14-3-3蛋白是一类高度保守的酸性蛋白，已发现该蛋白在哺乳动物中有7种亚型，分别为β～τ^[1]。目前研究发现，14-3-3家族蛋白与近700余种蛋白有相互作用，通过与蛋白质某一特定序列中磷酸化的丝氨酸或者苏氨酸结合，调控蛋白质之间的相互作用，广泛参与细胞信号转导、周期进程、生长增殖和蛋白质合成^{[2, 3, 4]}。其中14-3-3γ是14-3-3家族中的重要成员之一。

p38MAPK 通路可将信号从细胞表面转导到细胞核，影响一些基因的表达，进而可调控细胞生长、增殖、分化、凋亡等病理生理过程^[5]。刘丹等^[5](2012)采用原代培养的乳鼠心肌细胞，建立抗缺氧/复氧(anoxia reoxygenation,A/R)损伤模型及APC(anaphase promoting complex,APC)、LPS (Lipopolysaccharides,LPS) 预处理保护模型。LPS 预处理对随后心肌A/R 损伤有类似APC 的保护作用，同时伴随p38MAPK (p38 mitogen activated protein kinases,p38MAPK)的磷酸化水平升高和14-3-3γ蛋白表达升高; 并且，当给予p38MAPK 通路的特异性阻断剂SB203850，14-3-3γ蛋白表达被抑制。刘丹等^[5](2012)指出LPS 预处理可能是通过激活p38 MAPK，上调14-3-3γ，从而达到对心肌细胞A/R 损伤有保护作用。

程道宾等^[6](2013)用腺病毒载体携带人14-3-3γ基因(Ad /14-3-3γ) 感染PC12 细胞，基因转移成功后，用鱼藤酮处理细胞。他们^[6] (2013)又应用流式细胞仪检测细胞凋亡率，免疫荧光双标法检测14-3-3γ蛋白与LRRK2(leucine-rich repeat protein kinase 2) 的相互作用，免疫印迹技术检测14-3-3γ蛋白LRRK2 的Ser⁹¹⁰及Ser⁹³⁵磷酸化水平。程道宾等^[6](2013)发现14-3-3γ蛋白过表达可能通过抑制LRRK2的去磷酸化，保护鱼藤酮诱导的多巴胺能细胞损伤。

沈奇等^[7](2012)构建重组质粒pCMV/N/Flag/14-3-3γ，用脂质体转染法导入子宫肌瘤细胞，应用Western blot 法检测14-3-3γ蛋白的表达，应用CCK-8检测细胞增殖变化，应用Annexin V-FITC/PI 双染色法经流式细胞术检测细胞凋亡。沈奇等^[7](2012)研究发现，14-3-3γ在子宫肌瘤细胞内高表达后可抑制细胞的增殖和促进细胞凋亡。

体外培养小鼠星形胶质细胞，建立体外缺血模型，14-3-3γ过表达和抑制发现14-3-3γ可以增强细胞活力，促进细胞生长，然而在缺血条件下促进细胞凋亡^[8]。

本实验室前期研究发现，王不留行粗提取液处理奶牛乳腺上皮细胞双向凝胶电泳(two-Dimensional Gel electrophoresis,2-DE)同质谱技术(mass spectromentry，MS)和蛋白质组生物信息学结合分析差异表达蛋白，乳蛋白是衡量乳品质的最重要的标准之一，而乳蛋白中最重要的成分是酪蛋白，其中CSN2的分泌是泌乳性能的标志性指标^{[9, 10]}。乳脂(triglyceride,TG)主要以TG的形式组成和分泌，TG占乳脂总量的97%～98%^[11]。本实验以体外培养的荷斯坦奶牛(Vaccas)乳腺上皮细胞为材料，建立奶牛体外泌乳模型，研究14-3-3γ对β-酪蛋白(β-Casein,CSN2)和乳脂合成，细胞活力以及mTOR(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路的影响，以确定14-3-3γ是否是乳蛋白、乳脂合成的重要调节因子，本实验将为阐明乳蛋白合成调控信号通路提供更多的实验依据。

泌乳期(90～120d)乳房炎隐性健康荷斯坦奶牛，由国家重点基础研究发展(973)计划课题(No.2011CB100804)资助，取乳腺基底组织进行原代培养。

正常培养的纯化的对数生长期奶牛乳腺上皮细胞(dairy cow mammary gland epithelial cells,DCMECS)。

mTOR、p-mTOR(phosphorylate mammalian target of rapamycin,p-mTOR)、CSN2、β-actin一抗购于Santa Cruz公司(美国)；14-3-3γ一抗购于Abcam公司(英国)；细胞角蛋白18 (Cytokeratin,CK18) 抗体购于Acris公司(德国)；HRP(Horseradish Peroxidase,HRP)标记山羊抗兔IgG二抗、HRP标记山羊抗鼠IgG二抗购于中杉公司(北京)；脂质体转染试剂Lipo-fectamine 2000购于Invitrogen 公司(美国)；DAPI 染料购于Sigma公司(美国)；真核表达载体pGCMV/IRES/EGFP、Prime ScriptTM RT reagent Kit、LA Taq、限制性内切酶EcoRⅠ和Bam HⅠ购于TaKaRa公司(大连)；G418 sulfate (美国Gibco公司)；TRITC(tetramethyl isothiocyanate，TRITC)标记的羊抗兔二抗、FITC标记的兔抗鼠二抗购于博奥森公司(北京)；血液甘油三酯酶法测定试剂盒购于普利莱基因技术有限公司(北京)。

泌乳期荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞培养与鉴定方法参照Lu等^[12](2013) 和Wang等^[13](2014)的方法。

正常培养的奶牛乳腺上皮细胞接种于铺有盖玻片的六孔板中，待细胞汇合至80%时，按以下方法制片观察：加入1ml甲醇(－20 ℃预冷)4 ℃固定10 min，TBST(TBS+TWEEN)洗3次，5 min/次；加400μl含5% BSA的TBST 37 ℃孵育1 h，弃封闭液后加入CK18一抗(5% BSA的TBST稀释)37 ℃孵育1 h；弃一抗，TBST洗3次，5 min/次，加TRITC标记的二抗(5% BSA的TBST稀释)，37 ℃孵育1 h，弃二抗，TBST洗3次，5 min/次；10 μg/ml的DAPI染料(TBST稀释)37 ℃孵育15 min，TBST洗3次，5 min/次；滴一滴抗荧光淬灭剂于载玻片上，盖玻片倒扣在抗荧光淬灭剂上，激光扫描共聚焦显微镜下观察CK18的特异性表达。CSN2的表达检测方法同CK18检测，一抗为CSN2一抗，二抗为TRITC标记的二抗。一个细胞中对两种蛋白同时染色：CSN2和CK18鉴定时一抗同时加入，具体操作同上；二抗混合加入TRITC标记的山羊抗兔的二抗和FITC标记的兔抗鼠的二抗，操作同上。

NCBI获得14-3-3γ(GenBank: AF043737.1)CDS区全部序列，根据序列信息设计引物如下：

上游引物F1：5′-CGG↓AATTCCGGATCATCCTCGTCCGG-3′(EcoRⅠ)；

下游引物R1：5′-CGG↓GATTCCGCAGTCCACCTGGGGGC-3′(Bam HⅠ)。

Trizol法提取奶牛乳腺上皮细胞总RNA，反转录为cDNA作为PCR反应模板，PCR反应体系为cDNA(2.5 ng/μl) 4μl，Ex Taq DNA 聚合酶9.5μl，引物(10pmol/ μl)各加 1μl，ddH₂O 34.5μl。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳回收，PCR片段回收后经EcoRⅠ、BamHⅠ酶切后连接到载体pGCMV/IRES/EGFP，由大连宝生物工程有限公司测序验证。

瞬时转染：10μl pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ质粒与10μl Lipo-fectamine 2000混匀后室温孵育5 min，分别加至250μl无血清培养基中，室温孵育25 min，直接加入到培养细胞的六孔板中。细胞在37 ℃下培养24 h，然后收集冻存于－20℃，用于进一步实验。空载体pGCMV/IRES/EGFP瞬时转染方法同上，作为转空质粒对照组。

奶牛乳腺上皮细胞以每孔2×10⁵个/ml接种于12孔板中，次日换液，以含G418终浓度分别为100、200、300、400、500、600、700、800和900 μg/ml的DF12培养液培养，每个浓度设置3个平行，每3 d更换一次含对应浓度的DF12培养液，培养至第14 d时，得到细胞全部死亡的最小G418浓度，即G418对奶牛乳腺上皮细胞的最小致死量。

奶牛乳腺上皮细胞接种于6孔板中，待细胞汇合至80%～90% 时，用DF12稀释质粒至2μg/100μl，Fu GENE HD Transfection Reagent/DNA = 5∶2(μl/μg)，室温孵育15 min，加至6孔板中，37 ℃培养24h后胰酶消化，以1∶10接种于12孔板中，以细胞全部死亡的最小G418浓度的培养液培养，每3 d换液一次，20 d后单个克隆出现，单个克隆分别进行扩大培养，培养液中G418浓度减至一半。待细胞长满后传代至6孔板中，以正常培养液培养，每2 d在相差倒置荧光显微镜下观察每瓶转染的细胞的荧光蛋白表达。

空载体pGCMV/IRES/EGFP稳定转染方法同上，作为转空质粒对照组。

正常生长的瞬时转染pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ细胞、瞬时转染pGCMV/IRES/EGFP细胞、正常培养细胞制成单细胞悬浮液，取100μl各组样品用10ml CASY-ton缓冲液稀释后，CASY细胞分析仪检测细胞活力，方法参照Li等^[14]的方法。稳定转pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ组细胞活力分析操作同上。

瞬时转染pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ细胞、瞬时转染pGCMV/IRES/EGFP细胞、正常培养细胞制成悬浮液，置于冰上用匀浆器机械破碎细胞，0.22 μm滤膜过滤后进行CSN2的HPLC检测，检测方法参照Tong等^[11]的方法。稳定转染pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ组CSN2的HPLC检测操作同上。

检测方法按甘油三酯试剂盒说明书，对等量正常生长的瞬时转pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ细胞、瞬时转染pGCMV/IRES/EGFP细胞、正常培养细胞进行检测。稳定转染pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ组甘油三酯分泌能力的检测操作同上。

提取正常生长的瞬时转染pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ细胞、瞬时转染pGCMV/IRES/EGFP细胞、正常培养细胞蛋白，按常规Western blot方法检测14-3-3γ、mTOR、p-mTOR及内参β-actin的表达^[11]。稳定转染pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ组14-3-3γ、mTOR、p-mTOR及内参β-actin的表达检测操作同上。

应用SPSS 13.0软件进行数据统计和分析，Band Scan 5.0对蛋白区带进行灰度扫描分析，所有结果均用平均值±标准误表示，所有实验重复3次。P＜0.05为统计学差异显著，P＜0.01为差异极其显著。

应用激光共聚焦显微镜观察所培养的奶牛乳腺上皮细胞，CK18和CSN2免疫荧光染色结果如图 1所示，CK18和CSN2表达呈阳性，且细胞形态大小均一，说明本实验所培养的是具有泌乳功能正常生长的奶牛乳腺上皮细胞，该细胞能用于后续实验研究。

图 1 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定 A～C：免疫荧光检测CK18；D～F：免疫荧光检测CSN2；G～M：免疫荧光检测CSN2和CK18；A、D、I：蓝色所示为DAPI染色细胞核；B：红色所示为TRITC标记CK18；E、H：红色所示为TRITC标记CSN2；G：绿色所示为FITC标记CK18；C：A、B合图；F：D、E合图；M：G、H、I合图 Fig. 1 Identification of dairy cow mammary epithelia cells

图选项

如图 2所示，用14-3-3γ特异性引物进行PCR，获得14-3-3γ基因(796 bp)(图 2A)；将PCR扩增得到的14-3-3γ基因克隆至pGCMV/IRES/EGFP载体，构建的14-3-3γ表达载体用EcoR Ⅰ和BamHⅠ双酶切后出现两条带，一条是表达载体，大小约为5 300 bp，一条是14-3-3γ基因，大小约为796 bp(图 2B)，且阳性克隆经大连宝生物工程有限公司测序，结果与NCBI中14-3-3γ mRNA序列完全一致。结果表明，本研究成功构建了14-3-3γ的真核表达载体。

图 2 琼脂糖凝胶电泳结果 (a) 总RNA提取结果 M: DL2000 Marker; 1～2: 总RNA (b) M: DL 2000 Marker；1～ 3: 14-3-3γ PCR产物 (c) M: DL 10000 Marker；1: 14-3-3γ重组质粒用EcoR I和BamH I双酶切< Fig. 2 Results of agarose gel electrophoresis

图选项

在相差倒置荧光显微镜下观察瞬时转染pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ和pGCMV/IRES/EGFP的细胞，通过倒置相差显微镜蓝光激发绿色荧光蛋白绿光，如图 3所示，绿色显示即为荧光蛋白表达的细胞，这说明质粒pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ和pGCMV/IRES/EGFP转染至奶牛乳腺上皮细胞内并且能够表达，瞬时转染细胞能够用于后续实验。

图 3 瞬时转染后荧光蛋白检测 (a)瞬时转染pGCMV/IRES/EGFP荧光蛋白检测 (b)瞬时转染pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ 24h荧光蛋白检测 Fig. 3 Detected green fluorescent protein after transient transfection

图选项

瞬时转染24 h，CASY细胞分析仪分析奶牛乳腺上皮细胞活力变化。结果显示，瞬时转染组与空白对照组和空质粒组比较，瞬时转染组细胞的活力极显著高于其它两个组(P＜0.01)(图 4)。结果表明，14-3-3γ过表达能够显著增强奶牛乳腺上皮细胞活力。

图 4 瞬时转染过表达后细胞活力变化 B:对照组；NC:空质粒组；14-3-3γO:瞬时转染组 ** ：差异极显著(P＜0.01) Fig. 4 Change of cell viability after transient transfection

图选项

pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ瞬时转染24 h，测定CSN2和TG的分泌。结果显示，瞬时转染组与对照组和空质粒组比较，CSN2和TG的分泌极显著升高(图 5)。

图 5 瞬时转染24 h CSN2分泌变化(a)及TG浓度变化(b) Fig. 5 Change of expression of CSN2 and TG after transient transfection

图选项

瞬时转染14-3-3γ 24 h后Western blot检测mTOR、p-mTOR、14-3-3γ及β-actin蛋白表达量。结果显示，与对照组和空质粒组相比，14-3-3γ过表达后，mTOR显著增加(P＜0.05)，p-mTOR蛋白表达极显著增加(P＜0.01)(图 6)。推测14-3-3γ通过磷酸化mTOR信号分子，协同mTOR信号通路调节CSN2、乳脂肪合成。

图 6 瞬时转染24h泌乳信号蛋白结果(a)及蛋白表达相对变化(b) *：差异显著(P＜0.05) Fig. 6 Western blot result of signaling protein(a) and the relative change of protein (b) after transient transfection

图选项

在相差倒置荧光显微镜下观察稳定转染pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ和pGCMV/IRES/EGFP的细胞荧光蛋白表达率，如图 7所示，绿色显示即为荧光蛋白表达的细胞，这说明质粒pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ和pGCMV/IRES/EGFP转染至奶牛乳腺上皮细胞内并且能够表达，稳定转染细胞能够用于后续实验。

图 7 稳定转染后荧光蛋白检测 (a)稳定转染pGCMV/IRES/EGFP荧光蛋白检测 (b)稳定转染pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ荧光蛋白检测。 Fig. 7 Detected green fluorescent protein after transient transfection

图选项

稳定转染pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ的奶牛乳腺上皮细胞，CASY细胞分析仪分析细胞活力变化。结果表明，与对照组和空质粒组相比，稳定转染组的奶牛乳腺上皮细胞活力极显著提高(P＜0.01)(图 8)。

图 8 稳定转染后细胞活力变化 Fig. 8 Change of cell viability after stable transfection

图选项

检测稳定转染pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ的奶牛乳腺上皮细胞中CSN2和TG的分泌情况。结果表明，稳定转染组细胞中CSN2和TG的分泌量均极显著高于对照组和空质粒组(P＜0.01)(图 9)。

图 9 稳定转染CSN2(a)和甘油三酯(b)表达变化 Fig. 9 The change of expression of CSN2 and TG after stable transfection

图选项

Western blot检测稳定转染pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ的奶牛乳腺上皮细胞中mTOR、p-mTOR和14-3-3γ蛋白表达量变化。结果显示，与对照组和空质粒组相比，稳定转染组细胞中mTOR、p-mTOR表达量均极显著增加(P＜0.01)(图 10)。

图 10 稳定转染泌乳信号蛋白Western blotting 结果(a)及蛋白表达相对变化(b) 1:空白对照组; 2:转空质粒组; 3:稳定转染14-3-3γ组 Fig. 10 Western blot result of signaling protein(a) and the relative change of protein (b) after stable transfection

图选项

哺乳动物雷帕霉素靶分子(mammalian target of rapamycin,mTOR)是存在于胞浆中的一种丝/苏氨酸蛋白激酶，能应答营养素、能量、压力、荷尔蒙和促有丝分裂剂等多种细胞外信号，参与基因转录、蛋白质翻译、核糖体合成等生物过程，在细胞增殖、代谢、分化等方面发挥中心调控点的作用^{[15, 16]}。随着对乳蛋白合成与调控机制的深入研究，泌乳信号转导及其分子机制备受关注。mTOR信号通路不仅是参与乳蛋白合成的重要信号通路，还在调节乳脂的合成、乳腺上皮细胞的增殖中发挥重要作用^[13]。

Burgs等^[9](2010)研究发现，添加激素和氨基酸或者激素、葡萄糖、乙酸钠可以增加乳腺上皮腺泡蛋白激酶B的磷酸化，而氨基酸和激素促进乳蛋白合成的同时伴随着S6K1(S6kinse1,S6K1)和4E-BP1(4E binding protein,4EBP1)磷酸化状态的增强，S6K1和4E-BP1是mTOR下游信号通路的直接作用底物，因此营养素和激素通过mTOR信号通路调节乳蛋白的合成。本研究中14-3-3γ过表达时细胞中mTOR与CSN2的表达量极显著增加(P＜0.01)，且p-mTOR表达也显著增加(P＜0.01)，说明，14-3-3γ可以通过正向调节mTOR的表达，并且促进mTOR的磷酸化来正向调节奶牛乳腺上皮细胞中CSN2的表达。

哺乳动物雷帕霉素靶分子1(mammalian target of rapamycin complex-1,mTORC1)通过调控固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatory element binding protein,SREBP)激活调节细胞生长和增殖的P13K/AKT/mTOR信号通路。SREBP是位于内质网的细胞内胆固醇敏感器，是脂肪合成基因重要的转录调节因子，在胆固醇调控中起重要作用，同时SREBP对细胞的生长、增殖和衰老起着重要调控作用^[17]。瞬时转染和稳定转染14-3-3γ后，TG分泌量极显著增加(P＜0.01)，并且细胞活力极显著增强(P＜0.01)，这表明14-3-3γ正向调控乳脂合成，增强细胞活力，影响奶牛乳腺上皮细胞的泌乳调节。

MAPK(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信号途径是细胞增殖、生长与凋亡的多种调控中重要途径之一^[18]。MAPK通过其家族中的不同成员，如Raf-1(Mus musculus v-raf-leukemia viral oncogene 1,Raf-1)、ERK(extracellular regulated protein kinases,ERK)和BMK1(big mitogen-activated protein kinases 1,BMK1) 等，控制细胞增殖、分化与生长等^[19]。本研究结果显示，瞬时和稳定转染14-3-3γ的细胞活力与空白对照和空质粒组相比极显著增加(P＜0.01)，说明14-3-3γ对细胞的生长具有明显的正向调节作用，究其原因还可能有如下几个方面：其一，14-3-3γ能介导Raf-1与PKC/ERK结合，协调有丝分裂原激活的MAPK信号通路，参与调控细胞的生长、增殖和分化；其二，14-3-3γ通过BMK1来调控细胞生长和存活。BMK1是MAPK家族的另一成员，其可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡^[20]；其三，14-3-3γ通过与P27结合影响细胞增殖^[21]。P27是一种细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂，可进入细胞核抑制细胞周期依赖性蛋白激酶的活性和阻断细胞周期。14-3-3γ可在胞浆中分离P27从而抑制其在核内的功能最终激活细胞周期蛋白CDK(cyclin-dependent kinase,CDK)复合物的活性和加促细胞周期^[18]。

本研究发现奶牛乳腺上皮细胞14-3-3γ过表达的情况下，细胞活力显著增强，乳蛋白、乳脂合成量显著增加，并且14-3-3γ影响奶牛乳腺上皮生理功能是协调mTOR信号通路。本研究首次在奶牛乳腺上皮细胞上研究14-3-3γ参与乳蛋白和乳脂的合成，并且指出14-3-3γ参与mTOR信号通路，丰富了泌乳调节信号网络，为提高乳品质研究提供了新的理论依据。