2015,Vol. 35文章信息
- 黄伟锋,程鹏,姜平
- HUANG Wei-feng,CHENG Peng,JIANG Ping
- 三种方法制备的猪小肠黏膜下层支架的生物相容性和免疫原性的对比研究
- A Comparative Study of Three Ways of Acellular Process on Small Intestinal Submucosa's Biocompatibility and Immunogenicity
- 中国生物工程杂志,2015,35(6): 54-60
- China Biotechnology,2015,35(6): 54-60
- http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20150609
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文章历史
- 收稿日期：2015-3-11
- 修回日期：2015-3-21
脱细胞处理的小肠黏膜下层(small intestinal submucosa，SIS)是一种生物可降解材料，多来源于猪空肠，具备良好的机械特性、组织相容性和较低的免疫原性，主要由I型和III型胶原成分组成(>90%)，同时含有其他微量的细胞外基质成分如纤连蛋白、透明质酸、细胞因子(包括FGF-2、TGF-β)等，是组织工程研究常用的天然支架材料[1, 2]。自Matsumoto等[3]于1966年首次报道将其应用于替代血管修复治疗后，SIS成为组织修复重建领域的研究热点，并逐步应用于不同部位与类型的组织缺损修复，包括心血管、疝、泌尿道、骨、肌腱、皮肤等[1, 4, 5, 6, 7, 8]。研究表明异源性的SIS在体内无免疫排斥反应[4, 9]，但也有相关研究提出SIS可导致炎症反应、疼痛等副作用[10]。由于制备方法不同，SIS的生物相容性、免疫原性以及参与组织修复重建的能力均有所不同。因此，本实验研究采用三种不同的脱细胞方法制备SIS，研究其生物相容性、免疫原性以及复合成纤维细胞(fibroblast,Fb)构建真皮替代物等方面，旨在得到一种生物相容性好、免疫原性低，更适宜细胞生长的SIS制备方法，为后续的组织工程化皮肤的构建做准备。
1 材料与方法 1.1 实验动物、组织材料及主要试剂、仪器SPF级健康成年SD大鼠27只，雌雄不限，体重200～250g，由南方医科大学实验动物中心提供。包皮组织取自泌尿外科行包皮环切术的儿童。排除传染性疾病。取得患儿和家属同意。
高糖DMEM(Hyclone,USA)，中性蛋白酶，胎牛血清(Gibco，USA)，Ⅰ型胶原酶，胰蛋白酶(Sigma，USA)，波形蛋白抗体(中杉金桥，中国)，正置显微镜(OLYMPUS，日本)。
1.2 SIS的制备及实验分组机械法处理[1]：取4h市内售新鲜猪空肠清洗后，将小肠切成每段10cm，然后沿纵轴切开小肠，用裹有纱布的刀柄去除小肠的浆膜层和肌层，其间持续用PBS冲洗。将获得的未脱细胞猪小肠黏膜下层，用0.1%过氧乙酸消毒后作为机械组(A组)，真空放置在密封袋中，并于4℃保存备用。
机械-化学法处理[11]：机械处理后获得的小肠材料(1)在含有乙二胺四乙酸(100mmol/L)和氢氧化钠(10mmol/L)的溶液(pH:11～12)中浸泡16h；(2)用去离子水冲洗干净，置于含盐酸(100mmol/L)和氯化钠(1mmol/L)的溶液(pH:0～1)中浸泡6～8h；(3)用去离子水冲洗后在氯化钠(1mol/L)磷酸缓冲液(10mmol/L)(pH:7～7.4)中浸泡16h; (4)用去离子水冲洗后在PBS溶液(1mmol/L)(pH:7～7.4)中浸泡2h；(5)再用去离子水(pH:5.8～7.0)冲洗基质2h；(6)杀菌：将SIS在含0.1%过氧乙酸的20%乙醇溶液中浸泡8h，用含0.05%叠氮化钠的PBS溶液清洗2h，然后程序性降温到－80℃，冻干后用γ射线照射(25～35kGy)消毒。最终得到的SIS(B组)真空放置在密封袋中，并于4℃保存备用。
机械-酶消化法处理[12]：机械处理后获得的小肠材料(1)脱脂：加入等体积三氯甲烷-甲醇溶液，4℃过夜，去离子水冲洗；(2)胰蛋白酶消化：4℃条件下用0.25%胰蛋白酶800ml消化过夜，去离子水冲洗至冲洗液清澈；(3)去垢剂处理：4℃条件下加入0.5%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)800ml过夜，去离子水冲洗至冲洗液清澈；(4)冻干、辐照消毒：程序性降温到－80℃，冻干后用γ射线照射(25～35kGy)消毒。最终得到的SIS(C组)真空放置在密封袋中，并于4℃保存备用。
1.3 Fb的培养与鉴定将包皮组织浸泡在酒精中灭菌消毒，再用PBS冲洗数遍，修剪后于6倍体积0.25%中性蛋白酶4℃消化过夜。去掉表皮，真皮部分在PBS内涮洗后剪碎，加入0.3%Ⅰ型胶原酶，37℃消化1～2h，终止消化后1 500r/min，8min离心，收集细胞，以107/L的浓度接种于25cm2培养瓶中，37℃，5% CO2孵箱中培养，48h换液。光镜下观察第3代细胞的生长状态，并进行进一步鉴定，采用免疫化学染色S-ABC法，按试剂盒操作说明进行，一抗波形蛋白工作浓度1∶600[13]。
1.4 观测指标 1.4.1 组织学形态观察取A、B、C三组部分样本以4%中性甲醛溶液室温固定24h，脱水、透明，常规石蜡包埋，切片(片厚4μm)。取部分切片行HE染色，镜下观察脱细胞情况及组织结构形态。
1.4.2 MTT法对比三组支架对细胞增殖活性的影响将三组支架采用DMEM重新水化后铺在96孔板上。原代培养的第3～5代Fb，采用全培稀释成1×104/ml，于每孔200μl的细胞悬浮液接种于4块96孔板上，分成A组(机械法)、B组(化学法)、C组(酶法)、正常对照组(无支架)等4组，分别培养1、3、5、7d后，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，37℃孵育4h，吸弃上清液，每孔加DMSO 150μl，震荡10min后去除支架，选择490nm波长测定各孔的光吸收值(OD值)。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞增殖曲线。
1.4.3 活性真皮替代物的制备将三组支架(面积约1cm2)通过完全培养基重新水化，然后在支架上添加100μl含1×106个Fb，孵育2h后再添加1ml培养基。继续孵箱中培养24h后，将上清吸出后再将支架翻转到另一侧，继续添加细胞，然后培养3周，再通过HE染色后观察细胞在支架中的生长、粘附以及浸润程度。
1.4.4 SIS支架移植后的免疫原性对比将三组支架(面积约1cm2)分别埋植到SD大鼠的腹部皮下，分3组，每组9只，共27只大鼠，于移植后1周、2周、4周三个时间点取材。经HE染色后组织学观察支架的血管化程度以及炎症细胞的浸润情况，并通过随机取6个视野(×400)计算炎症细胞(包括巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨细胞等)的数量去评价宿主对移植物SIS炎症反应。细胞的数量主要是通过结合计算机图像分析系统(Image-Pro Plus,MediaCybernetics,Silver Spring,MD,USA)获得[14]。
1.5 统计学方法采用SPSS11.5统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验，P＜0.05为有统计学意义。
2 结 果 2.1 组织学观察HE染色观察发现，A组(图 1a)仍可见细胞及碎片残留(箭头所示)，胶原结构完整及连续性好，(B组图 1b)和(C组图 1c)未见蓝染细胞核，可见大量红色胶原纤维分布。
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| 图 1 各组组织学观察(HE×100) Fig. 1 Histology observation of each group(HE×100) (a)Blue-stain cell nucleus are visible (b)No blue-stain cell nucleus to be seen (c)No blue-stain cell nucleus are visible |
光镜下可见第3代的成纤维细胞生长良好，细胞呈长梭形，大小均匀一致。波形蛋白染色结果见胞浆呈现棕黄色颗粒状反应，胞核不着色，见图 2。
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| 图 2 成纤维细胞的形态、波形蛋白染色 Fig. 2 Morphologic appearance,vimentin staining of fibroblasts |
将Fb分别种植在A、B、C三组支架上形成真皮替代物，培养3周后HE结果显示，大部分细胞粘附在支架的表面，也有部分细胞浸润到支架的内部，见图 3。进一步取6个随机视野下(×400)计算Fb细胞数量，可见其细胞密度是：A组(机械法)>C组(酶法)>B组(化学法)；其中A组和C组分别是257个/mm2、163个/mm2，两者存在统计学差异。见图 4。
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| 图 3 活性真皮替代物的构建 Fig. 3 To construct the derm substitute(HE×200) Fibroblasts grown on three groups of SIS for 3 weeks.Most of cells seeded on surface of SIS,and part of them have‘invaded’the SIS matrix(indicated by arrows) |
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| 图 4 三组支架上粘附的细胞密度 Fig. 4 Density of fibroblast cells in three groups of SIS |
MTT实验检测结果显示，Fb在支架上培养的第1～2天就开始进入指数增殖期，随着培养时间的延长，4组数据的吸光度(OD值)都逐渐升高。根据OD值判断，A组(机械法)明显优于其他3组(P＜0.05)；从第5天开始B组(化学法)的细胞增殖活性优于正常对照组(P＜0.05)，而C组(酶法)的细胞增殖活性与正常对照组基本一致，无显著性差异，见图 5。
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| 图 5 成纤维细胞的生长曲线 Fig. 5 The growth curve of fibroblasts |
宿主对A、B、C 3组支架在不同的时间点产生不同程度的炎症反应和血管化。从移植后的第2周开始出现支架内血管化现象(图 6黑色箭头所示)，而且对比3组可发现，C组(酶法)的血管化优于其他2组(图 6)。支架浸润的炎症细胞计数结果显示，B组(化学法)免疫原性较弱，宿主对其产生的炎症反应较其他两组低。其中A组(机械法)炎症反应呈持续升高状态，而B组(化学法)和C组(酶法)炎症反应在第4周已经开始回落，见图 7。
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| 图 6 三组支架在不同时间点引起的炎症反应(HE×400) Fig. 6 The inflammation of scaffolds in different time point after transplantation |
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| 图 7 三组支架在不同时间点的炎症细胞密度 Fig. 7 The Density of inflammatory cells in different time point after transplantation |
理想的生物支架材料应该具备低免疫原性，良好的机械物理属性以及生物相容性，同时尽可能地模拟体内细胞外环境，有利于种子细胞的粘附、增殖、分化以及最终被宿主吸收或者组织重构取代[15]。天然形成的细胞外基质(ECM)三维支架，包括脱细胞真皮基质(ADM)、SIS等，除了提供结构以及物理支撑外，其本身具有超微的拓扑结构以及相关受体，提供了相应的“程序编码”(zip codes)，有助于支架上细胞的粘附以及分化[16]。同时，ECM支架降解富含多种生长因子，官能分子如纤连蛋白、多种胶原分子以及其他功能性基团，其提供的生物信号也有助于宿主细胞反馈性进行组织修复重建。研究表明SIS能够促进Fb的DNA合成以及增殖作用，而且在创伤愈合中能够促进血管化作用，与支架本身所含有的多种细胞因子，如FGF-2、TGF-β、VEGF等密切相关[17, 18]。
然而，采用不同的制备方法，最终得到的生物支架材料的物理以及生物学属性均有所差别。三维支架ECM的制备需要多个步骤进行，每个步骤均能够明显影响生物支架的结构成分以及移植后引起的宿主排斥反应。单纯的物理方法并不能达到完全去除细胞的效果，因此，最常用的脱细胞方法是联合物理法和化学法，在脱细胞的过程让支架上的细胞充分接触洗涤剂以及蛋白酶、化学试剂等，脱细胞的同时保持支架的天然成分、机械完整性，并尽量减少对生物活性产生的不利影响[19]。
目前SIS的处理主要采用物理法和化学法相结合的技术。物理法主要为机械刮除法，能够去除SIS组织大部分细胞成分。化学法主要是通过单独或联合应用化学试剂，如酶、碱、酸、有机试剂等物质，去除SIS表面残留的细胞和细胞碎片，达到脱细胞目的。Badylak等[1]通过简单的机械方法去除黏膜下层以外的成分然后进行过氧乙酸消毒后得到SIS，其胶原结构完整且连续性好，但细胞残余成分较多。Abraham等[11]应用机械-化学法制备的SIS胶原结构相对较完整、胶原纤维未见明显膨隆，在清除细胞成分的同时几乎未破坏SIS的生物学活性，保留了良好的力学强度。陈薇等[12]采用机械-酶处理法制备SIS，用Nest-PCR技术和ELISA法检测细胞残留量和生长因子含量，结果显示该制备方法能有效去除组织残留细胞，显著降低死亡相关蛋白DAP12含量，而且生长因子含量无明显改变。而本研究通过对比以上三种不同方法制备的SIS的生物相容性以及免疫原性后发现，单纯机械法制备的SIS更有利于Fb的粘附、增殖；而机械-化学法制备的SIS则免疫原性较低，移植皮下后产生炎症反应较弱；机械-酶消化法制备的SIS支架移植后的血管化程度较其它两者明显。
在ECM支架脱细胞过程中，一方面应该尽可能避免对天然成分以及超微结构的破坏，采用的清洁剂以及促溶剂(包括TritonX,SDS，脱氧胆酸盐等)应该尽量减少。另外一方面应该尽可能去除或者降低细胞膜表面的抗原表位以及细胞内的成分，这样才能减少移植后引起的同种异体或者异种排斥反应。根据实验结果我们进行合理的推测，单纯机械法制备的SIS支架其天然成分以及超微结构得到更好的保留，多种生长因子、官能分子以及其他功能性基团得以保留，因此能够更好地促进细胞的粘附、增殖。同时面临的问题是SIS支架表面的多种抗原表位以及细胞成分得不到充分的去除，移植后引起的炎症反应也较为严重。而机械-化学法制备的SIS在充分脱细胞的基础上，其促进细胞粘附、增殖的效果不如单纯机械法，但引起的炎症反应也相应较轻。另外，机械-酶消化法制备的SIS移植皮下后支架血管化明显优于其他两者，可能与该方法制备的SIS经充分脱细胞后不引起持续剧烈炎症反应的同时能够保留支架中含有的多种活性成分有关。另外，即便是同样的方法，其进行程度的不同，也有可能给支架带来不一样的生物效应，这有待进一步的研究。
关于SIS应用于组织工程化皮肤的研究也不断在进行中。2001年Badylak等[1]研究发现SIS能够促进表皮细胞的分化，并且在与Fb共培养的情况下，形成的表皮层结构以及分化的层次更明显。2005年Boughner等[20]研究认为通过添加抗坏血酸，以及纤连蛋白前处理SIS支架，更有利于复合Fb的SIS支架促进组织的新生。2011年Liu等[21]研究发现SIS有利于促进ASCs分泌VEGF，在SIS支架上复合脂肪干细胞(ASCs)形成活性皮肤替代物，其创面修复以及血管化程度明显优于单纯支架。临床研究也证实，商品化的SIS(OASIS)能够应用于慢性不愈合创伤，而且显著性提高愈合率(包括混合动静脉溃疡、腿部慢性溃疡等)[22, 23, 24]，这与SIS能够抑制其高水平的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)活性密切相关[25]。
关于SIS作为细胞载体的形式也经过了各种尝试。研究发现将SIS制成粉末状并复合ASCs形成微球体可应用于皮肤组织修复以及皮下组织填充，为细胞传送载体提供一种新的尝试[26]；也有研究发现混合支架(PLGA+SIS)的机械物理属性优于单纯的SIS海绵，而且在细胞粘附以及细胞外基质产生方面更优于单纯PLGA支架[27]。
本实验经组织学观察、MTT法、移植后宿主炎症反应以及血管化程度对比后认为，机械-化学法以及机械-酶消化法制备的SIS具有良好的生物相容性以及免疫原性，可作为构建组织工程化皮肤细胞载体的选择。
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