Ashworth在因癌症死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤的细胞，首次提出循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)的概念^[1]，即从原位肿瘤脱落进入外周血循环的癌细胞^[2]。同时，CTCs与原位肿瘤一样是高度异质化的，一些细胞甚至表现出肿瘤干细胞的特性。在外周血中CTCs数目极少，一般约10⁷数量级血细胞中的CTCs仅为个数^[3]，因此将其从血液中分离并进行检测在技术上具有挑战性。研究者们一直希望通过捕获CTCs后再培养，分析确定它们的遗传分型和药物敏感性，从而有效指导临床治疗。

微流控芯片是近几年飞速发展的一种对CTCs进行快速检测和操控的技术^[4]。它具有可控的单元集成模式和微尺度结构，可实现样品处理、捕获和检测一体化，降低试剂和样品量的消耗，实现快速、高效、高通量的分析，获得更多有关CTCs的信息^[5]。通过芯片的抗体修饰，利用抗原-抗体结合的方法，可实现对人乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231进行特异性捕获和研究。MUC1抗体是一类高分子糖蛋白，正常细胞低表达，在癌组织中存在畸形糖基化和糖基化不完全，使 MUC1的核心蛋白暴露出新的蛋白表位或新的糖抗原并分布在整个癌细胞表面，可被特异性抗体识别^[6]。MUC1与腺癌特别是乳腺癌的癌细胞恶变、转移和浸润密切相关^[7]，其表达与乳腺癌术后复发转移也具有相关性，国内外报道一致。许多研究表明FN1、ITGA6和LAMB3在乳腺癌细胞中高表达且与促肿瘤迁移相关^{[8, 9]}。

本文利用MUC1抗体修饰的芯片捕获乳腺癌细胞MDA-MB-231，通过优化抗体孵育时间、流速和细胞孵育时间等条件，获得了高细胞捕获率。捕获后的癌细胞经过分离和再培养^[10]，进一步利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析芯片捕获是否影响乳腺癌细胞的基因表达变化^[11]，对比抗肿瘤药物处理的正常和再培养乳腺癌细胞FN1、ITGA6和LAMB3基因表达量的变化。本文的研究为微流控应用于肿瘤的临床检测、诊断、个体化治疗方案的选择、确定，及肿瘤药物的药物敏感性评价提供研究基础。

细胞株：人类乳腺癌细胞MDA-MB-231本实验室保存。Anti-MUC1(Cell Signaling Technology，USA)、FITC标记荧光小鼠二抗IgG(中杉金桥生物公司)；PDMS 前聚体与固化剂(Dow Corning，USA)，APTMS和阿霉素(Sigma，USA)，EDC/NHS催化剂(百灵威科技公司)，羧基化量子点(Life Technology，USA)，DMEM/F121∶1培养基，胎牛血清(Gibco，USA)；PCR引物由上海生工完成；RNA提取试剂盒(Tiangen)，反转录试剂盒和PrimerSTAR DNA聚合酶(TaKaRa生物工程公司)等。掩膜版本实验室设计保存；显微镜载玻片；真空干燥箱；微量注射器和注射泵；荧光倒置显微镜(OlympusX71，USA)；凝胶成像系统(Tanon，上海)等。

(1)洗涤玻片：超纯水将玻片洗净，加入丙酮超声40min，弃丙酮加入无水乙醇继续超声30min；弃乙醇，超纯水洗涤3次，确保表面洁净。加入清洗液(浓H₂SO₄∶H₂O₂=1∶3)，反应3h，通过氧化还原反应使玻片表面的羟基充分暴露。继续超声30min，再用超纯水洗涤、超声25min，重复2次，高纯氩气吹干备用。

(2)PDMS胶制备：PDMS前聚体与固化剂按10∶1混合，搅拌均匀倒入掩膜板，厚度控制约6mm。真空脱除气泡，再置于65℃真空干燥箱中2h进行干燥处理。

(3)芯片粘合：PDMS芯片和玻片在超净台中进行可逆粘合，用打孔器在通道两端钻孔。分别在进样孔和出样孔插入直径1.8mm，长15cm的细管，用AB胶粘黏，干燥备用。

用注射泵通入600μl 1% APTMS，避光，室温反应30min，PBS冲洗10min。取0.25μl量子点溶在500μl PBS溶液中，加入0.5μl催化剂(EDC∶NHS=2∶5现用现配)，超声混匀，使量子点分散均匀。注入芯片中，避光，室温过夜，PBS冲洗20min。

一抗修饰：MUC1抗体用PBS(0.1％BSA)溶液按1∶100稀释，加入0.2μl催化剂，避光，注入到芯片置于4℃金属浴中孵育。用洗涤Buffer(含有1％BSA、0.05％ Tween-20的PBS)冲洗，洗去未被连接的抗体。二抗检测：用FITC标记的二抗IgG检验MUC1抗体与芯片表面的连接质量。一抗孵育、冲洗后进行荧光二抗修饰，即用3％BSA按照1∶100(二抗∶PBS)稀释后注入芯片，避光、室温孵育0.5～1h。PBS冲洗15min，荧光倒置显微镜下镜检。

人类乳腺癌细胞：MDA-MB-231。用含20%胎牛血清的DMEM/ F12 1∶1培养基于37℃、5%CO₂培养箱中进行培养，每2天换液、传代。

(1)抗体孵育时间的优化：捕获率是指捕获的细胞数与注入芯片内细胞总数的比值，与微流控芯片表面上修饰的抗体数量和密度密切相关。抗体修饰后，置芯片于4℃中孵育，孵育时间分别为：10min、0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、5.0h、12h过夜。用浓度为100 cells/ml的MDA-MB-231细胞在37℃细胞培养箱中进行捕获，PBS进行冲洗，显微镜下计数并计算捕获率，每组实验平行测定三次，统计学分析。

(2)最佳流速的选择：细胞捕获时，不同的进样速度决定了细胞与芯片表面固定抗体接触以及细胞在芯片内停留的时间，从而直接影响细胞的捕获效率。在尽可能提高芯片通量的情况下，本研究对细胞样品的进样速度进行了研究以确保得到最佳的细胞捕获率。设置的流速分别为0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0ml/h，对浓度为100 cells/ml的MDA-MB-231细胞溶液在37℃细胞培养箱中进行捕获。显微镜下进行计数，计算捕获率。每组实验平行测定三次，然后进行统计学分析。

(3)细胞捕获后孵育时间的筛选：在最适的抗体孵育时间和进样速度的条件下捕获细胞，37℃培养箱中分别孵育0min，5min，10min，30min，40min，1h，2h，3h。然后用PBS冲洗，显微镜下计数并计算捕获率。每组实验平行测定3次。

(4)模拟肿瘤细胞的捕获：以优化后的捕获条件捕获乳腺癌细胞。实验中设计4组细胞溶液浓度，1ml细胞溶液中含10个、20个、50个、100个MDA-MB-231细胞，然后分别进行捕获和计数，且每组实验平行测定3次。

对MDA-MB-231细胞进行胰酶消化，离心，加入1ml的PBS(1％BSA)进行重悬。在37℃细胞培养箱中，以最优条件进行细胞捕获。捕获后用PBS冲洗10min，倒置显微镜下观察捕获结果。采取胰酶消化与高流速冲洗相结合的方法释放细胞。把0.5％的胰酶以1.0ml/h的流速注入芯片中，37℃下孵育5min。用PBS以3.0ml/h的流速冲洗芯片，同时用无菌的EP管收集细胞。对收集的细胞用含20%血清的培养基在6孔板中培养，每2天换液一次。显微镜下观察其每天生长状态。

阿霉素(Doxorubicin)是一种广谱抗肿瘤药物，可抑制RNA和DNA的合成。对正常培养和捕获后再培养的MDA-MB-231细胞分别用1μmol/L的DOX^[12]进行处理，孵育24h；将未经药物处理进行培养的细胞分别作为对照组，共4组。对MDA-MB-231细胞中3个起主要作用癌基因进行引物设计，序列如表 1，其功能及扩增产物的长度如表 2所示。分别提取4组实验细胞的RNA并反转合成cDNA，再以cDNA为模板扩增目的基因，同时以GAPDH作为内参。

PCR反应条件:变性98℃ 30s，退火梯度(60～61℃)30s，延伸72℃30s，共30个循环，72℃再延伸5min，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。用ImageJ软件将各组电泳结果中目的条带的灰度值依次与内参相比并统计分析，实验平行3次。

通过氧化还原反应使得芯片基底表面的羟基充分暴露；避光条件下，暴露的羟基与APTMS在芯片内进行硅烷化反应；在NHS/EDC催化剂作用下，氨基和量子点表面的羧基进行酰胺反应；同理，量子点表面上的羧基与MUC1抗体上的氨基可进行酰胺反应形成共价连接，抗体即可被稳定、均一地固定在微流控芯片基底表面。最后，通过细胞表面抗原和抗体特异性结合，捕获肿瘤细胞。微流控芯片基底表面修饰和细胞捕获原理如图 1所示。利用PDMS和载玻片制作的微流控芯片实物图如图 2(a)，两端分别是进样和出样口，有4个通道。利用注射泵控制样品注入流速，整个细胞捕获装置如图 2(b)。

图 1 微流控芯片基底修饰及CTCs捕获的原理 Fig. 1 The model diagram of the principle about the modification on the microfluidic chip substrate and the capture of CTCs

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图 2微流控芯片捕获乳腺癌细胞MDA-MB-231 Fig. 2 The device of microfluidic chip which can capture breast cancer cells MDA-MB-231 (a) The physical figure of designed microfluidic chip (b) The whole equipment of CTC capture

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荧光二抗的修饰对MUC1抗体与芯片的连接具有放大作用，可检测MUC1与芯片基底的连接质量。如图 3所示，荧光倒置显微镜下，二抗的绿色荧光在微流控芯片的平滑和人字形孔道内分散较均匀，即表示MUC1抗体在芯片表面修饰稳定、均一。

图 3 微流控基底修饰荧光二抗的结果 Fig. 3 The results of fluorescent antibody coupled with the microfluidic chip substrate (a)Smooth channel microfluidic of the chip (b)Lambdoidal microfluidic channel of the chip

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抗体与微流控基底表面连接的数量和质量是捕获肿瘤细胞的关键。起初抗体随时间与基底表面充分结合，若孵育时间过长，抗体之间可能产生结合竞争或发生一定的变性使抗体与基底的结合效率降低。因此对抗体反应浓度和孵育时间的优化，节约抗体的同时达到结合效率最大化。图 4(a)显示了抗体孵育时间对捕获率的影响：小于1h时，随时间增长捕获率逐渐增加；大于1h随时间增长捕获率又逐渐降低；抗体在芯片基底孵育1h时，与基底结合的效率最高，细胞捕获率最大。后续捕获实验中抗体均孵育1h。

图 4 不同细胞捕获条件对MDA-MB-231捕获率的影响 Fig. 4 The capture efficiencies of different conditions (a) The MDA-MB-231capture efficiency in different time of MUC1 antibodies incubated on the surface of the microfluidic chip (b) The MDA-MB-231capture efficiency by different flow rates (c) The MDA-MB-231l capture efficiency in different time incubated in 37℃ after the breast cancer cells were captured

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流速严重影响细胞捕获率，合适的流速可得到高的捕获率且节约实验时间。如图 4(b)所示，流速小于1ml/h，芯片对细胞的捕获率随着流速的增加而升高，1ml/h时捕获率达到最大。流速较小时，细胞在芯片内运动较慢，可能使细胞沉积在进样口，不利于进样。大于1ml/h，捕获率又逐渐下降，流速过快使细胞与基底表面抗体接触时间过短不利其结合；或产生的剪切力^[13]使已结合的细胞再次脱落，破坏细胞形态，不利于细胞捕获。因此，在本实验中最佳注入速度是1ml/h。

细胞捕获后在芯片内停留的时间决定了细胞表面抗原与抗体接触的时间，两者充分接触才能很好地捕获细胞。细胞捕获后孵育时间小于30min，捕获率和孵育时间呈正相关，到30min时细胞的捕获率趋于最大，如图 4(c)所示。细胞在芯片内停滞时间过长会严重影响细胞的活性和形态，对捕获和分离不利。

对捕获条件进行优化后，在最适条件下：抗体孵育1h、流速1ml/h、捕获后细胞孵育30min对MDA-MB-231细胞进行捕获，捕获率能达80%±3%，如图 5。

图 5 捕获条件优化后MDA-MB-231的细胞捕获率 Fig. 5 The capture efficiency of MDA-MB-23 cells by the optimal conditions

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胰酶可消解细胞，高流速可产生一定的剪切力。如图 6所示，芯片捕获细胞后用胰酶消化与PBS高速冲洗相结合对细胞分离的结果，释放率约98%。

图 6 MDA-MB-231细胞在微流控通道内捕获和释放的结果(×10) Fig. 6 The results of MDA-MB-231 cells captured and released respectively by the designed microfluidic chip (a)and(c):MDA-MB-231 cells were captured on the optimized conditions (b)and(d):MDA-MB-231 cells were released by trypsin digestion and high flow rate

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倒置显微镜下观察再培养细胞的状态和生长情况，如图 7是对乳腺癌细胞MDA-MB-231再培养结果。证明从微流控芯片中分离的肿瘤细胞能够保持良好的贴壁形态且可正常生长、增殖。

图 7细胞捕获和释放后再培养的结果(×10) Fig. 7 The results of cell re-culture after the breast cancer cells(MDA-MB-231)captured by microfluidic chip and then released from the chip (a)The state of the released MDA-MB-231cells on the first day (b) The growth of the cells on the second day (c) The growth of the cells on the forth day

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对FN1、ITGA6和LAMB3进行RT-PCR^[14]扩增的琼脂糖凝胶电泳结果如图 8(a)～图 8(c)所示：3组结果中内参GAPDH条带亮度稳定，DOX处理组比未处理组条带均较弱；分别对电泳条带进行灰度分析^[15]，如图 8(d)～图 8(f)所示微流控捕获对细胞内基因表达无显著影响。捕获前后DOX均抑制了乳腺癌细胞中FN1、ITGA6和LAMB3的表达，验证芯片捕获细胞对检测结果无干扰。

图 8 FN1、ITGA6和LAMB3基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳及灰度分析 Fig. 8 Electrophoretic profile of PCR products of FN1，ITGA6 and LAMB3 gene and the analysis of their relative gray value (a)FN1 (b)ITGA6 (c)LAMB3 M:DNA Marker； 1:Normal cultured cells; 2:DOX-processing cells; 3:Re-cultured cells after captured by microfluidic chip 4:DOX-processing cells of re-cultured (d)FN1 (e)ITGA6 (f)LAMB3 control normal cultured cells; DOX-control: DOX-processing normal cultured cells; re-culture: cells cultured after captured; DOX-re-culture: DOX-processing cells of re-cultured

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常见的检测CTCs免疫磁性检测法(Cell Search)是基于抗体包被的磁珠来捕获EpCAM阳性的细胞，然后成像计数，但此方法并不利于获得CTCs生理、生化及遗传的相关信息^[16]。依据血细胞与肿瘤细胞大小的不同，利用物理方法也可对CTCs进行分离，但特异性较低。本文构建的微流控芯片能够成功地对模拟循环肿瘤细胞进行特异性富集和捕获，捕获率达80%左右，细胞保持原有的生理和生化活性，为进一步的研究分析提供了条件。同时，该研究中制作的微流控芯片可以重复利用，实验所需样品量少，耗时短，操作方便，如将来应用于临床只需采集病人少量血液即可进行早期诊断、用药评价或者预后复查等方面，使肿瘤患者免受化疗、放疗等带来的痛苦。但利用微流控芯片分选富集肿瘤细胞也存在不足之处，如表面的抗原表达不确定性，抗体价格昂贵等。

本研究实现了微流控芯片捕获肿瘤细胞后的分离和再培养，利用聚合酶链式反应(PCR)对细胞内mRNA的表达量水平进行相对定量，分析了捕获前后乳腺癌细胞对于抗肿瘤药物阿霉素的敏感性。实验证明该芯片对乳腺癌细胞捕获的同时，不影响肿瘤细胞自身基因表达变化。CTCs对肿瘤患者的早期诊断和晚期预后判断及治疗效果监测的意义，大都基于其数目的变化，跟踪外周血中CTCs的分子变化来确定靶向治疗药物的终点也同样具有潜在的临床应用价值。

许多研究显示，对循环肿瘤细胞(CTCs)的分析检测，可以广泛地用于精确选择治疗方案、个性化治疗、探索肿瘤细胞的遗传分型，肿瘤转移发生的机制以及对肿瘤药物疗效进行评价等。CTCs在人体血液循环系统中含量极低，有效捕获CTCs对肿瘤临床检测和诊断方面尤其是早期诊断十分关键。本实验室还将对已构建的微流控芯片进一步改进，希望设计构建更简单、方便、精确的芯片并可以应用于临床。