锌指蛋白是植物中最为丰富的一类转录因子之一，对植物的生长发育、抗病及抗非生物胁迫具有重要的调控作用^{[1, 2]}。根据锌指蛋白结构域半胱氨酸(C)和组氨酸(H)残基的数目和位置，可将含锌指结构域的转录因子分为C2H2，C2C2，C3H，C3HC4(IUNG finger)和C3HC5(LIM finger)5个亚类。其中，C2C2型锌指蛋白的4个半胱氨酸残基与Zn⁺以配位键相结合，形成稳定的锌指结构，参与 DNA、RNA 和蛋白质的识别、调控基因转录，并参与蛋白质之间的相互作用^[3]。

类LSD1基因编码一类特殊的C2C2型锌指蛋白，含有3个特殊的锌指结构域：CxxCxRxxLMYxxGAxSVxCxxC，又称为zf-LSD结构域^[4]。1997年，Dietrich采用图位法克隆得到该家族首条基因拟南芥AtLSD1。功能研究表明，该基因通过应答水杨酸(salicylic acid，SA)信号分子，上调铜锌超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)来清除由病原菌或者其它非生物胁迫造成的过量积累的活性氧(reactive oxygen species,ROS)，减轻氧迸发的二次伤害^[5]。Epple等在拟南芥基因组上鉴定出2个类LSD1基因AtLOL1和AtLOL2，研究结果表明AtLSD1和AtLOL1通过拮抗作用调节Cu-ZnSOD的积累来决定细胞的命运。随后在水稻、小麦、玉米等植物中发现并克隆出更多含有 zf-LSD1 结构域的基因^{[6, 7]}。功能研究表明，这类 LSD1 型锌指蛋白在细胞过敏性死亡、植物广谱抗病性以及植物对低温、长日照等非生物环境胁迫具有调控功能^[8]。

苦荞是一种药食两用的小杂粮作物，富含黄酮类化合物，对人类多种疾病具有预防治疗作用，被开发成苦荞茶、苦荞酒和苦荞芽菜等多种具有保健功能的食品，具有良好的经济开发前景^{[9, 10]}。苦荞具有很强的抗逆及抗氧化能力，能够适应高寒、高海拔、强紫外及干旱等恶劣环境^[11]。目前，关于荞麦抗逆及抗氧化的研究主要集中于黄酮类化合物和SOD酶类对ROS的清除方面^{[12 ,13]}，而其中分子调控机制的研究尚未见报道。本实验根据获得的苦荞花期转录组数据，采用RT-PCR技术克隆苦荞抗逆相关的锌指蛋白FtLOL1基因序列，并采用UV-B、2mmol/L水杨酸和4℃冷胁迫处理二叶期苦荞，探究FtLOL1基因的表达量与外界非生物胁迫的相关性，为深入探究苦荞抗逆和抗氧化提供参考。

苦荞(‘西荞二号’)购自西昌学院，种植于四川农业大学生命科学院实验室培养箱，培养条件为光照16h，黑暗8h，温度(22 ± 2)℃，相对湿度60%，培养至二叶期供试备用。

植物RNA_out(Trizol法)试剂盒、胶回收试剂盒购自天泽基因工程有限公司； PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser (Perfect Real Time)、DNA Ligation Kit、pMD19-T Simple Vector、Taq DNA聚合酶、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、SYBR Premix Ex Taq^TM II (Tli RNaseH Plus)购自TaKaRa公司；水杨酸购自西亚试剂公司；引物由上海英骏生物工程公司合成，其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。

采用改良的SDS法^[14]提取苦荞叶片总DNA，根据本实验室获得的苦荞花期转录组数据，设计一对特异引物 FtLOL1f和FtLOL1r(表 1)，PCR扩增FtLOL1 DNA序列，PCR产物纯化后送上海英骏生物公司测序。

采用植物RNA_out试剂盒提取苦荞新鲜叶片总RNA，并以其为模板使用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒反转录制备cDNA第一条链。使用特异引物FtLOL1f和FtLOL1r。PCR扩增FtLOL1 cDNA序列，PCR产物回收纯化后连接至pMD19-T Simple Vector，阳性克隆送上海英骏生物工程公司测序。

使用NCBI在线工具Blast进行FtLOL1核苷酸序列及其编码的蛋白质氨基酸序列同源性分析；使用DNAMAN进行多序列比对；利用 MEGA5.0将对比结果采用邻接法(neighbor-joining，NJ)构建系统进化树。

UV-B处理：使用10W UV-B(308nm) LED灯照射二叶期苦荞，光照距离30cm。水杨酸处理：使用2mmol/L浓度水杨酸，叶面喷施二叶期苦荞，以叶面滴水为度，以上处理均于处理前0h、处理后2、4、6、8、10和12h分别取供试样品叶片，液氮冷冻后置于－80℃备用。4℃冷处理：将二叶期苦荞转移至培养条件为光照16h，黑暗8h，温度4℃，相对湿度60%的光照培养箱，于处理前0h、处理后12、24、36、48、60和72h取供试样品叶片，液氮冷冻后置于－80℃备用。

采用植物RNA_out试剂盒提1.2.4 供试样品总RNA，并以其为模板使用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒反转录制备cDNA第一条链。设计一对实时定量PCR特异引物FtLOL1qf和FtLOL1qr，以苦荞组蛋白H3基因^[15]为内参基因，引物为H3qf和H3qr(表 1)，采用SYBR GreenⅠ染料法检测苦荞FtLOL1基因表达量，数据采用2^-△△CT方法^[16]分析，采用IBM SPSS Statistics 20 统计软件对水杨酸处理、UV-B处理和冷条件下苦荞FtLOL1基因的表达量进行数据分析。

采用特异引物FtLOL1f和FtLOL1r，以苦荞DNA为模板，PCR扩增得到2 000bp左右条带(图 1A)，测序结果表明该片段长1 821bp；采用特异引物FtLOL1f和FtLOL1r，以苦荞cDNA为模板，PCR扩增得到600bp左右条带，测序结果表明该片段长629bp(图 1B)。

图 1 苦荞FtLOL1 DNA(A)和cDNA(B)扩增 Fig. 1 FtLOL1 DNA(A)and cDNA(B) amplification of Fagopyrum tataricum M1: Marker Ⅳ；M2: Marker DL2000

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通过Blast 比对苦荞FtLOL1 cDNA和DNA序列，确定其全长DNA序列为1 720bp，包含5个外显子和4个内含子(图 2)，符合标准的GT-AG内含子剪切原则。此外，苦荞FtLOL1 cDNA序列包含一个444bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)，NCBI Blast序列比对结果表明，该cDNA序列与可可(Theobroma cacao)TcLOL1、苜蓿(Medicago truncatula)MtLSD1和拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtLOL1的相似性分别为79%、79%和74%。克隆得到的基因属于类LSD1基因家族。

图 2 FtLOL1基因结构示意 Fig. 2 FtLOL1 gene structure diagram

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DNAman分析表明，FtLOL1基因编码147个氨基酸，等电点为pI 7.89，相对分子质量为15.28 kDa，无信号肽。SOPMA预测表明，该序列由19.05% α-螺旋(alpha helix)、22.45％延伸链(extended strand)、9.52％ β-转角(beta turn)和48.98％无规则卷曲(Random coil)组成。NCBI Blast 结果表明，苦荞FtLOL1与苦荞FtLSD1相似性为58%，而与拟南芥(Arabidopsis thaliana)LOL1、可可(Theobroma cacao)LOL1和棉花(Gossypium arboreum)LOL1相似性分别为87%、90%和88%。将FtLOL1氨基酸序列与其它物种LSD1氨基酸序列进行多序列比对，结果如图 3所示，苦荞LOL1与拟南芥等植物的LSD1都具有3个共同的保守肽基序，结构为CxxCxRxxLMYxxGAxSVxCxxC，是锌指蛋白的典型的保守序列，而其它区域相似性较低。

图 3 FtLOL1与其它LSD1的氨基酸序列的比对 Fig. 3 Alignments of FtLOL1 with other LSD1 proteins The amino acid sequence in the maps which from the top to the bottom represent: Fagopyrum tataricum,Gossypium arboretum,Arabidopsis thaliana,Theobroma cacao,Oryza sativa,Bambusa oldhamii,Zea mays,Fagopyrum tataricum,Brassica oleracea,Brassica oleracea,Arabidopsis thaliana. The zf-LSD1 zinc finger protein domains are bracketed

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采用MEGA 5.0软件，采用邻接法构建基于FtLOL1氨基酸序列的系统发育进化树(图 4)。结果表明，LSD1主要分为2个大分支，在第一个大分支中，双子叶的苦荞FtLOL1与同为双子叶的棉花GaLOL1、拟南芥AtLOL1和可可TcLOL1 共聚于ClusterⅠ，而单子叶的玉米ZmLOL1、水稻OsLSD1和竹子BohLOL1共聚于ClusterⅡ，符合植物学分类系统。而另一个大分支中，苦荞FtLSD1、拟南芥AtLSD1与甘蓝BoLSD1共聚于Cluster Ⅲ。进一步分析表明第一大分支与第二大支LSD1之间氨基酸序列间差异较大，推测其具有不同的进化模式，可能具有不同的功能。研究表明，属于同一物种的拟南芥AtLSD1和AtLOL1具有相反的功能，AtLSD1参与负调控ROS介导的信号通路，而AtLOL1参与正调控，推测苦荞FtLOL1与AtLLOL1具有相似的功能^[17]。

图 4 苦荞LOL1与其他植物LOL氨基酸序列的系统发育树 Fig. 4 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of FtLOL1 and other plants

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使用荧光定量PCR分析FtLOL1在水杨酸、UV-B和4℃冷处理下各个时间段的转录水平。以苦荞组蛋白H3为内参基因，0h为对照组，使用2^-△△Ct法计算FtLOL1基因表达量变化的倍数关系。2mmol/L水杨酸处理结果(图 5)表明，FtLOL1基因表达量从2h开始下降，每隔2h均呈下降趋势，12h达到最小值，为对照组(0h)的11.9%。UV-B处理结果(图 6)表明，FtLOL1基因表达量从处理2h开始下降，每隔4h呈现明显的下降趋势，12h达到最小值，为对照组(0h)的33.8%。4℃冷处理结果(图 7)表明，FtLOL1表达量从12h开始下降，至24h达到最小值，为0h对照的50.7%，36h后表达量有所回升，稳定在对照组(0h)的60%左右。

图 5 水杨酸处理条件下FtLOL1表达量 Fig. 5 FtLSD1 expression levels under SA treatment conditions

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图 6 UV-B处理条件下FtLOL1表达量 Fig. 6 FtLSD1 expression levels under UV-B cold treatment conditions

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图 7 4℃冷处理条件下FtLOL1表达量 Fig. 7 FtLSD1 expression levels under 4 ℃ cold treatment conditions

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目前根据转录组数据，克隆基因已经成为一种成熟的技术广泛应用于目的基因的克隆，与RACE等其它技术相比，具有简便、高效、节省经费等特点。本研究根据实验室前期获得的苦荞转录组数据，筛选克隆得到一条锌指蛋白基因FtLOL1(FtLSD-one-like 1)，获得该基因的cDNA和DNA序列。核苷酸序列和氨基酸序列经NCBI Blast比对结果表明，FtLOL1与已经克隆的苦荞锌指蛋白基因FtLSD1(数据未发表)同属于类LSD1家族。

Liu等^[18]将植物LSDl型锌指结构家族分为三类分别为：含有3个zf-LSD1蛋白、含有2个zf-LSDl蛋白以及含有1个zf-LSDl蛋白，同时发现具有调控细胞死亡、植物抗病性以及植物对非生物胁迫抗逆性功能的锌指蛋白多属于3个zf-LSD1蛋白的亚家族。本研究获得的FtLOL1含有3个zf-LSD1锌指结构域，与拟南芥AtLOL1、水稻OsLSD1、玉米ZmLOL1和竹子BohLOL1等LSDl型锌指结构蛋白高度同源；而与拟南芥AtLSD1、甘蓝BoLSD1和苦荞FtLSD1的氨基酸序列对比显示，仅在锌指结构zf-LSD1(CxxCxRxxLMYxxGAxSVxCxxC)处保守，而在3个zf-LSD1间隔区域保守性较低，这也决定了该类蛋白调控功能的多样化。系统进化树分析表明，苦荞FtLOL1与FtLSD1分属于不同的进化树簇，推测苦荞FtLOL1与FtLSD1进化模式上存在差异，属于旁系同源基因，通常能够表现出不同的功能^[19]。

FtLOL1基因在UV-B、2mmol/L水杨酸和4℃冷胁迫处理下，表现出下调表达趋势，而先前研究表明，苦荞FtLSD1在UV-B、2mmol/L水杨酸处理条件下呈显著上调表达趋势，在4℃冷胁迫下基本保持稳定。苦荞中，同为LSD1型锌指蛋白的FtLOL1 和FtLSD1，对UV-B、2mmol/L水杨酸和4℃冷胁迫表现出不同的应答模式，说明两条基因可能在苦荞抗逆及抗氧化反应中存在着不同的功能。其它物种中，拟南芥AtLSD1基因功能是通过应答水杨酸(salicylic acid，SA)信号分子，上调铜锌超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)来清除由病原菌或者其它非生物胁迫造成的过量积累的活性氧(reactive oxygen species,ROS)，减轻氧迸发的二次伤害^[20]，而AtLOL1功能则相反，与AtLSD1通过拮抗作用调节Cu-ZnSOD的积累来决定细胞的命运。类LSD1型锌指蛋白作为一种转录因子，可以从正向或者反向调控同一生理过程，其中机制尚待进一步研究^[21]。

苦荞主要分布在我国西南山区，该地区干旱、昼夜温差大、紫外线强，而苦荞具有良好的适应性，表现出良好的抗逆性能。本实验克隆得到苦荞抗逆相关的锌指蛋白基因FtLOL1，分析其在UV-B、水杨酸和冷等非生物学胁迫下的响应，并且发现苦荞FtLOL1与苦荞FtLSD1对非生物胁迫存在着不同的应答模式，为研究苦荞的抗逆机制提供了新的思路。