纳豆激酶(nattokinase，NK)是由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilis var. natto)分泌的一种碱性丝氨酸蛋白酶，由Sumi 等^[1]于1987 年首先在日本传统发酵食品纳豆中发现并命名。研究表明，纳豆激酶可通过直接溶解纤维蛋白^[2]和激活体内的纤溶酶原^[3]两种途径来发挥其溶栓作用，纤溶作用强,作用时间长^[4]，是制备口服溶栓制剂的潜在来源。自1992 年，Nakamura 等^[5]测定了1 473bp的NK 基因(aprN)全序列以来，纳豆激酶在多种表达系统中均实现了高表达。2010 年，Chen 等^[6]在枯草芽孢杆菌PT5 中建立了整合在染色体上的T7 高效表达系统，诱导后纳豆激酶分泌量可达10 860CU/ml。2011 年，余凤云等^[7]将纳豆激酶原基因电转化到乳酸乳球菌NZ9000中，获得具有98.55U/L溶栓活性的乳酸菌。罗立新等^[8]、蔡立涛等^[9]将纳豆激酶基因转化毕赤酵母，实现了NK 在真核表达系统的高表达。Li 等^[10]将纳豆激酶基因与报告基因egfp相连制成重组杆状病毒，通过Bac-to-Bac 系统在草地夜蛾昆虫细胞中得到了表达，纤溶活性为60U/ml。

通过微生物发酵和动物细胞培养生产纳豆激酶需要繁琐的下游加工过程，成本较高。植物生物反应器是外源基因表达的良好受体，若能将纳豆激酶在其中表达，则可降低成本、简化遗传操作、方便产物的加工和储运，以及提高产品的安全性。田晓玲^[11]、袁琳等^[12]通过农杆菌介导法分别将NK基因转入生菜和番茄中，通过PCR 和RT-PCR 鉴定证明了纳豆激酶基因已导入受体植物并在转录水平上有表达，但未见蛋白质表达水平及活性测定的报道。

重组蛋白质表达量低是植物生物反应器生产药用蛋白质普遍存在的问题。为了提高纳豆激酶在植物中的表达量，本研究采用植物偏爱密码子重新设计、人工合成纳豆激酶基因sNK，并通过重叠延伸PCR 法在其ORF 第519个和第520个碱基之间插入番茄果实特异性表达基因E8的第一内含子形成sNKi基因，分别构建植物双元表达载体pPZP221(35S-sNK-nos)和 pPZP221(35S-sNKi-nos)，采用农杆菌渗透法使sNK基因和sNKi基因在烟草叶片中得到瞬时表达，并对纳豆激酶基因表达量及酶活性进行测定，从而既可以验证优化合成的纳豆激酶基因的正确性及表达效率，同时可为纳豆激酶基因稳定转化植物进行大规模生产及在溶血栓方面的应用奠定良好的基础。

烟草(Nicotiana tabacum L.)品种NC89 原种由中国农业科学院烟草研究所贾兴华研究员提供；番茄(Lycopersicon esculentum M.)品种Micro-Tom 由中国农业科学院蔬菜花卉研究所李君明研究员提供；pPZP221(35S-nos)质粒、农杆菌LBA4404 均为本实验室保存。

BamHⅠ、SacⅠ、T4 DNA 连接酶、DNA分子质量标准、Taq 酶及Prime STAR HS DNA聚合酶、Total RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqII 荧光定量试剂盒均购自TaKaRa 公司，DNA 胶回收试剂盒购于上海生物工程公司，pEASY-Blunt 质粒购自北京全氏金生物公司，纤维蛋白原、凝血酶和尿激酶标准品购自Sigma公司，其他试剂均为国产分析纯。

根据番茄E8基因 (GenBank ID：X13437.1) 的cDNA 序列，设计合成一对特异性引物P3 和P4，用于其第一内含子的扩增；根据人工合成的sNK基因序列，设计合成两对特异性引物：P1、P2 和P5、P6，分别用于sNK基因5′端片段和3′端片段的扩增。选取sNK基因3′端片段 (ORF 第520~1 152碱基序列)，设计纳豆激酶实时荧光定量PCR (RT-qPCR) 检测引物NKQP1 和NKQP2；选择烟草Actin基因 (GenBank ID：AB158612.1)作为内参基因，设计RT-qPCR 内参引物NAQP1 和NAQP2。引物序列见表 1。

查询密码子偏爱数据库Codon Usage Database (http://www. Kazusa.or.jp/codon)，利用在线分析软件Codon Usage Analyzer 确定植物偏爱密码子 (表 2)。大部分氨基酸只有一个偏爱密码子，Gly、Thr、Leu、Lys 使用两个偏爱密码子，Ser 三个密码子使用频率相当，故有三个偏爱密码子，使用时避免相同密码子的串联重复。采用植物偏爱密码子对来源于纳豆枯草杆菌的纳豆激酶基因aprN(GenBank ID：S51909.1)进行重新设计并命名为sNK，预测该基因mRNA二级结构的稳定性(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)，随后由上海生工生物工程有限公司合成并克隆于pUC57 质粒上。

采用重叠延伸PCR 法在已合成的sNK基因ORF 的第519个和第520个碱基之间插入番茄果实特异性表达基因E8的第一内含子。以番茄Micro-Tom 总DNA为模板，用引物P3、P4 先扩增出E8基因第一内含子(423bp)，再以pUC57-sNK质粒为模板，分别用引物P1、P2 和P5、P6 扩增出sNK基因5′端(519bp)和3′端(633bp)。将扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳并回收目的片段。接着以sNK基因5′端和E8基因第一内含子回收产物互为模板，先进行5个循环的融合反应，再以P1和P4为引物扩增sNK-E8i 融合片段。以同样的方法，以P1和P6为引物扩增sNKi基因全序列 (图 1)。将该基因与pEASY-Blunt质粒连接，获得重组质粒pEASY-Blunt-sNKi，进行测序。

图 1 重叠延伸PCR 法合成sNKi基因 Fig. 1 Construction of sNKi gene by overla Pextension PCR

图选项

用BamHⅠ和SacⅠ分别双酶切pUC57-sNK 质粒、pEASY-Blunt-sNKi 质粒和植物双元表达载体pPZP221(35S-nos)，将两个目的基因分别克隆到pPZP221 质粒中35S 启动子的下游，构建植物表达载体pPZP221(35S-sNK-nos)和pPZP221(35S-sNKi-nos)。冻融法转化农杆菌LBA4404，以pPZP221(35S-nos)为空质粒对照。

农杆菌培养和渗透液制备参照Orzaez等^[13]的方法。培养好的农杆菌用液体MMA[10mmol/L MgCl₂，10mmol/L 2-(N-吗啉)-乙基磺酸(MES)(pH 5.6)，150μmol/L乙酰丁香酮]重悬至OD₆₀₀=0.6，并在室温下温和搅拌(20r/min)孵育至少2h。

将烟草NC89 幼苗置于25℃、16h/8h明暗交替光照培养条件下培养约40天后进行侵染，侵染前2天停止浇水，适度干燥叶片以利于农杆菌液渗入。分别吸取农杆菌渗透液500μl，用无针头的灭菌注射器慢慢地将渗透液从烟草叶片下表皮处注入，使菌液渗透到叶片组织中。每种农杆菌各侵染10 个叶片，侵染后2天取样检测纳豆激酶基因的表达。

取浸润部位叶片0.1g，用液氮研磨成粉末后，用Total RNA提取试剂盒提取叶片总RNA，用反转录试剂盒反转录合成cDNA。将得到的cDNA 5 倍稀释作为模板，以Actin基因作为内参基因，用荧光定量试剂盒进行RT-qPCR 反应，检测纳豆激酶在转录水平上的表达量。采用2^-ΔΔCt方法^[14]计算各实验组纳豆激酶的相对表达量，每个处理均重复3 次，H₂O为空白对照。使用SPSS17.0 软件分析数据差异显著性。

采用Astrup和Mullertz^[15]报道的纤维蛋白平板法稍作修改。10ml纤维蛋白原溶液(1.5mg/ml)与150μl凝血酶液(100U/ml)和10ml 1%琼脂糖溶液混合均匀后倒入直径90mm的灭菌培养皿中制作琼脂糖-纤维蛋白平板。以尿激酶为标准品制作标准曲线，得回归方程和相关系数。烟草叶片蛋白质提取采用PBS法^[16]，取粗蛋白质液10μl点样于琼脂糖-纤维蛋白平板上，置于37℃培养箱，18h后根据溶圈的面积与标准曲线相比测定酶活力。

根据植物偏爱密码子重新设计的纳豆激酶基因sNK(GenBank ID：KJ495732)，用植物中的常用密码子替换了稀有密码子，替换后避免出现富含A/T的植物多聚腺苷酸信号序列，如“AATAAT、AATTAA 和AACCAA”及连续的A/T序列(＞5)。用植物中常用的ATG起始密码子替换原有的GTG密码子，基因3′端的三个连续的终止密码子TAATAGTAA的第二个改为植物中常用的TGA。经过改造的sNK基因在氨基酸顺序不变的情况下G/C含量有所增加。为提高该基因在植物中的表达量，在起始密码子ATG 上游引入Kozak序列“GCCACC”，并在基因的上、下游分别引入BamHⅠ和SacⅠ酶切位点序列，以便构建表达载体。mRNA二级结构预测其稳定性有所降低 (最小自由能由－363.12kcal/mol降为－332.94kcal/mol)，有利于转录(图 2)。

图 2 mRNA 二级结构预测 Fig. 2 The mRNA secondary structure prediction (a) The mRNA secondary structure prediction of aprN gene (b) The mRNA secondary structure prediction of sNK gene

图选项

采用重叠延伸PCR法，分别扩增出E8基因内含子、sNK基因5′端和3′端三个片段，然后两两相连作为模板，通过重叠链的互补配对，扩增得到完整的1 575bp sNKi基因(图 3)，测序证明基因序列与预期完全一致。

图 3 重叠延伸PCR法扩增sNKi基因 Fig. 3 Amplification of sNKi gene by overla pextension PCR M: DL 2000 marker; 1: The first intron of E8 gene (423bp); 2: 5′end of sNK gene (519bp); 3: 3′end of sNK gene (633bp); 4: The fusion fragment of sNK-E8i (942bp); 5~7: sNKi gene (1 575bp)

图选项

构建好的植物表达载体pPZP221(35S-sNK-nos)和pPZP221(35S-sNKi-nos)分别用限制性内切核酸酶BamHⅠ和SacⅠ双酶切后，得到了9.8kb的载体pPZP221(35S-nos)片段和约1.2kb、1.6kb 的目的基因sNK和sNKi片段，表明载体构建成功(图 4)。

图 4 植物表达载体 pPZP221(35S-sNK-nos)和pPZP221(35S-sNKi-nos)酶切鉴定 Fig. 4 Identification of pPZP221(35S-sNK-nos)and pPZP221(35S-sNKi-nos)by enzyme digestion M: DL15000 marker; 1: Double digenstion (BamH I/Sac I) of pPZP221(35S-sNK-nos)；2: Double digenstion (BamH I/Sac I) of pPZP221 (35S-sNKi-nos)

图选项

以不含目的基因的空载体pPZP221(35S-nos)为对照，分别对sNK基因和sNKi基因在烟草叶片中的瞬时表达量进行分析，RT-qPCR结果如图 5 所示，同转sNK烟草叶片相比，转sNKi烟草叶片中纳豆激酶基因的表达量明显增加。统计学分析表明两者之间存在显著性差异。

图 5 sNK基因和sNKi 基因在烟草叶片中mRNA 的表达量 Fig. 5 Relative expression of sNK gene and sNKi gene in tobacco leaves Significant difference (P≤0.05) was obtained if the letter on the top of the columns is not the same

图选项

尿激酶标准曲线如图 6 所示，尿激酶活力与溶圈面积为0～30IU/ml 时具有较好的线性关系，相关系数为R²=0.99 78。

图 6 尿激酶标准曲线 Fig. 6 Standard curve of urokinase

图选项

取RT-qPCR检测到纳豆激酶基因mRNA表达的烟草叶片样品，用纤维蛋白平板法检测纳豆激酶活性。图 7显示，sNKi基因表达的纳豆激酶活性溶圈明显大于sNK基因表达的溶圈，平均纤溶活性可达16.73U/ml(表 3)，约为sNK 基因表达纤溶活性(8.78U/ml)的2 倍，说明内含子在提高外源基因在植物中的表达具有显著的作用。

图 7 烟草叶片中表达的sNK基因和sNKi基因的溶圈 Fig. 7 The lysis zone of sNK and sNKi gene in tobacco leaves 1: Urokinase standard (10IU/ml); 2: pPZP221 (35S-nos); 3: pPZP221 (35S-sNK-nos); 4: pPZP221 (35S-sNKi-nos). The letter A, B and C means three replicates

图选项

1986年，第一个人类重组蛋白——生长激素在烟草和向日葵中成功表达^[17]，开创了植物生物反应器研究的先河。植物生物反应器以其廉价、安全、遗传操作简单，有些植物材料可直接食用等诸多优势使之成为目前重组蛋白生产的主要系统之一^[18]。以植物作为生物反应器表达外源蛋白可以稳定遗传转化表达系统和瞬时表达系统。与依赖于植物组织培养再生体系的传统转基因过程相比，瞬时表达法具有操作简易，以及周期短、表达效率高、安全高效、不需要筛选基因和能在完整植株上进行等优点^[19]，成为快速有效的分析外源基因表达的手段。

重组蛋白表达量低是转基因植物普遍存在的问题。为提高外源基因的表达量，通常可以采用蛋白质靶向定位、外源基因优化[包括使用植物偏爱密码子、优化前导肽序列、去除mRNA中不稳定序列，同时表达有助于产物正确折叠的酶或蛋白质(如分子伴侣等)]、合理选择启动子并加以改造等方法。近年来的研究发现，内含子在基因表达调控等方面有相当重要的作用，内含子的存在可以加强外源基因表达的强度，起到增强效应^[20]。在单子叶植物中，玉米adh1 和sh1 内含子使转基因玉米报告基因的表达水平提高10～100倍^{[21, 22]}。

在本研究中，我们采用植物偏爱密码子重新设计纳豆激酶基因，去除植物中的稀有密码子和mRNA 中的多聚腺苷酸信号序列等，在起始密码子上游加入一段能够在真核生物中显著提高基因转录和翻译效率的Kozak序列^[23]，以提高该基因在植物中的表达量。除此之外，我们把来源于番茄E8基因的第一内含子，按其在原E8基因中的相应位置插入到人工合成的纳豆激酶基因中，采用农杆菌渗透法成功地将人工合成的纳豆激酶基因sNK和sNKi在模式植物烟草叶片中瞬时表达。RT-qPCR 检测和纤溶酶活性结果显示，构建的两个基因在转录水平上和翻译水平上均得到表达，表明我们所合成的基因可在植物中正常转录和翻译，并且含内含子的sNKi基因的转录水平和翻译水平均显著高于不含内含子的sNK基因，为纳豆激酶基因在植物中的稳定转化及高效表达奠定了基础。