中国生物工程杂志  2015, Vol. 35 Issue (8): 51-58

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万方, 张斌, 陈民良, 陈进聪, 陈雪岚
WAN Fang, ZHANG Bin, CHEN Min-liang, CHEN Jin-cong, CHEN Xue-lan
proC及putP基因的敲除对钝齿棒杆菌产L-精氨酸生理代谢的影响
Effects of proC and putP Deletion on Physiological Metabolism of L-arginine-producing Strain Corynebacterium crenatum
中国生物工程杂志, 2015, 35(8): 51-58
China Biotechnology, 2015, 35(8): 51-58
http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20150808

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收稿日期：2015-03-19
修回日期：2015-04-17
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万方, 张斌, 陈民良, 陈进聪, 陈雪岚. proC及putP基因的敲除对钝齿棒杆菌产L-精氨酸生理代谢的影响[J]. 中国生物工程杂志, 2015, 35(8): 51-58.
WAN Fang, ZHANG Bin, CHEN Min-liang, CHEN Jin-cong, CHEN Xue-lan . Effects of proC and putP Deletion on Physiological Metabolism of L-arginine-producing Strain Corynebacterium crenatum[J]. China Biotechnology, 2015, 35(8): 51-58.
proC及putP基因的敲除对钝齿棒杆菌产L-精氨酸生理代谢的影响
万方1, 张斌1, 陈民良2, 陈进聪2, 陈雪岚1     
1. 江西师范大学生命科学学院 南昌 330022;
2. 南昌大学生命科学学院 南昌 330047
收稿日期:2015-03-19; 修订日期：2015-04-17;
基金项目：国家自然科学基金资助项目(31360219,30960012).
通讯作者, 电子信箱: xuelanchen162@163.com
摘要：为了选育精氨酸高产菌株,基于谷氨酸棒杆菌的基因组尺度代谢网络模型的指导,以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)MT-M4为出发菌株,通过基因敲除技术构建了proC和putP敲除菌株。摇瓶发酵结果表明,proC敲除菌株精氨酸产量达到9.94g/L,较出发菌株提高了15.90%,葡萄糖转化率提高了26.02%。由于其生长受到明显抑制,因此在发酵液中外源添加24mmol/L的脯氨酸,结果发现其精氨酸产量达到12.22g/L,且菌株恢复生长。putP敲除菌株精氨酸产量达到12.23g/L,较出发菌株提高了42.70%,葡萄糖转化率提高了49.31%。以上结果显示,putP的敲除比proC的敲除更有利于精氨酸的合成,putP的敲除对菌株的生理代谢基本无影响且无需外添加脯氨酸。
关键词： 钝齿棒杆菌     精氨酸     基因组尺度代谢网络模型     基因敲除     生理代谢    
Effects of proC and putP Deletion on Physiological Metabolism of L-arginine-producing Strain Corynebacterium crenatum
WAN Fang1, ZHANG Bin1, CHEN Min-liang2, CHEN Jin-cong2, CHEN Xue-lan1     
1. College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China;
2. College of Life Science, Nanchang University, Nanchang 330047, China
Abstract:The recombinant strains of C. crenatum MT-M4 ΔproC and C. crenatum MT-M4 ΔputP were separately constructed based on genome-scale metabolic network model (GSMN) of Corynebacterium glutamicum. As results shown, L-arginine production of C. crenatum MT-M4 ΔproC was significantly increased by approximately 15.90% higher than that of the original strain, reached to 9.94g/L with glucose transformation rate increased by 26.02%. However, the growth of C. crenatum MT-M4 ΔproC was obviously inhibited. When 24 mmol/L of proline was added, the arginine production reached to 12.22g/L and its growth also got well. The L-arginine production of C. crenatum MT-M4 ΔputP was significantly increased by 42.70% and reached to 12.23g/L with glucose transformation rate increased by 49.31%. The results showed that putP deletion compared with proC deletion was more conducive to L-arginine biosynthesis. The disruption of putP had no influence on the physiological metabolism of the bacteria strain and the mutant strain did not need proline added in medium.
Key words: Corynebacterium crenatum     L-arginine     Genome-scale metabolic network model     Gene knock-out     Metabolism    

L-精氨酸(合成途径见图 1)是一种含有胍基的碱性氨基酸，虽属人和动物的半必需氨基酸，但在机体的物质代谢、免疫功能等生理功能方面发挥重要的作用[1, 2]，因此在医药及食品工业中具有广泛的用途[3]。现今，L-精氨酸的工业生产主要通过微生物发酵生产[4, 5]。如何通过分子育种获得高产精氨酸的微生物菌种，是科研工作者关注的核心问题[6, 7]。早期对菌种的改造主要集中在精氨酸生物合成途径上，包括敲除负调控基因，改造精氨酸反馈抑制关键酶的靶点，增加途径酶的表达等手段达到提高精氨酸产量的目的[8, 9]。而精氨酸的生物合成却是通过细胞内的代谢网络进行的，因此从全局的角度去系统地分析细胞的代谢网络对微生物的精氨酸分子育种具有重要的意义。

图 1 L-精氨酸和脯氨酸生物合成途径 Fig. 1 The biosynthetic pathways of arginine and proline
图选项

基因组尺度代谢网络模型(GSMN)作为系统生物学研究的重要工具[10]，是以物种的全基因组序列和代谢通量分析方法为基础，通过软件分析发现一些重要的改造靶点，预测改造后产物产量变化并分析改造后对代谢网络的影响等，从而能从全局掌握细胞的代谢过程，最终达到提高终产物产量的目的[11, 12]。本课题组前期工作依据谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032与本试验室保存的钝齿棒杆菌高度同源(高达99%)的特点，以C. glutamicum的GSMN模型[13]Cg_iKK446指导C. crenatum的精氨酸分子育种，应用通量比较分析(FDCA)算法[14, 15]对钝齿棒杆菌L-精氨酸合成网络进行了系统生物学分析，预测得到了可能提高L-精氨酸产量的关键基因改造位点，包括64个基因敲除位点(pta、proC、putP等)、24个基因强化位点(ass1、Ncgl0098等)以及7个基因弱化位点(Ncgl1409、Ncgl1103等)。

在这些预测的基因敲除位点中，proC 对代谢通量的影响值为－1000，putP对代谢通量的影响值为－204，二者的绝对值都较大，且二基因有关联，proC 编码的吡咯啉羧酸还原酶[16]和putP编码的脯氨酸-钠离子协同转运蛋白[17] 分别在脯氨酸合成途径中分别扮演了催化吡咯啉-5-羧酸合成脯氨酸和协助脯氨酸进出细胞的角色。而脯氨酸合成途径与精氨酸合成途径共同竞争前体物质谷氨酸，因此脯氨酸合成途径的受阻可以为精氨酸的合成提供更多的前体物质，有利于精氨酸的积累。基于此，本课题组拟选取这两个与脯氨酸合成与运输相关的敲除位点 proC 和 putP进行敲除，以比较二者对C. crenatum 产精氨酸及细胞生理的影响并分析GSMN的准确性，以期从全局水平为精氨酸高产菌株的分子育种提供精确的指导。

1 材料与方法 1.1 材 料 1.1.1 菌株和质粒本实验所用的菌株和质粒见表 1。

表 1 实验所用的菌株和质粒 Table 1 The strains and plasmids used in this work
Strains and PlasmidsCharacteristicsSource
Strains
Escherichia coli DH5αClone host strainStored in our lab
C. crenatum MT-M4C. crenatum with argR lethal mutation and argB site-directed mutation for over-producing L-arginineStored in our lab
C. crenatum MT-M4 ΔproCC. crenatum MT-M4 with proC deletionThis study
C. crenatum MT-M4 ΔputPC. crenatum MT-M4 with putP deletionThis study
Plasmids
pMD18-TT-vector，2.7 kb，AmpR，lacZTaKaRa Co.
pK18mobsacBMobilizable E. coli vector,KmR,sacBStored in our lab
pK18mobsacB-ΔproCpK18mobsacB with the flanking regions of the C. crenatum MT-M4 proC geneThis study
pK18mobsacB-ΔputPpK18mobsacB with the flanking regions of the C. crenatum MT-M4 putP geneThis study
表选项
1.1.2 试剂及仪器

2×Taq Mix购自上海近岸科技有限公司，2×Pfu Mix购自北京天根生化科技公司；PCR产物纯化及切胶回收试剂盒购自赛百盛公司；T4 DNA连接酶、限制性核酸内切酶(HindIII和XbaI)、PMD18-T均购自TaKaRa公司；DNA质粒提取试剂盒购自Omega公司；引物合成和测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；其余试剂均为国产分析纯。

主要仪器包括电转仪、PCR仪、分光光度计、酶标仪、电泳仪、冷冻离心机、培养箱、恒温摇床等。

1.1.3 培养基及培养条件

LB培养基用于培养E. coil和C. crenatum。培养温度：E. coil 37℃，C. crenatum 30℃。感受态培养基用于C. crenatum电转感受态的制备，配方为含3%甘氨酸以及1%Tween的LB培养基；SOC培养基用于C. crenatum电转完成后感受态细胞的复苏，配方(g/L)如下：蛋白胨20，氯化钠0.5，酵母粉5，氯化钾0.186，氯化镁0.95，硫酸镁1.2，葡萄糖3.6。

种子培养基和发酵培养基用于C. crenatum的L-精氨酸发酵。配方如下：种子培养基(g/L)：葡萄糖30，硫酸铵20，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.5，玉米浆20，尿素1.5，NaOH调节pH至7.0，250ml三角瓶分装30ml；发酵培养基(g/L)：葡萄糖120，硫酸铵45，磷酸二氢钾0.05，硫酸镁0.5，玉米浆25，NaOH调节pH至7.0，250ml挡板三角瓶分装25ml。

抗生素的工作浓度：氨苄青霉素50μg/ml，卡那霉素25μg/ml。

1.1.4 引物

本实验所用引物见表 2。

表 2 本实验所用引物 Table 2 The primers used in this work
PrimersSequences(5′-3′)Restriction sites
proC-up-FCGGCCGAAGCTTGTAAAGGCAGATTTCGCAGHind III
proC-up-RGGGAAATAACGGTTGTCATGGTTCCCACACTGCCACTAACCACCCCTGTTTTG
proC-down-FGGAACCATGACAACCGTTATTTCCCCGTTATC
proC-down-RGACGATTCTAGAGTTATCCGGGAGTTACGTGXbal I
putP-up-FCGAGATAAGCTTGTTTTCCCGTCGAGGATTTGHind III
putP-up-RGAACCAGGTGTTATCGCTCATGAGGTTTCTCCTTTTGGGTAG
putP-down-FTCATGAGCGATAACACCTGGTTCAAGCCTTAGAGGGAACCAAAC
putP-down-RCATCTCTCTAGAGTTCCACGTACCAACATCXbal I
Bold bases indicated restrict sites. Underlined bases indicated complementary sequences for overlap PCR
表选项
1.2 方 法 1.2.1 proC与putP基因敲除质粒的构建

以proC基因敲除质粒的构建(图 2)为例，以C. crenatum MT-M4单菌落为模板，利用引物对proC-up-F/proC-up-R和proC-down-F/proC-down-R分别扩增proC的上下同源臂。通过PCR产物回收试剂盒回收proC的上下同源臂，等摩尔数混合，以引物对proC-up-F/proC-down-R进行重叠PCR(overlap PCR)，通过切胶回收获得proC同源臂。将此同源臂连接到pMD18-T载体上进行测序验证。验证正确后，提取质粒，并用HindIII和XbaI进行双酶切，然后与经同样双酶切的pK18mobsacB进行酶连反应后导入E. coli DH5α感受态细胞。获得阳性克隆后提取质粒，即获得了proC基因敲除质粒pK18mobsacB-ΔproC。

图 2 敲除质粒pK18mobsacB-ΔproC的构建 Fig. 2 The construction of recombinant plasmid pK18mobsacB-ΔproC
图选项

putP基因敲除质粒pK18mobsacB-ΔputP的构建如上所述。

1.2.2 C. crenatum MT-M4 的proC与putP基因的敲除

proC与putP基因的敲除通过同源重组的方法，其原理如图 3所示。以proC基因敲除为例，通过电转的方法将敲除质粒pK18mobsacB-ΔproC导入C. crenatum MT-M4感受态细胞。然后将电转复苏后的感受态细胞涂布在含Kan的LB平板上，通过引物对proC-up-F/proC-down-R筛选发生第一次同源重组的克隆子即单交换子。将单交换子接种于5ml LB液体培养基220 r/min培养16h，稀释100倍后取400μl菌液涂布于含10%蔗糖的LB平板。通过引物对proC-up-F/proC-down-R筛选第二次同源重组的克隆即双交换子，从而获得proC基因敲除菌株C. crenatum MT-M4 ΔproC。

图 3 单交换及双交换同源重组原理示意图 Fig. 3 The principle schematic diagram of single exchange and double exchange homologous recombination
图选项

putP基因敲除菌株C. crenatum MT-M4 ΔputP的构建如上所述。

1.2.3 发酵实验

将C. crenatum MT-M4 ΔproC、C. crenatum MT-M4 ΔputP以及C. crenatum MT-M4划线培养至LB平板，30℃培养48h。挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基，30℃，220 r/min培养24h。取1ml菌液接种到30ml种子培养基，30℃，220 r/min培养24h。以10%的接种量接种到25ml的发酵培养基，30℃，200 r/min发酵120h，每隔12h取样200μl。为了验证脯氨酸外源添加对C. crenatum MT-M4 ΔproC精氨酸产量的影响，在发酵培养基中分别添加0mmol/L、1mmol/L、6mmol/L、12mmol/L、24mmol/L的脯氨酸，并按上述发酵条件进行发酵实验。

1.2.4 菌体生长量的测定

将离心后的沉淀加1ml 0.125mol/L HCl中和过量的CaCO3。稀释适当倍数后于562nm波长下测定其OD值。

1.2.5 L-精氨酸产量的测定

发酵液中L-精氨酸产量的测定采用坂口试剂法。将发酵液用超纯水稀释适当的倍数至250μl，先后加入1ml 0.375mol/L的NaOH和250μl的坂口试剂于30℃水浴20min，测定其520nm波长下的OD值。

1.2.6 葡萄糖的测定

采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法[18]测定发酵液中的残糖量。将发酵液用超纯水稀释适当的倍数至1ml，加入750μl的DNS试剂沸水浴5min，迅速冷却至室温，再稀释适当的倍数后于540nm波长下测定其OD值。

2 结 果 2.1 proC与putP基因敲除质粒的构建

挑取了两个基因敲除位点proC和putP，分别利用表 2中的引物获得长为458bp和487bp的proC上下同源臂和长为477bp和507bp的putP上下同源臂；再通过overlap PCR获得921bp的proC同源臂和985bp的putP同源臂。TA克隆后双酶切与同样双酶切的pK18mobsacB进行酶连反应。然后通过转化的方法导入E.coli DH5α感受态细胞，通过引物对proC-up-F/proC-down-R或putP-up-F/putP-down-R筛选获得了阳性克隆子，表明成功构建了proC与putP敲除质粒pK18mobsacB-ΔproC和pK18mobsacB-ΔputP。

2.2 proC和putP基因敲除菌株的筛选和鉴定

敲除质粒分别通过电转导入C. crenatum MT-M4，同样使用引物对proC-up-F/proC-down-R和putP-up-F/putP-down-R进行阳性克隆子的筛选。由于proC和putP基因在敲除菌株中被敲除，因此在阳性克隆子中仅能扩增到与同源臂片段一致长度的片段，分别为901bp和961bp；以出发菌株C. crenatum MT-M4为对照组，则扩增到完整的proC和putP基因片段，长度分别为1 705bp和2 511bp。电泳检测图谱4的结果与预期结果一致，表明proC和putP基因敲除菌株C. crenatum MT-M4 ΔproC和C. crenatum MT-M4 ΔputP的构建成功。

图 4 proC和putP基因敲除菌的PCR鉴定 Fig. 4 The identification of the strains with the proC or putP deletion by PCR (a) M: DL2000 Marker; 1: Negative control; 2: C. crenatum MT-M4; 3: C. crenatum MT-M4 ΔproC (b) M: DL15000 Marker; 1: C. crenatum MT-M4; 2: C. crenatum MT-M4 ΔputP; 3: Negative control
图选项
2.3 C. crenatum MT-M4 ΔproC、C. crenatum MT-M4 ΔputP与C. crenatum MT-M4 L-精氨酸发酵实验分析

为了比较proC基因和putP基因的敲除对菌株生长及精氨酸产量的影响，对两突变株C. crenatum MT-M4 ΔproC、C. crenatum MT-M4 ΔputP和出发菌株C. crenatum MT-M4在葡萄糖为碳源的条件下进行了L-精氨酸发酵。如表 3所示，在相同的接种量下，C. crenatum MT-M4 ΔproC的生长受到了明显的抑制，120h菌体量较C. crenatum MT-M4降低了38.45%，C. crenatum MT-M4 ΔputP与出发菌株的生长基本一致；C. crenatum MT-M4 ΔproC与C. crenatum MT-M4 ΔputP L-精氨酸产量较C. crenatum MT-M4均有所提高，分别提高了15.96%和42.70%，达9.94g/L及12.23g/L。C. crenatum MT-M4 ΔproC的葡萄糖消耗量较C. crenatum MT-M4降低了11.51%；C. crenatum MT-M4 ΔputP的葡萄糖消耗量与出发菌株基本一致。虽然C. crenatum MT-M4 ΔproC的生长速率及葡萄糖消耗率均下降，但其葡萄糖转化率(Yield of L-arginine)及精氨酸产率(Special L-arginine production)分别提高了26.02%、57.00%；C. crenatum MT-M4 ΔputP葡萄糖转化率及精氨酸产率分别提高了49.31%、49.89%。因此，proC和putP基因的敲除有利于C. crenatum精氨酸的积累，以及葡萄糖转化率和精氨酸产率的提高。

表 3 两敲除菌株与出发菌株精氨酸发酵相关参数的比较 Table 3 Comparison of relevant parameters for L-arginine production of different disruption strains and original strains
StrainMaximum DCW(g/L)Maximum Arginine(g/L)Glucose consumed(g/L)Yield on glucose(g/g)Specific yield(g/g)
C.crenatum MT-M410.57±0.298.57±0.7870.67±2.440.12±0.010.82±0.06
C. crenatum MT-M4 ΔproC6.51±0.329.94±1.0162.53±0.970.17±0.021.37±0.07
C.crenatum MT-M4 ΔputP10.33±0.2512.23±1.0968.16±5.590.20±0.021.20±0.08
表选项
2.4 脯氨酸对C. crenatum MT-M4 ΔproC L-精氨酸产量的影响

proC基因的敲除，使得脯氨酸合成受阻，菌体成为L-脯氨酸缺陷型，因此外源添加脯氨酸，可以补充生命活动所需。另一方面，C. crenatum MT-M4 ΔproC菌体的生长能力的恢复，也有利于精氨酸产量的进一步提高；同时脯氨酸能够通过ocd编码的鸟氨酸环化脱氨酶合成鸟氨酸[19]，为进一步合成精氨酸提供前体物质。在发酵培养基中添加不同浓度的脯氨酸，观察菌体的生长及L-精氨酸产量情况，结果如图 5所示。随着脯氨酸浓度的增加，菌株的生长及L-精氨酸合成能力均有所提高。在发酵培养基中添加24mmol/L的L-脯氨酸，L-精氨酸产量达到12.22g/L，较出发菌株提高了42.22%；细胞生长量也恢复到了亲本水平。由此可见，脯氨酸的添加有利于菌株的生长及精氨酸的积累。

图 5 C. crenatum MT-M4 ΔproC在不同脯氨酸浓度条件下L-精氨酸产量 Fig. 5 L-arginine production of C. crenatum MT-M4 ΔproC supplemented with different concentration of proline
图选项
3 讨 论

本研究在GSMN模型分析的指导下，通过无痕敲除技术构建了proC和putP基因敲除菌株C. crenatum MT-M4 ΔproC和C. crenatum MT-M4 ΔputP。结果发现两敲除菌株的L-精氨酸产量均有所提高，这与基因组尺度代谢网络模型分析预测的结果一致。说明proC与putP的敲除有利于精氨酸的生产，同时应用基因组尺度代谢网络模型，可以为微生物的分子育种提供较好的指导。

proC和putP基因分别编码脯氨酸合成途径的吡咯啉羧酸还原酶以及脯氨酸转运途径的脯氨酸-钠离子协同转运蛋白[16, 17]。敲除putP基因后，胞内合成的脯氨酸不能运出细胞外，胞内脯氨酸的大量积累会抑制脯氨酸的合成[20]，可能使更多前体谷氨酸流向L-精氨酸合成途径或直接通过ocd基因进入精氨酸合成途径，从而提高L-精氨酸产量。proC基因的敲除同样也提高了L-精氨酸的产量，究其原因是脯氨酸与L-精氨酸的合成前体均是谷氨酸，敲除proC基因后，脯氨酸合成受阻，使得谷氨酸流向L-精氨酸合成途径，从而提高L-精氨酸产量；但L-脯氨酸是必须氨基酸，对维持菌体正常生命活动有重要意义，所以其敲除影响了菌体的生长。通过对两敲除菌株的生理代谢分析，本课题组认为putP基因的敲除对精氨酸的积累更为合理，它不仅没有破环重组菌的生长，而且在不需要添加外源营养的条件下最大程度地促进了精氨酸的积累。为尽可能地节省原料并在不影响细胞生长的前提下，阻断副产物的转运是比较理想的选择，这为后续的分子育种工作提供了一种新思路。另外，这个模型并没有预测proB基因[21](编码γ-谷氨酸激酶，见图 1)为敲除位点，从脯氨酸合成途径分析来看，它是从谷氨酸合成脯氨酸的第一个酶，敲除它可以节约1个当量的辅酶NADPH。本课题组敲除这个基因后在无外源添加脯氨酸的条件下可以提高34.14%精氨酸产量(另文报道)，比敲除proC高出18.15%，因此推测敲除proB比敲除proC更为合理。

由以上分析可知，GSMN模型存在一定的不足，分析其原因可能有以下几点：首先，C. glutamicum ATCC 13032被注释的基因有2996种，但用于构建其GSMN模型的蛋白酶只有446种[13]，这导致该GSMN模型不够完美；其次，GSMN模型分析需要相应的模型分析软件识别改造位点，由于不同产氨基酸菌的生理特征和代谢途径存在差异，模型分析软件的应用受到了一定的限制；最后微生物的细胞网络是代谢网络、转录调控网络和信号转导网络等的集成网络[22]，GSMN模型的构建主要以代谢网络为基础，由此得到的模拟结果可能不能完全准确反映这一复杂的细胞网络。因此，需要我们科研工作者进一步完善生物系统分析工具，为构建高产菌株做出更为精确的理论指导。

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