志之一，是一种盐适应现象。进一步表明ACC氧化酶基因表达调控着细胞内乙烯的产生，并与植物耐受胁迫的能力紧密相关。