蛋白质药物中的单克隆抗体Abs和Fc融合蛋白在市场上高达60多亿美元的销售额^[1]，而CHO细胞是良好的外源蛋白表达宿主，上市药物中多由其表达^{[2, 3]}。细胞培养过程中，死亡细胞裂解后会分泌蛋白酶，该蛋白酶能降解分泌到上清液中的蛋白质，从而降低目的蛋白的表达量；Robert等^[4]研究发现，高活率的细胞也会分泌一种称为Cathepsin-D的蛋白酶来降解蛋白质，从而影响目的蛋白的质量。细胞内主要有两种蛋白质降解途径，即溶酶体途径和泛素蛋白-酶体途径。泛素由76个氨基酸组成并广泛存在于生物体内的蛋白质，泛素分子能够结合底物蛋白诱导其经泛素-蛋白酶体途径降解^[5]。一些研究发现泛素存在于细胞培养液上清液和细胞裂解物中，这说明泛素可能在动物细胞大规模培养过程中有着很重要的作用^[6]。MG-132是一种蛋白酶体抑制剂，能结合蛋白酶体20s亚基的活性位点，从而抑制其活性^[7]。本实验旨在研究TNFR-Fc融合蛋白在细胞内的稳定性及降解途径，并探讨在不影响CHO细胞活力和重组蛋白活性的前提下，通过蛋白质降解抑制剂抑制TNFR-Fc蛋白降解，提高其在CHO细胞中的产量。

稳定表达TNFR-Fc融合蛋白CHO细胞、小鼠成纤维细胞株L929为实验室保存。

无血清培养基Pro CHO5(Lonza)，CD CHO Medium、DMEM培养基、谷氨酰胺(Gibco)，MG-132(Selleck)，cycloheximide、leupetin(ENZO Life Science)，羊抗人Fc、羊抗人Fc-HRP(Abcam)，次黄嘌呤、胸腺嘧啶、放线菌素D、鼠抗β-actin(Sigma)，鼠IgG-HRP(Cell Signal Technology)，驴抗羊-HRP(Santa)，Enbrel (惠氏公司)，5ml柱体积Protein A层析柱(博格隆)，TSK gel G3000SWXL凝胶色谱柱(TOSOH)。

一次性旋转管Tubespin(瑞士TPP公司)，箱式摇床ISF-4-W (瑞士科耐公司)；纯化设备AKTA Avant25(GE healthcare)，高效液相色谱仪ΜltiMate3000(Dionex)。

CHO细胞接种到Pro CHO 5培养基(包含4mmol/L谷氨酰胺，0.68mg/L次黄嘌呤和0.194mg/L胸腺嘧啶)，接种密度为1×10⁶ cells/ml，接种体积为10ml于透气生物反应器50ml Tubespin管中，培养温度为37℃，转速为180r/min，CO₂浓度为6%，3~4天传代一次。

降解途径研究：MG-132粉末于溶DMSO配制成20~40mmol/L保存浓度，－80℃保存。细胞密度达到对数生长期(约6×10⁶ cells/ml)，离心并用新鲜培养基重悬，接种密度为5×10⁶ cells/ml，培养体积为10ml，加入图 1所示的20μmol/L MG-132、CHX(cycloheximide) 20μg/ml、LEU(Leupeptin)50μmol/L，2平行管并每4h取样，免疫印迹分析TNFR-Fc融合蛋白表达变化。

图 1 TNFR-Fc融合蛋白的降解途径 Fig. 1 Degradation pathway of TNFR-Fc fusion protein Immunoblotting analysis of TNFR-Fc in lysates of CHO cells treatment with cycloheximide (CHX), CHX and Leupetin(LEU) or CHX and MG-132 . β-actin is used as loading control

图选项

MG-132浓度筛选：细胞密度达到对数生长期(约6×10⁶ cells/ml)，离心并用新鲜培养液重悬，接种密度为1×10⁶ cells/ml，培养体积为10ml，2平行管，每两天取样并按比例加入台盼蓝，用血计数板计数，记录细胞密度、细胞活率。D5加入图 2所示的MG-132浓度和10%(V/V) 补料培养基CD CHO Medium，D8收集上清液并纯化分析^[8]。

图 2 细胞生长情况 Fig. 2 CHO cell growth density(a) and vitality rate(b) Arrow represents adding MG-132 on D5

图选项

收集细胞，加入SDS裂解液(碧云天)，裂解30min，BCA试剂盒(Thermo)测定蛋白质浓度，制备5%~12%丙烯酰胺凝胶(MD Bio)，上样30μg/孔，转移到NC膜(Millipore)上，TBST洗10min×3次，5%脱脂奶粉封闭1h，TBST洗10min×3次，一抗(β-actin稀释1∶30 000；羊抗人Fc稀释1∶20 000)4℃孵育过夜，TBST洗10min×3次，二抗(抗鼠IgG-HRP稀释1∶10 000；抗羊IgG-HRP稀释1∶20 000)孵育1h，TBST洗10min×3次，加入ECL发光液(Millipore)，X射线胶片(柯达)显影。

以羊抗人IgG-Fc包被96孔酶标板，4℃过夜，2% BSA在37℃封闭1h，PBST(pH 7.4，0.1% 吐温-20)洗3次，稀释并加入待测样品及依那西普(Enbrel)标准品37℃下1h，PBST洗3次，加入碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗人IgG于37℃下1h，PBST洗3次，PNPP显色15min，3mol/L NaOH终止反应，在405nm波长下读取吸光值。通过标准品做标准曲线，计算样品中TNFR-Fc融合蛋白的含量，每个样品设3个复孔，取平均值^[9]。

蛋白质纯化：将培养液离心5000r/min×10min，取上清液经0.22μm滤膜过滤，用rProtein A(博格隆，5ml)进行亲和层析。亲和层析磷酸盐平衡缓冲液20mmol/L PB(pH 7.0)；洗脱缓冲液为100mmol/L甘氨酸(pH 3.2)，流速为1.5ml/min。

HPLC检测：收集洗脱峰回调pH至7.0，流动相为pH 7.0的500mmol/L PB，流速为0.5ml/min，测定结果并分析14~15min峰(二聚体)所占比例^[10]。

将L929细胞在含有10%胎牛血清FBS的DMEM培养基中培养，经胰酶消化后重悬，使细胞数为2×10⁵ cells/ml，加入96孔细胞培养板，每孔100μl，37℃、5% CO₂培养箱培养过夜。另取新的96孔培养板，将纯化后的TNFR-Fc融合蛋白，与阳性药依那西普Enbrel从1.25mg/ml系列稀释后，加入重组人TNFα和放线菌素D至终浓度分别为1ng/ml和2μg/ml，37℃放置30min后，转移到相应的细胞孔中，每孔50μl，37℃培养24h。每孔加入10μl的WST-8显色液，37℃培养2.5h，450nm波长处测定，EC₅₀计算采用Origin 8.0软件的生长曲线模拟，显著性分析采用SPSS 19.0软件的独立样本t检验。

利用全蛋白质合成抑制剂来研究蛋白质的降解途径已有报道^{[11, 12]}。加入全蛋白质合成抑制剂CHX处理CHO细胞0h、4h、8h后，细胞内TNFR-Fc融合蛋白水平不断降低，说明TNFR-Fc融合蛋白在细胞内存在降解(图 1左边3个泳道)；CHX和溶酶体抑制剂Leupeptin处理CHO细胞不同时间，并不能抑制TNFR-Fc融合蛋白的降解(图 1中间3个泳道)，CHX和泛素蛋白酶体抑制剂MG-132共同处理CHO细胞后，显著抑制了TNFR-Fc融合蛋白的降解(图 1右边3个泳道)，说明MG-132能够抑制TNFR-Fc经泛素蛋白酶体途径降解。综上所述，TNFR-Fc在CHO细胞内存在降解，并且是通过泛素蛋白酶体途径降解的。

确定了细胞内的TNFR-Fc融合蛋白经过泛素-蛋白酶体途径降解后，接下来研究该途径的抑制剂MG-132对细胞生长的影响。细胞进入对数期加入蛋白酶抑制剂MG-132后，低浓度0~20μmol/L的 MG-132对CHO细胞的密度和活率没有影响[图 2(a)]，其中在20μmol/L时密度达到最高值。高浓度30~50μmol/L的MG-132降低了细胞的最大密度，主要是抑制了细胞的泛素蛋白酶体的活性，导致胞内待降解的无功能蛋白质的累积影响细胞的生长。当细胞活率低于80%时[图 2(b)]，收集细胞沉淀和上清液。

细胞内累积的TNFR-Fc的量与加入的MG-132量与时间呈正相关[图 3(a)]。细胞外的TNFR-Fc在低浓度MG-132处理时表达量下降，这说明细胞外的TNFR-Fc融合蛋白分泌量减少[图 3(b)]，结合图 3(a)和(b)，可得到如下结论：加入50μmol/L的MG-132抑制蛋白质降解，在细胞内累积很多[图 3(a)]，TNFR-Fc融合蛋白在CHO细胞内大量合成；但是，分泌到胞外的蛋白质并未明显增加，说明TNFR-Fc在细胞内大量降解。加入MG-132后，未及时降解的蛋白质没有信号肽修饰而在细胞内累积，但是，加入50μmol/L MG-132后，分泌到胞外的蛋白质量(相对于加入0μmol/L MG-132组)提高了42.35%，推测MG-132作为蛋白质降解抑制剂同时也作为化学伴侣协助蛋白质折叠^{[13, 14]}。

图 3 TNFR-Fc融合蛋白胞内胞外的表达 Fig. 3 Intracellular and extracellular expression of TNFR-Fc (a)Western blot of intracellular expression of TNFR-Fc on D6/8 (b)ELISA of extracellular expression of TNFR-Fc on D2/4/6/8

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经过rProtein A亲和层析得到纯TNFR-Fc融合蛋白后，二聚体是其活性形式，HPLC检测其二聚体含量。从图 4(a)的HPLC的结果可以看出，序号7为阳性药物Enbrel，出峰时间为15.3min，均为二聚体。而在加入MG-132浓度为0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的条件下，细胞分泌表达的TNFR-FC融合蛋白以多聚体(11~13min峰)和二聚体(15min峰)形式存在，以二聚体为主；随着MG-132加入量的提高，相对于0μmol/L处理组，50μmol/L处理下二聚体的比例提高了28.60%[图 4(b)]。

图 4 纯化后的TNFR-Fc融合蛋白 Fig. 4 Quantity of purified TNFR-Fc fusion protein (a)HPLC of purified TNFR-Fc fusion protein 1~6:Represent treated with MG-132 of 0μmol/L,10μmol/L,20μmol/L,30μmol/L,40μmol/L,50μmol/L; 7: Represent Enbrel (b)The radio of dimer of TNFR-Fc fusion protein

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经过纯化后，在阻断TNFα诱导的L929细胞毒作用，EC₅₀为生长曲线OD_405nm下最大吸光值和最小吸光值的平均值所对应的TNFR-Fc浓度，EC₅₀比较结果为阳性对照组Enbrel ＜50μmol/L组＜0μmol/L组。这与TNFR-Fc融合蛋白活性成分二聚体的含量呈正相关，与理论符合。统计学分析，TNFR-Fc活性在50μmol/L处理组(EC₅₀均值为2.86ng/ml)与0μmol/L对照组(EC₅₀均值为3.79ng/ml)的差异无显著性意义(P＞0.05)。

影响动物细胞高效表达外源蛋白的因素有目的基因(整合位点、拷贝数、筛选标志等)、蛋白质序列、细胞系、细胞培养条件等^{[15, 16]}。其中Strotbek等^[17]通过筛选宿主细胞基因组中的microRNA，把筛选到的microRNA通过瞬时转染到宿主细胞，提高CHO细胞生产人免疫球蛋白IgG的能力。而Liu等^[18]通过基因工程重组技术，利用锌指酶特异性识别DNA序列的特点设计了锌指酶蛋白结合到重组质粒的启动子上，让工程细胞更高效表达目的蛋白；Fan等^[19]利用锌指核酸酶技术敲除CHO细胞的谷氨酰胺合成酶，在表达载体上含有该酶基因与目的基因，在培养基不添加谷氨酰胺的压力来促进细胞表达外源蛋白。黄芬等^[20]通过在中国仓鼠卵巢细胞中过表达热休克蛋70(HSP-70)来提高其表达抗体的能力，但并未做提高表达量后抗体的活性检测。总体上看，各方面技术的应用都致力于提高动物细胞表达蛋白的水平。

TNFR-Fc融合蛋白是糖基化复杂的蛋白质，翻译后修饰不当会引起活性的降低和多聚体的形成。所以，蛋白的质量上做了HPLC检测，TNFR-Fc融合蛋白主要的活性成分为二聚体，即图 4(a)中的15min峰(13min峰为多聚体，26min峰为溶剂峰)，随着加入MG-132浓度的增加，蛋白质的二聚体比例升高。雷云等^[9]以依那西普、注射用TNFR-Fc作为对照，检测动物细胞表达TNFR-Fc的EC₅₀分别为1.73ng/ml、1.79ng/ml、1.64ng/ml。而本实验，TNFR-Fc融合蛋白EC₅₀为2~3ng/ml，与对照组差异无显著性意义(P＞0.05)。

通过在细胞培养过程中添加蛋白酶抑制剂，防止目的蛋白降解来提高表达量的方法尚未见报道。目前，加入蛋白酶体抑制剂使大量蛋白质在细胞内累积[图 3(a)]，但是，只要能分泌出细胞的蛋白质都具有良好的活性(图 5)。重新利用这些累积的蛋白质是提高表达量的途径之一，降低培养温度使合成速率减缓，利于胞内蛋白质折叠组装分泌。再者，泛素蛋白酶降解途径的分子机制有待进一步阐明，如特异降解TNFR-Fc的泛素蛋白E3连接酶、TNFR-Fc泛素化位点。最后，在宿主细胞过表达利于细胞运输蛋白的信号肽，从而提高目的蛋白产量的方法也值得探究。

图 5 L929细胞毒作用下的生长曲线 Fig. 5 Growth curve of cytotoxic L929 cell Effects of purified TNFR-Fc fusion protein inhibited cytotoxicity induced by TNF-α in L929 cell

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