哺乳动物卵母细胞周围包裹着一层卵透明带，在受精过程中卵透明带起着非常重要的作用，如今它已被作为免疫不育疫苗的理想侯选抗原^{[1, 2]}。基因疫苗由于安全性较好已在免疫不育疫苗研究领域里被广泛使用^[3]，但免疫效果不太理想，因此，就需要通过各种途径和策略来不断提高基因疫苗的免疫效果，而黏膜接种是一种简单有效的免疫不育疫苗的免疫方式^[4]。壳聚糖(chitosan，chi)可以很好地吸附DNA，防止DNA降解，相容性好，可作为基因疫苗的佐剂，有效促进黏膜部位的免疫反应^[5]。PolyI:C(聚肌苷酸胞苷酸)是TLR3的配体，PolyI:C与TLR3识别后，激发机体先天免疫反应，促进多种效应分子的表达，如趋化因子、炎性细胞因子等，以此增强机体的免疫反应^{[6, 7]}。IL-15是含有N-乙酰氨基半乳糖残基的弱酸性糖蛋白，具有多种生物学功能，能促进B细胞生长，诱导细胞毒T细胞(CTL)的生成，刺激NK细胞的活化与增殖^{[8, 9]}。Toll样受体(TLR) 是一种模式识别受体，Toll样受体能结合机体自身产生的一些内源性分子，在增强免疫效应方面发挥重要作用^[10]。

本文在前期以IL-15作为mZP3基因疫苗佐剂研究的基础上，发现免疫增强效果和抗生育效果不太理想，所以，本研究选用Poly I:C与IL-15共同作为基因疫苗的佐剂，先用溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholine，LPC)进行预处理，用壳聚糖包裹基因疫苗，黏膜免疫小鼠，观察Poly I:C 协同IL-15共免疫mZP3基因疫苗的免疫增强效果。

ICR小鼠(20g左右，雌性，6~8周龄)购自新疆医科大学实验动物中心；E.coli HB101和E.coli BL21 (DE3) 菌株为本实验室保存；实验中的基因疫苗和重组质粒均由本实验室构建；蛋白质分子质量标准购自华美生物技术有限公司，辣根过氧化物标记的羊抗鼠二抗购自Southern Biotech公司；BCA蛋白定量试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；Chitosan购自山东奥康生物科技有限公司；Poly I:C为杭州美亚药业有限公司产品，限制性内切核酸酶均为TaKaRa公司产品。

参照文献制备抗原^[11]，将鉴定正确的pGEX-4T-mZP3进行原核表达，蛋白质诱导表达的条件为：37℃振荡培养3h，0.8mmol/L的IPTG诱导表达4h后，离心收集细菌沉淀，PBS洗涤两遍后，细菌沉淀经过变性、复性等处理后得到了融合蛋白，再进行定量。

mZP3重组质粒经小量提取，酶切鉴定后，大量制备，经PEG8000纯化后溶于9g/L生理盐水中，定量用于壳聚糖-质粒复合物的制备。根据文献制备壳聚糖包裹的基因疫苗^[11]。

所有的实验动物雌性ICR小鼠被随机分为7组，每组6只。A组：9g/L NaCl；B组：Chi-pcDNA3；C组：Chi-PolyI:C；D组：Chi-pcD-IL-15；E组：Chi-pcD-mZP3；F组：Chi-(pCD-mZP3+IL-15)。以上6组均作为对照组。G组：Chi-(pcD-mZP3+IL-15+PolyI:C 10μg)的小鼠作为实验组；每次免疫前1h用1g/L LPC进行预处理，用壳聚糖包裹基因和佐剂后立即用于动物免疫。于第0天、第7天、第14天、第21天进行4次滴鼻免疫。

每次免疫前收集小鼠血清，用直径为1mm左右灭菌的毛细玻璃针在小鼠眼底采血，收集约200μl血样至无菌微量离心管中。37℃温育1h，再置于4℃冰箱放置1h。之后，3 000r/min离心10min，收集上清液，－80℃保存备用。

生殖道洗液是在每次免疫前，用PBS反复冲洗小鼠的生殖道至少6次得到的；肺洗液是在初免后第42天，麻醉致死小鼠，取小鼠的肺浸泡于1.0ml生理盐水中收集上清液得到的；将以上得到的生殖道洗液和肺洗液离心后收集上清液立即做抗体检测。

用间接ELISA法检测免疫后28天、42天、56天、70天的小鼠血清、生殖道黏液和肺洗液中的IgG和sIgA抗体水平。首先配制浓度为1μg/ml的mZP3蛋白包被液，每孔100μl铺在96孔板中，每孔100μl，37℃放置1h后置于4℃冰箱12h。PBST洗涤3次后，每孔加入100μl 50g/L脱脂奶粉37℃封闭1h。PBST洗涤3次，加入一抗：各组免疫后小鼠的血清和黏液，一抗与稀释液比为1∶100，每孔100μl，37℃ 1h。PBST洗涤3次，再加入二抗：1∶8 000 HRP标记的兔抗鼠IgG和sIgA，每孔100μl，37℃ 1h。PBST洗涤4次，加入四甲基联苯胺(TMB)避光显色15min，每孔加入50μl 2mol/L H₂SO₄终止反应，设置酶标仪波长为OD_450/655的条件下测定光吸收值。

首先分离出最后一次免疫7天小鼠的脾脏，用含10% FBS的RPMI-1640培养基将其制成单细胞悬液，计数并将细胞调整为3×10⁶个/ml铺到96孔细胞培养板，加入不同浓度的ConA、BSA、mZP3进行刺激，同时设置空细胞对照和空血清对照，放入37℃细胞培养箱中培养48h后，每孔加入20μl MTT，37℃孵育4h，每孔加入100μl DMSO溶解，设置酶标仪波长为OD_570/630的条件下测定光吸收值，计算免疫后各组小鼠的刺激指数(SI)。

小鼠于最后一次免疫后的第7天，把年龄相当的具有生育能力的雄鼠与雌鼠进行配对，雌鼠出现阴道栓即为交配成功。1~2周后，将雄鼠取出单独喂养雌鼠，观察雌鼠的生育情况。待雌鼠产仔后，记下每组雌鼠的产仔数并与对照组比较，进行统计分析^[12]。取与雄鼠配对后雌鼠的卵巢，放在Bouin’s固定液中固定24h，进行石蜡包埋、切片等处理，然后用苏木素-伊红进行染色，并在光学显微镜下观察卵巢组织的差别。

实验数据均用±SD表示，采用Graphpad Prism5 软件进行数据分析，实验数据进行单因素的方差分析，用Turkey法进行多重比较，P＜0.05为差异具有统计学意义。

pcDNA3、pcDNA3-IL-15、pcDNA3-mZP3经过碱裂解法小量提取，通过测序及酶切鉴定证明质粒正确，酶切鉴定结果见图 1。随后对这三种质粒进行大量制备，酶切鉴定正确后，再经PEG8000纯化、电泳及定量。

图 1 pcDNA3、pcD-mZP3、pcDNA3-IL-15的酶切鉴定图 Fig. 1 Enzyme digestion identification of pcDNA3、pcD-mZP3、pcDNA3-IL-15 M:15 000; 1~2: pcDNA3 digested by Hind III and Xba I; 3: pcDNA3-IL-15 digested by Hind III and Xba I;4~6: cD-mZP3 digested by Hind III and Xba I

图选项

用EcoR I和Xho I进行双酶切pGEX-4T-1/mZP3，鉴定正确后[图 2(a)]，进行mZP3蛋白大量制备，电泳结果[图 2(b)]说明：mZP3基因能够在细菌中大量表达。收获细菌沉淀后，超声波破菌，SDS-PAGE电泳检测，mZP3蛋白在细菌沉淀中[图 2(c)]，该蛋白质主要以包涵体的方式存在。

图 2 原核表达载体pGEX-4T-1/mZP3的鉴定、蛋白质表达及纯化 Fig. 2 Identification of pGEX-4T-1/mZP3, protein expression, purification (a)Identification of pGEX-4T-1/mZP3 1: DNA marker; 2,3：Enzyme digestion of pGEX-4T-1; 4：Enzyme digestion of pGEX-4T-1/mZP3 (b)SDS-PAGE of antigen expression 1,2: The protein of pGEX-4T-1/mZP3 induced by IPTG; 3: The protein of pGEX-4T-1/mZP3 not induced; 4: Protein marker (c) 1～5: The different dilutions of mZP3 protein after purified; 6: Protein marker. Arrow point to the target band

图选项

为了检测免疫后小鼠体液免疫水平，对免疫后收集的小鼠血清进行检测。ELISA检测结果表明：用IL-15和PolyI:C作为佐剂共免疫可以显著增强mZP3基因疫苗的IgG抗体水平，且随着免疫后天数的增加，小鼠血清中的IgG抗体水平也逐渐增加，IL-15和PolyI:C共免疫组Chi-(pcD-mZP3+IL-15+PolyI:C 10μg)的抗体水平与其他各组相比差异极显著(P＜0.01)，结果见图 3(a)。在初次免疫后28天，42天收集生殖道洗液和42天收集肺脏洗液，检测黏膜部位抗原特异性的sIgA 的水平。结果表明，小鼠生殖道黏液中sIgA水平比较低，通过统计学分析比较，各组之间没有统计学差异。在小鼠的肺洗液中检测到了一定水平的sIgA、IL-15和PolyI:C共同免疫组Chi-(pcD-mZP3+IL-15+PolyI:C 10μg)与其他各组相比差异显著(P＜0.05)，结果见图 3(b)。

图 3 免疫后ICR小鼠血清中抗体水平的检测 Fig. 3 Detection of serum antibody level of immunized ICR mice (a) Detection of IgG level in serum a: P < 0.01 (b) Detection of sIgA level in vaginal and lung fluid a :P < 0.05

图选项

为了检测免疫后小鼠细胞免疫水平，对免疫后小鼠进行MTT检测淋巴细胞增殖实验，ConA 作为阳性对照，BSA作为阴性对照，MTT实验经统计分析，IL-15和PolyI:C(10μg)共免疫组与其他各组相比差异显著(P＜0.01)结果见图 4，结果表明PolyI:C(10μg)能够协同IL-15显著增强mZP3基因疫苗的淋巴细胞增殖。

图 4 免疫ICR小鼠淋巴细胞增殖的检测 Fig. 4 Detection of lymphocyte proliferation in mice immunized with ICR a: P < 0.01 vs group of A,B,C,D,E,F

图选项

为了观察小鼠免疫后卵巢发育情况，最后一次免疫后6周，对各组小鼠卵巢切片进行HE染色,光镜观察显示，E、F、G组与对照组相比小鼠出现异常的卵巢发育，其他各组(A~D)小鼠卵巢发育正常，如图 5所示。

图 5 各组小鼠卵巢的组织学检测(H.E染色，×100) Fig. 5 The histology examination of each group mice ovary (a) 9g/L NaCl (b)Chi-pcDNA3+LPC (c)Chi-PolyI:C+LPC (d) Chi-pcD-IL-15+LPC (e)Chi-pcD-mZP3+LPC (f)Chi-(pcD-mZP3+IL-15)+LPC (g)Chi-(pcD-mZP3+IL-15+PolyI:C)+LPC

图选项

小鼠抗生育实验结果显示，D、E、F、G组小鼠的平均幼崽数和生育率明显降低，与9g/L NaCl对照组达到了差异极显著的水平(P＜0.01)(表 1)。

免疫不育技术是降低人口和有害动物数量的重要手段，随着社会的发展越来越受到人们的关注。TLR是近年来发现的重要免疫受体，它通过识别病原体，启动细胞内信号转导通路，激活先天性免疫和获得性免疫^[10]。本实验选用的是PolyI:C，它是TLR3的激活物，可以激活获得性免疫反应，进而增强获得性免疫反应^[13]。然而，由于本实验中基因疫苗免疫原性较弱，不能够激发强效的黏膜免疫反应。相关文献报道，一些细胞因子和Toll受体拮抗物可作为免疫佐剂增强基因疫苗的黏膜免疫效果^[14]，但是，不同的剂量也会产生不同的免疫效果^[15]，本研究选用PolyI:C协同细胞因子IL-15共同作为黏膜免疫的佐剂，IL-15的选用和PolyI:C 10μg的剂量是在前期研究的基础上进行筛选的，结果表明，PolyI:C协同IL-15可显著增强基因疫苗的免疫效果。

本研究选用了壳聚糖包裹pcD-mZP3基因疫苗，同时使用了能够短暂破坏上皮细胞间连接的LPC进行处理^[16]。初次免疫后第28天和第42天检测到mZP3特异性的IgG和sIgA，结果发现，PolyI:C协同IL-15作为基因疫苗佐剂可以显著增强mZP3基因疫苗的抗体水平，而且随着免疫后天数的增加，小鼠血清中的抗体水平也逐渐增加。MTT结果中IL-15和PolyI:C共免疫组与其他各组相比差异显著，表明PolyI:C能够协同IL-15显著增强mZP3基因疫苗的淋巴细胞增殖。而且文献表明，mZP3疫苗导致的生育率的下降，不仅与特异性抗体有关，而且与T细胞引起的卵巢炎症反应也有关系^[17]。卵巢的组织学结果表明，实验组卵巢泡发育异常，而对照组卵巢泡发育正常，并且pcD-mZP3基因疫苗引起了幼崽数的减少。所以，我们发现卵巢炎症反应可能与T细胞增殖有关，具体原因还有待进一步证实。

总之，本研究通过黏膜免疫途径，用壳聚糖包裹基因疫苗来探讨免疫不育疫苗黏膜免疫的可行性，并且研究发现PolyI:C协同细胞因子IL-15作为基因疫苗佐剂能够增强黏膜免疫反应，提高基因疫苗的免疫原性，增强基因疫苗的免疫效果，提高基因疫苗的抗生育作用，为今后基因疫苗的实际应用和进一步研制口服不孕疫苗提供了一定的参考。