2015, Vol. 35文章信息
- 高珊, 陈炜, 于磊, 李静, 孙彩显, 高杰, 刘牧
- GAO Shan, CHEN Wei, YU Lei, LI Jing, SUN Cai-xian, GAO Jie, LIU Mu
- 小鼠和大鼠的胚胎培养基及若干相关问题
- Culturing of Mouse and Rat Preimplantation Embryos in Various Chemically Defined Media
- 中国生物工程杂志, 2015, 35(7): 83-93
- China Biotechnology, 2015, 35(7): 83-93
- http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20150712
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文章历史
- 收稿日期：2015-03-23
- 修回日期：2015-04-20
2. 中国疾病预防控制中心 北京 100050
2. Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China
体外培养(in vitro culture；IVC)哺乳动物胚胎有多种方法，主要是用一种化学成份明确的培养基 (chemically defined medium；CDM)。CDM经人工合成、成分简单，由多种已知盐类和其他成分明确的化合物及纯水共同组成。动物早期胚胎也称移植前胚胎 (preimplantation embryo；PE)。PE在CDM内培养便于直观研究，是当前生命科学必不可少、被广泛应用的技术之一。如：研究动物和人类胚胎早期发育，人工辅助生殖技术(artificial assisted reproductive technology；ART)，转基因动物、动物克隆等，及人类某些生殖疾病治疗，CDM均是不可缺少的基本技术。卵母细胞体外成熟(in vitro maturation; IVM)，体外受精(in vitro fertilization; IVF)，胚胎IVC和发育也少不了CDM。本文系统回顾了CDM的研发思路和历史；常用CDM的主要成分，特别是胚胎工程中小鼠和大鼠所用CDM成份和功效进行了阐述。同时探讨了CDM的发展前景及研究方向。
我国一直没有系统地开展CDM相关研究和讨论。小鼠和大鼠CDM，国内仅见数篇应用效果比较的文章。本文作为一个引子供有关胚胎工程人员参考，望有益于今后我国开展CDM研究。
1 PE的IVC 1.1 胚胎及其体外存活卵母细胞和胚胎是哺乳动物体内体积最大的细胞。因动物种类不同，卵母细胞或PE大小也不同，体积(直径)70-140 μm [1, 2] 不等。如：小鼠1-细胞期胚胎约含20 ng蛋白质[1, 2]；囊胚约有100多细胞，所含蛋白质总量仍约20 ng。而兔子早期囊胚含80 000个细胞 [1, 3]，蛋白质增加到200 μg [1, 4]。
动物PE的IVC条件苛刻，稍有不适即可引起细胞质膜和染色体改变，或导致细胞死亡。胚胎体外培养条件包括：(1)环境和物理因素：温度、光照、pH值、渗透压、离子浓度、周围环境气体成分和比例、培养用器皿等 [1, 5, 6]；(2)CDM含胚胎需要、能维持和胚胎生长发育，分裂繁殖的化学成分：多种盐离子、能量物质、生长因子 [1, 5, 6](可促进胚胎发育和正常分裂的多种生长因子。部分可能是目前未知、有待研究的)、动物白蛋白或含蛋白等大分子的各种动物血清。
1.2 CDMCDM之所以被广泛利用，因为它能满足胚胎体外培养需要的基本条件，且拥有众多优点： (1)成份简单、便于配制。一般由9种(或大约12种)化学成份明确的试剂组成。主要有Na+、K+、Ca2+、Cl- 和Mg2 + 等离子；以及葡萄糖(glucose)、乳酸(lactate)和丙酮酸(pyruvate)[5, 6] 等胚胎代谢所需的能源物质。CDM配方可随需要变化、调控。(2)影响胚胎发育的 “成分不确定”(ill-defined)生物制品尽量排除；或仅为补充物质加入已知CDM。这类CDM有时被称为 “半-化学成分明确培养基”(semi- chemically defined medium)。常用添加物有：牛血清白蛋白，各种动物血清，蛋黄和蛋白等。CDM中不含 “成分不确定”动物制品，可减少病毒传播危险；并可预防、杜绝动物间传播疾病。(3)CDM可直观研究PE早期发育，满足多种生物技术需求。如：胚胎可在CDM中进行基因控制、修饰、冷冻保存等。CDM也是克隆繁殖、干细胞、基因诊断和治疗技术不可缺少的基础技术。(4)重复性好。可在任何时间，世界任何地点的试验室配制同样CDM [5]；同时，CDM还便于保存和运输。
2 研究方法和前景 2.1 CDM设计Biggers [5]和Smith[6]等介绍，CDM的设计方法和研究，一开始即沿着若干不同方向，遵循各自的原则均取得一定进展：(1)根据胚胎生理知识设计CDM。如：动物和人新陈代谢知识。通过测定动物胚胎在输卵管、子宫内不同发育期的正常化学成份，渗透压、pH值、温度等物理参数进行设计。(2)模仿胚胎动物体内(in vivo)的微环境，用仿生学方法或称 “回归自然原则”(“back to nature” principle)[2, 5, 6]。CDM应适应PE不断生长发育的变化 [5]。胚胎所处输卵管或子宫内微环境是动态变化的，每时每刻均不同。但CDM不能确保PE模仿动物体内微环境时时都处于最佳状态[5]。据此，设计出一种根据PE不同生长阶段分步培养的培养基，称序列培养基(sequential medium)，可跳跃似地间接模仿动物体内动态变化。(3)“让胚胎来选择” (“let the embryos choose” principle)[5]。设计新CDM，当改变原配方某一化学成份浓度时，会影响其他化合物产生极其复杂化学变化，维持CDM中所有其它化合物的成份、浓度和相互间比例不变非常困难。因此，新设计CDM最终由胚胎培养的效果来选择，而不考虑每种化合物成份的变化。(4)第四种方法是简化原有培养基成份。如：CDM只要能满足PE生长、发育的必须条件即可。根据这一原则，可适当忽略、减少已知配方内个别“非必须成份”，简化CDM的成分和用量。(5)经验表明，某些动物常没有适当CDM。如布氏田鼠(Brandt′s vole)，目前尚没有现成CDM可用，有待进一步研究、开发(本实验室，未发表资料)。研制一种新CDM，可借鉴近似物种动物所用的CDM，对原配方进行修饰、改良，经实验最佳效果后确定可用的CDM。
2.2 CDM评价CDM评价可参考Biggers等[5]相关文献。(1)探讨每一种动物PE在适当CDM内的培养细节。(2)讨论特定CDM内培养的优、缺点。(3)考虑PE培养后的长期效应。(4)CDM的商业化。
3 历史回顾 3.1 前期研究动物细胞IVC研究，可追溯到近一个半世纪前。为研究青蛙体外心跳，1883年英国生理学和药理学家悉尼·林格(Sydney Ringer)[7]首次人工配制生理盐水(physiological saline; 0.75% NaCl)对蛙心脏进行灌注。这是第一种化学成份明确，用于短时维持动物组织在体外生存，并保持和动物体一样pH和渗透压的CDM。随后,为了更好维持蛙的体外心跳，Ringer在生理盐水中适量加入营养成份。如：各种动物血浆、细胞质液和结晶血清白蛋白(albumin)等。
3.2 林格氏液生理盐水基础上，悉尼·林格通过添加细胞生命所需各种盐离子模仿细胞外环境，由NaCl,KCl,CaCl2 和碳酸氢钠组成，这些生命所必须的盐离子，可通过细胞膜的离子通道进行交换，与周围微环境保持一定pH和渗透压平衡，维持细胞培养最基本的生理需求。这种溶液被称为林格氏液(Ringer’s solution)[7]。标准的林格氏液在每1L纯水中含6.5g NaCl,0.42g KCl,0.25g CaCl2 和0.2g 碳酸氢钠(NaHCO3)。
Hannig [8]、Harrison [6, 9]在悉尼·林格研究基础上对多种动、植物细胞和组织进行了IVC研究。Lewis等[5, 10, 11]先驱首次用鸡胚作为培养基。 希望“用人造培养基满足鸡胚胎体外进行发育的需要。优点是可使每个人都能在这种成分已知液体内进行研究工作，并可发现、解决许多新问题” [10]。
3.3 KRB液Krebs和Henseleit[9, 12]在林格氏液基础上调整了各种盐浓度，适量增加了磷酸盐和硫酸镁，针对动物体细胞设计出一种相对有效的CDM，即著名的克雷布-林格氏碳酸盐溶液(Krebs’s Ringer Bicarbonate),简称KRB液 [5, 13, 14](表 1)。
KRB是一种典型基础培养基，目前仍被广泛用于多种动物体细胞、组织和器官的分离及培养。而且现代众多动物组织培养基，均是在KRB基础上发展起来的。如早期用于胚胎培养的惠腾氏液等[1, 13, 15, 16](参见4.1 惠腾氏液；表 1)。
4 早期胚胎CDM早期动物胚胎多移植在活动物体内培养；或以盐溶液辅以鸡蛋卵黄或蛋白作为培养基。如Lewis和Gregory [17] 在Science杂志的论文；Pincus [18]兔子早期胚胎的IVC研究；Hammond [19]发表在Nature杂志的论文，首次证明了小鼠8-细胞期胚胎可在“成份不确定的”培养基内短期培养。
4.1 惠腾氏液利用小鼠作为PE培养模型特别引人关注。研究表明，小鼠PE培养3~4天，胚胎发育和细胞增殖所需条件有限。外界培养基只要提供简单无机盐和微量氨基酸、维生素即可使小鼠受精卵(合子)发育到囊胚期 [19]。这一研究成果反过来也为设计PE所用CDM提供了有力的理论和技术支持。
Whitten[15, 16] 在Nature杂志首次报告了小鼠PE利用CDM培养成功。此前哺乳动物胚胎主要在一些成份复杂的生物体液内进行培养。这项成果是胚胎研究史上一个里程碑。以Whitten名字命名的惠腾氏液(WHitten’s solution)中，Whitten把8-细胞期小鼠胚胎成功培育到桑葚胚期。惠腾氏液是在KRB基础上添加了适量葡萄糖和牛血清白蛋白(Bovine Serums Albumin；BSA)[5, 6, 13] 作为胚胎体外继续发育的营养和能源(参见表 1)。惠腾氏液是一种基础哺乳动物PE培养液。由于成份简单便于配制，目前仍用于包括非人类灵长类等多种哺乳动物胚胎的采集和IVC。
4.2 PE的CDM发育阻滞Whitten早期研究 [15, 16, 20]表明，发育早于8-细胞期的小鼠胚胎在惠腾氏液内培养并不理想。上述实验中当小鼠2-细胞期胚胎在惠腾氏培养基中培养，胚胎发育会受阻，细胞不能正常分裂。这种哺乳动物胚胎IVC停止发育或闭锁现象称 “体外发育障碍” 或 “2-细胞阻滞” [1, 5, 6, 13, 15, 16, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32]。动物PE的CDM发育阻滞现象是一种多因素的结果。研究证明：
(1)胚胎IVC发育阻滞和所用CDM有关。胚胎在体内很少发生这类发育阻滞[25]。说明CDM内含不宜胚胎体外继续生长和发育的因素。Abramczuk等[32]研究表明,在某些CDM中添加适量EDTA (0.01 mmol/L[5]) 可克服小鼠 “2-细胞阻滞”。这一发现表明 EDTA可从CDM中去除那些痕量、有害螯合物。又如：当培养基中含磷酸盐和过量葡萄糖，PE培养时即能产生 “2-细胞阻滞” [5, 6, 14, 15, 22]。可见选择适当CDM或调整、优化某些CDM成分和盐溶液比例，可避免这些人为因素造成的“2-细胞期” 阻滞。
(2)胚胎体外发育阻滞和动物本身遗传基因及类型有关 [2, 5, 6, 14, 25, 26, 27, 28]。Whitten和Biggers[6, 13, 20] 研究显示，“2-细胞阻滞” 与小鼠的遗传品系(strain)有关。实验中，一些近交系(inbred)小鼠出现发育阻滞，但它们的杂交F1代在同一CDM却没有发育阻滞现象。这一试验说明，引起PE发育阻滞主要是来自卵母细胞本身 [6, 13]。
(3)在特定CDM中培养，不同动物PE出现 “2-细胞阻滞”时间和几率有一定差异；还与动物不同“种”、“属”的遗传特性，及种群(例如：经济动物或实验动物的不同品种或品系)差异有关。此外，每种动物EP体外培养发育阻滞不一定都发生在 “2-细胞期”。如：小鼠胚胎发育阻滞在2-细胞 [5, 6, 7, 13, 14, 15, 16, 20, 23]；而大鼠胚胎发育阻滞在2细胞期 [21, 22, 26, 29] 或8细胞期 [14]；仓鼠(hamster)发育阻滞在2细胞到4-细胞期 [1, 21, 22, 29],或2细胞和8细胞期 [14]；人类和非人灵长类胚胎发育阻滞发生在4-细胞到8-细胞期 [1, 6, 21, 27]；牛胚胎CDM发育阻滞发生在8-细胞期 [21, 25, 28, 31],或8细胞到16-细胞期 [14, 29]；绵羊和山羊CDM发育阻滞均发生在8细胞到16-细胞期[14, 21, 25]；猪发育阻滞发生在4-细胞期 [14, 21, 25, 29]。上述一些动物胚胎CDM培养发育阻滞的时期差异，可能是不同作者在培养同一种动物PE时，采用了不同CDM，因而产生不同结果。
(4) 虽然研究和探索“2-细胞阻滞” 现象已有多年，但其产生的全部原因和机理，至今未彻底研究清楚 [5, 6, 13]。特别是在基因和分子水平上的研究。另外，一些野生动物和特种实验动物的“2-细胞阻滞” 更待进一步深入研究。
5 小鼠胚胎培养基上世纪50年代Whitten[16] 在惠腾氏液内添加了乳酸钠(Na-lactate)取代葡萄糖作为胚胎继续生长发育所需能源，成功地使小鼠早期胚胎从2-细胞发育到囊胚期。Whitten [20]在上述CDM基础上加以改良，相对减少了NaCl浓度(渗透压降低到242 mOsm)[16, 20]。同时改良CDM中适当增加了乳酸钠和丙酮酸钠(Na-pyruvate)；首次利用C57BL/10J×SJL/J的F1代杂交小鼠，完成了1-细胞期合子(zygote)发育到囊胚期(可移植前胚胎阶段)的整个过程。
早期研究中Brinster [13, 33, 34]; Bigger和Brinster [13, 35]；Brinster和Thomson [13, 36] 等研究了小鼠2-细胞到8-细胞期胚胎在CDM中的糖酵解 (Glycolytic) 和三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle；or,citric acid cycle)通路。研究表明，在CDM中只需适量添加丙酮酸 (pyruvate)、乳酸盐 (Na-lactate)、草酰乙酸盐 (oxaloacelate) 以及盐酸烯醇磷酸盐 (phosphoenolphosphate)，即能使小鼠PE在此CDM内成功培养并得到正常发育。而小鼠8-细胞期以上胚胎，可在CDM中适量补加蔗糖后正常发育，并可发育到囊胚期 [13]。
5.1 上世纪70-90年代小鼠胚胎培养液上世纪50年代起开始了哺乳动物PE在CDM中培养的研究。但直到上世纪80年代才真正使多种动物卵母细胞能在CDM中成活、受精，并继续发育、分裂繁殖到囊胚阶段[5, 6, 21]。CDM研究主要成就集中体现在一些经济动物和试验动物PE的IVC。其原由是生物技术革命，特别是各种现代动物繁殖技术的改进和发展，对胚胎IVC研究、应用等需求日益增多。如：卵母细胞卵IVM、IVF和胚胎的IVC等均离不开CDM。CDM在这个时期发展也进入了一个高峰。值得一提的有Bigger和Lawitts [37, 38, 39] 及他们同事对小鼠CDM的研究做出的杰出贡献 [22]。小鼠PE的IVC被作为哺乳动物、人类胚胎研究的模型，对如何设计哺乳动物的CDM起了极重要作用。应提到的是人类和其他哺乳动物PE的CDM研究，反过来也为小鼠和大鼠CDM的研究及设计提供了参考。
5.1.1 M16和M2Whittingham [40] 在泰氏液 (Tyrode’s solution [41]) 的基础上，经修饰发明了小鼠胚胎用培养基M16 [6, 13, 40](参见表 2)。标准的M16在上世纪70年代初定型，现已商业化，是世界各地实验室仍常用于小鼠胚胎实验的一种CDM。M2[42]在M16基础上添加了HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)。利用HEPES可适当延长培养基和其中培养物在自然环境下(二氧化碳培养箱外)的使用时间。因其可较长时间维持一定的pH平衡，便于自然环境下操作应用。M2更适于小鼠等动物在采集卵母细胞，或胚胎在相对较长时间的体外操作等环节应用。
| 化学成份 Components | Whitten (mmol/L) | M16 (mmol/L) | CZB (mmol/L) | SOM (mmol/L) | KSOM (mmol/L) | mHTF[5] (mmol/L) | MTF (mmol/L) |
| NaCl | 118.00 | 95.00 | 82.00 | 85.00 | 95.00 | 101.60 | 94.70 |
| KCL | 4.74 | 4.80 | 4.80 | 0.25 | 2.50 | 4.69 | 4.78 |
| KH2PO4 | 1.18 | 1.20 | 1.20 | 0.35 | 0.35 | -- | 1.19 |
| NaHCO3 | 24.90 | 25.00 | 25.00 | 25.00 | 25.00 | 25.00 | 25.00 |
| CaCL2 | 2.50 | 1.70 | 1.70 | 1.70 | 1.70 | 2.04 | 1.71 |
| MgSO4 | 1.18 | 1.20 | 1.20 | 0.20 | 0.20 | 0.20 | 1.19 |
| Na-lactate | -- | 23.00 | 31.00 | 10.00 | 10.00 | 21.40 | 4.79 |
| Na-pyruvate | -- | 0.33 | 0.27 | 0.20 | 0.20 | 0.33 | 0.37 |
| Glucose | 5.60 | 5.60 | -- | 0.20 | 0.20 | -- | 3.40 |
| Glutamine | -- | -- | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | -- |
| EDTA | -- | -- | 0.11 | 0.01 | 0.01 | 0.10 | -- |
| BSA(mg/ml) | -- | 4.00 | 5.00 | 1.00 | 1.00 | -- | 4.00 |
| Osmolarity (mOsm)[6] | 290 | 275 | 229 | 256 | 280-292 | -- |
CZB是Chatot等[43]设计的一种专用于小鼠胚胎的CDM。该培养基以三个主要设计者名字的首字母命名。CZB主要于小鼠PE，可把某些小鼠的合子在体外培育到囊胚期 [5, 6, 13]。与M16比较，CZB的配方减少了NaCl含量，因此也相应降低了渗透压；但CZB适当加大了乳酸钠含量 [13] (表 2)。值得注意的是CZB不含蔗糖，且同时省略了磷酸盐。因此，小鼠PE在CZB内培养48小时后如需继续培养，需在继续应用的CZB内补加5.56 mmol/L蔗糖[44]。
5.1.3 MTFMTF是Gardner 和Leese (1990) [45]在M16基础上改良的一种CDM，它一直被推荐用于小鼠胚胎IVC[5, 6, 45]。该培养基主要通过模仿小鼠输卵管液(mouse tubal fluid)成分设计，故称MTF液 [5, 6, 13, 45]。MTF 和M16的差别，仅表现MTF内乳酸钠和葡萄糖含量略有减少(表 2)。实践中发现，当人工CDM所含乳酸钠和葡萄糖与小鼠输卵管液内浓度相当时，某些近交系小鼠PE在这种CDM内培养却并不能很好地适应[5]。
5.1.4 SOM和KSOMSOM [13](表 2)是一种配方简单，优化组合后用于小鼠胚胎的CDM，命名源自英文全称Simplex Optimization Medium。SOM由Lawitts和Biggers[37, 38]首先介绍。上世纪90年代SOM曾被用于CF1等封闭群小鼠PE培养 [5, 37, 38]。
试验表明SOM对大部分近交系小鼠的PE培养效果不十分理想，仅适于部分封闭群小鼠的PE。此后，Lawitts[39]在SOM基础上进行了改造，适当提高了NaCl和KCL浓度，即把SOM内NaCl浓度由85.0mmol/L增加到95.0mmol/L；特别是新配方中把KCl浓度增加了10倍，由0.25mmol/L调整到2.50mmol/L，使K + 离子浓度更适于近交系小鼠PE。K + 离子优化的SOM称KSOM (potassium simplex optimization medium，表 2)[13, 44, 46]。KSOM的关键是通过NaCl适当调整了CDM的渗透压；间接有效地控制了胚胎细胞生长繁殖时的体积变化。目前，KSOM也是一种已商业化CDM，与CZB同样是一种实验室小鼠PE的常规培养基 [6, 13, 44, 46]。
5.2 小鼠其他相关的培养基小鼠胚胎CDM研究得到大力发展同时，人类胚胎的CDM在“试管婴儿”等研究和应用需求下也得到了长足发展。如：80 年代中叶，Quinn等[47]设计的HTF(human tube fluid；意为人类输卵管液)，是用于人胚胎的一种常规CDM。HTF配方主要综合了其他研究小组对人类输卵管液盐类化合物浓度分析的结果。值得注意的是，因PE在不同发育阶段，母体体液会随时变化，所以HTF仅是一种最低限度模仿人类输卵管液成份的CDM，它并不能确保胚胎完全像处于母体内的自然界环境。实践表明，HTF和mHTF(modified HTF; 优化改良的HTF)也是常用于小鼠和大鼠某些品系试验的一种可选用培养基 (表 2)。
6 大鼠胚胎培养基由于动物遗传基因不同，各自种质(卵子和精子)及胚胎也存在极大的差异。因此，应设计使各种动物PE能处于最佳生长条件、不同的CDM。大鼠和小鼠分类学中分别属两个不同的属(genus)。大鼠(Rat；Rattus norvegicus)属大家鼠属 (Rattus)，实验室常用大白鼠是褐家鼠的白化变种。小鼠为小鼠属 (Muss)。两者不仅外形、体积不同，其生殖生理和胚胎、精子的遗传、结构及生理等均有极大的区别。因此，两者PE在所用CDM也存在极大差异。用于小鼠的各种CDM对大鼠PE进行培养并不理想。
6.1 R1ECM上世纪九十年代，大鼠作为实验动物开始被人们重视，并被大量用于研究人类疾病的动物模型。随之而来一些相关实验技术，如：大鼠的IVF、IVC等也陆续得以研究和开发。Miyoshi和Funahashi [48]；Miyoshi和Abeydeera [49]等以及Miyoshi,和Niwa [50]等利用改良的仓鼠(hamster)培养基(HECM-1)[51] 开始研究大鼠(Wistar)PE的IVC。Miyoshi 等人在1995年 [49]和1997年 [50]发表的文章中对原配方做了改进，适量减少了NaCl含量 (表 3)，渗透压降低到246 mOsm，维持在一个相对低水平。这种CDM可初步满足Wistar等大鼠PE的IVC，被命名为R1ECM (rat 1-cell embryo culture medium)。Miyoshi等人文献表明，R1ECM中61%的Wistar大鼠PE可发育到囊胚期 [49]。在R1ECM中补加20种必须氨基酸 (essential amino acids,EAA,MEM; GIBCO)、非必须氨基酸 (nonessential amino acids,NEAA; GIBCO),以及同时补加适量谷氨酰胺(glutamine)，Wistar大鼠PE可提高囊胚期发育率 [50]。
Megumi 等[52]利用Wistar 和SD × DA杂交大鼠进行实验；Seiji Kito等[53] 利用测定CDM中氧压(oxygen tension)和mR1ECM中添加牛血清白蛋白(bovine serum albumin；BSA)等试验表明，除Wistar外，某些品系大鼠的PE在R1ECM内培养效果并不理想(suboptimal)[53, 54]。
大鼠IVF和IVC所需要CDM的最佳渗透压水平与小鼠IVF和IVC也存在很大差异。Jiang[54]报道了一种SD大鼠体外IVF培养基mR1ECM。利用大鼠精子在相对高渗透压活性更好这一特点，R1ECM中增加了NaCl浓度(渗透压：310~360 mmol/L)(表 3)，更有利于大鼠的体外受精。
| 化学成份Components | R1ECM [49, 50] | mR1ECM [54] | R2ECM [29] |
| NaCl | 80.0/76.7 | 110.0-140.0 | 77.00 |
| KCl | 3.2 | 3.2 | 1.34 |
| CaCl | 2.0 | 2.0 | 1.78 |
| MgCl | 5.0 | 5.0 | 0.44 |
| NaHCO3 | 25.0 | 25.0 | 25.00 |
| Na-lactate | 10.0 | 10.0 | 25.00 |
| Na-pyruvate | 0.5 | 0.5 | 0.59 |
| Glycose | 7.5 | 7.5 | 7.50 |
| EAA (2%,v/v) +NEAA (1%,v/v) | --/+ | + | -- |
| Glutamine | --/0.1 | 0.1 | 1.00 |
| Polyvinylalcohol(PVA) | 1.0 mg/ml | 1.0 mg/ml | -- |
| BSA | -- | -- | 0.3% |
| Osmolarity (mOsm) | 246 [50, 51] | 310-360 [55] | 244 [30] |
同一篇报道中还介绍了另一种胚胎培养基IVF-20(Vitrolife AB,Gteborg,Sweden)，在其原基础上增加NaCl浓度(渗透压：340mmol/L)也取得较好IVF效果。两者均可以提高SD大鼠IVF受精率，特别是后者mIVF-20 (+NaCl)[54]。
大鼠PE在R1ECM中培养，其发育到囊胚期的成功率远不如小鼠PE在KSOM内的培养成功率。除动物本身因素外，R1ECM培养基似仍有修改配方的可能和必要。有待依据最新科技成果不断创新，进一步完善大鼠PE在CDM中培养的效率。
6.2 R2ECMGoh等[29]研究了Wistar大鼠2-细胞期胚胎在体外培养发育到囊胚期的发育情况。这些2-细胞期胚胎由大鼠输卵管直接冲洗获得。他们所用的CDM(R2ECM)与1-细胞期胚胎所用R1ECM不同。主要表现在R2ECM配方中降低了KCl、CaCl和MgCl的浓度；同时用0.3% BSA代替PVA；并较大程度提高了乳酸钠 (Na-lactate) 和谷氨酰胺 (Glutamine) 浓度(表 3)。他们的研究报告表明，大鼠1-细胞期和2-细胞期胚胎所用CDM是有很大差异的。
值得我们注意的是，当前文献所报道应用于大鼠PE的CDM，无论哪一种似仍有进一步改良的必要和空间。
7 影响胚胎CDM的若干问题影响动物胚胎IVC成功的因素很多。下面仅就CDM一些常用成份和影响因素进行初步讨论，特别是针对小鼠和大鼠PE培养所用CDM。
7.1 葡萄糖、丙酮酸和乳酸盐早期研究根据糖酵解途径(glycolytic pathway)，即注意到CDM中葡萄糖成份和含量问题。对小鼠和人类早期胚胎的研究,大多数科学家研究的结果都认为葡萄糖会影响PE早期发育。例如：Whitten[15, 16] 研究发现，葡萄糖不支持小鼠8-细胞期以前PE发育。丙酮酸盐(Na- pyruvate)在所有哺乳动物PE糖代谢均不可缺少，可作为一种促进PE在CDM 中发育、并可替代葡萄糖的化合物之一 [55]。通过超微量化学分析 (ultramicrochemical analysis methods)确定小鼠输卵管内各种盐离子及Glucose、pyruvate和Lactate浓度。测量和研究分析结果表明，小鼠PE处在输卵管壶腹部时，丙酮酸盐和乳酸盐浓度明显增高，葡萄糖浓度却很低[5, 56]。测量数据最终为设计合理、有效的CDM提供了依据。Whitten[20],Quinn[57]和Biggers[5] 等研究结果都有力支持了这一论点。现在，丙酮酸盐和乳酸盐作为哺乳动物PE早期IVC发育的能源已经被普遍接受。
研究认为CDM中葡萄糖抑制了PE的糖酵解(glycolysis)。葡萄糖在小鼠和仓鼠PE产生2-细胞阻滞被称为 “葡萄糖抑制” 或 “代谢抑制(Catabolite expression)” [58, 59]。但观察大鼠CDM培养结果却与此相反，适量增加葡萄糖含量不但不产生抑制现象，反能够刺激大鼠胚胎早期生长发育 [29, 48, 49, 50]。其中除遗传背景外，其他可能的原因却一直未得到满意解答，有待进一步研究。
小鼠等动物PE发育到8-细胞期后需要增加大量能量，这时葡萄糖能量通路被打开[5]，可促进胚胎发育和卵裂作用，作为维持PE繁殖、分裂、生长的能量[5, 60]。因此，动物体外培养相对晚期的PE，多数需在CDM中适量增加葡萄糖。
7.2 磷酸盐Yanagimachi[59]首次证明CDM中，添加磷酸盐会影响仓鼠早期PE发育，特别当磷酸盐和葡萄糖同时存在情况下，会产生2-细胞阻滞。随后，Cross等 [55]相继证明了CDM中同时含磷酸盐和葡萄糖也会影响小鼠(和其他动物)PE体外发育，产生2-细胞阻滞。但某些动物EP在CDM培养中，并非绝对不能含磷酸盐。Miyoshi等[48]在研究Wistar大鼠PE的IVC时证明了这种情况。研究表明，CDM(mHECM-1)中磷酸盐浓度降低到极低水平，如，浓度0~0.01mmol/L，且同时含7.5mmol/L葡萄糖，并不存在2-细胞阻滞现象。
7.3 氨基酸(amino acids)哺乳动物PE所用CDM中是否添加氨基酸从一开始就有争议。Whitten[20],Cholewa [61] 等认为小鼠PE发育不需要氨基酸。而Brinster [62],Gardner [63, 64]等实验证明，CDM不添加其他蛋白质时(如：BSA由PVA代替)，小鼠PE在此CDM中是需要补充氨基酸的。且氨基酸浓度会直接影响PE培养结果。适当变化CDM中20种主要EAA 浓度，对最终形成囊胚率影响不大；但适量增加某些氨基酸，可显著提高囊胚形成率和孵化率[5, 30]。Gardner [63, 64]在这方面做了广泛研究。总的来讲，EAA和NEAA在CDM中是生物合成、能源、代谢的前体，同时对渗透压、pH值及螯合重金属均发挥重要作用，其对PE生长发育是一种综合影响[5]。
CDM中氨基酸，其中glutamine(Gln)被更多地得到重视和研究[5]。在CZB [43]和KSOM[39]等众多CDM中 [5]，Gln常用浓度是1.0 mmol/L [5, 13]。主要用于克服小鼠2-细胞阻滞。应当注意的是当CDM中Gln代谢产物氯化铵(ammonium chloride)含量过高，浓度达到0.3mmol/L [5]，会直接影响卵母细胞、合子体外培养，以及PE的继续生长发育[5]。
7.4 渗透压和pH值 7.4.1 pH对PE影响PE细胞内蛋白正常功能与其周围环境酸碱度有关，同时依赖于细胞内蛋白质氨基酸化合物的离子程度 [5]。小鼠胚胎发育时pH范围在5.78~7.78 [65]; 人卵母细胞的pH约等于7.4 [5, 66]。在实践中，CDM应等于或接近动物输卵管和子宫正常体液的pH，即中性偏碱[63]。因此，设计PE所用的CDM时，应综合考虑各种化合物离子量的总和及pH值。各种动物PE所用CDM，pH值约等于7.0~7.4 [5, 6]。为了维持pH在7.2左右，CDM内除了必要的化合物外，一般含有25.0mmol/L的碳酸盐(bicarbonate)。即PE培养所用CDM是处在在一个HCO3 / CO2系统内。这样，在一定的时间、范围内可以维持pH的平衡。同时，如长期培养PE，培养设施应置于周围CO2的环境是5.5%~6.5% 的二氧化碳培养箱内 [5]。
7.4.2 渗透压(Osmolarity)对PE影响胚胎培养基的渗透压如过高或过低，均会影响胚胎内细胞质中离子的非正常流动，影响细胞的生长发育，甚至会引起细胞变形或细胞膜破裂，最终导致胚胎死亡。因此，在CDM的设计中，渗透压是一个极重要的影响参数 [5, 6, 30, 65]。如：实验表明大鼠IVF液中需要一个相对较高的渗透压环境310~360 mOsm [55]，有利于精子穿透受精。但此后大鼠PE继续培养却需要CDM维持在一个相对较低的渗透压环境(244 mOsm)[13, 29, 48, 49, 50, 54]。Smith等[6]合作的专著《胚胎培养：方法和操作方案》(“Embryo Culture (Methods and Protocols)”)一书，其中专设有一章讨论各种CDM渗透压的相关问题。同时，书中列举了多种CDM的渗透压值，可供参考。
7.5 ROSPE在体外培养，有时虽然细胞仍处于存活状态，但可能因受到某种伤害而不能继续发育下去。例如：PE在培养短时间遇到CDM出现高浓度的自由基 (free radicals),特别是活性氧 (reactive oxygen species；简称ROS)[67, 68]。在某些条件下，氧气分子O2(dioxygen)可以提高CDM中的ROS；过氧化物(superoxide anion)的阴离子(O2-)；过氧化氢H2O2(hydrogen peroxide) 和化合物中的羟基HO- (hydroxyl ion) 均可以引起CDM中ROS升高[69]。这些离子在一定情况下，浓度的升高会危害PE细胞内的DNA、RNA以及蛋白质 [5, 70])。因此，设计培养PE的CDM时，一定要避免和控制CDM中ROS的存在和含量。
7.6 生长因子这里的促生长因子(growth promoting factor)指的是存在于雌性哺乳动物输卵管和子宫内，由相关细胞分泌、合成的，或是同源的，能影响胚胎生长和PE发育的一类生长因子。其化学成分可能是某类特殊的氨基酸，也可能是激素或类激素。这些促生长的因子有的来自母体，也有来自卵母细胞或胚胎的自身分泌，或是通过其他途径[71]。例如：在CDM中添加一定量的牛磺酸(taurine)和其前体亚牛磺酸(hypotaurine)可促进囊胚的生存率和质量 [70, 71, 72]。胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor)可以促进卵母细胞的受精率和质量[73]。
在CDM中适当地添加某些PE的促生长因子，已经成为当前CDM研究的一个新热点。
8 CDM研究前瞻 8.1 小鼠和大鼠的CDM世界是一个人类不断认识的过程，上面我们所介绍的CDM发展历史同样也证明了这一点。由于胚胎体外培养知识的不断增加和完善，同时，也会根据在实践中所得到的实验数据，使很多现有CDM配方不断地得到改良和完善。目前,即使是小鼠、大鼠，以及人类等PE所应用的多种CDM，包括一些已经商业化的CDM，仍有一定改良的空间。另外，通过对现有胚胎发育知识的重新认识和提高，会不断增加一些PE生长发育所需要的、特殊的、以前未知的“补充成分”。这些CDM中全新的“补充成分”有可能刺激并促进胚胎更好地生长发育，提高囊胚率或移植成功率。例如：利用一些人工分子标记物来测定CDM 中添加物的浓度，可以降低PE培养时所产生某些成分的毒害水平，以达到优化CDM的目的。
8.2 其他动物的CDM由胚胎发育、生长因子、基因表达和CDM等因素所获得的综合知识，一直影响着PE培养条件的认识，影响着各种哺乳动物和人类CDM的组成、改良和设计[74]。
研究和开发其他一些哺乳动物PE所需的新的CDM，特别是针对一些珍稀和濒危动物保护所涉及不同人工辅助生殖技术(human assisted reproductive technology; ART),所需要的特殊CDM。但由于珍稀和濒危动物的数量极其稀少，涉及其培养PE的CDM的设计可能会与小鼠和大鼠的完全不同。设计一种新CDM的途径，除参考小鼠和大鼠已有的经验，也可能按特殊需要另辟蹊径。例如，我们在研究布氏田鼠PE的CDM时，即遇到类似困难，原有各种CDM均不适宜布氏田鼠PE的IVC。而布氏田鼠在实验室条件下已繁殖成功，仅是一种新型实验动物，其数量远多于那些珍稀和濒危动物。
目前，胚胎工程中，涉及研究各种哺乳动物PE所用的“新类型CDM”，仍然有大量的研究和工作要做，任重而道远！
致谢 中国医学科学院医学实验动物研究所张连峰教授对本课题的指导及经济支持，特此表示感谢。
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