肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pn)是引起细菌性肺炎、中耳炎、脑膜炎等疾病的一种常见致病菌。其在婴幼儿及老年人中具有较高的发病率与死亡率，全世界每年约有160万人死于与S.pn感染相关的疾病^[1]。毒力因子在肺炎链球菌致病过程中扮演着较为重要的作用，其重要的毒力因子包括荚膜多糖和许多毒力蛋白，如肺炎链球菌表面蛋白PspA、PspC，PavA等在肺炎链球菌粘附、侵袭等致病环节中发挥着重要作用^[2]。针对不同感染进程的需要，肺炎链球菌会调控许多毒力基因的表达，以利于其建立感染及适应宿主局部微环境。其中，转录因子在毒力基因表达调控过程中起着非常重要的作用^[3]。因此，研究肺炎链球菌毒力基因的转录调控机制，对于预防与控制肺炎链球菌感染有重要意义。SP0306蛋白是肺炎链球菌中的一种功能未知的转录因子，为研究其生物学功能，本研究拟对SP0306蛋白进行原核表达、纯化及晶体生长，并对挑选其蛋白晶体进行X射线衍射，为最终解析出蛋白三维结构及下一步的功能研究奠定了基础。

肺炎链球菌TIGR4菌株、大肠杆菌DH5α菌株、BL21(DE3)菌株、PET28a质粒均为本室保存。

细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；Primer star 高保真DNA聚合酶，限制性内切酶BamH I、Xho I，T₄ DNA连接酶购自大连宝生物工程有限公司；His Bind Column (Ni-NTA) 树脂、DEAE阴离子交换柱购自美国GE公司；蛋白晶体筛选试剂盒Crystal Screen Kit I & II及PEG screen I & II购自美国Hampton Research公司。

本研究采用NCBI保守结构域在线分析软件(Conserved Domain Search Service)，分析SP0306蛋白结构域以预测其可能的生物学功能。

以肺炎链球菌TIGR4菌株基因组DNA为模板，以上游引物：5′-CGCGGATCCGTGTTAAACATTAAAGAG-3′(下划线为BamH I酶切位点)，下游引物：5′-CCGCTCGAGTTATTTTATCTTCTCAAAT-3′(下划线为Xho I酶切位点)扩增sp0306基因。扩增产物和PET28a质粒经BamH I，Xho I双酶切后再连接构建PET28a-sp0306重组表达质粒，转化入大肠杆菌DH5α菌株，在含卡那霉素(50 mg/L)的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒行双酶切鉴定后，送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序鉴定。

将鉴定正确的PET28a-sp0306表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌中，接种于LB培养液(含50 mg/L卡那霉素)中，37℃培养至光密度A₆₀₀=0.5～0.6时，加入0.2 mmol/L的IPTG，20℃诱导9h，12 000×g离心10min收集菌体，超声破菌后SDS-PAGE鉴定蛋白表达形式。破菌液经12 000×g离心10min收集上清液，用His Bind Column(Ni-NTA)对蛋白进行亲和层析纯化，并进一步利用DEAE阴离子交换柱对蛋白进行纯化，再行SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度，纯化的蛋白经脱盐、超滤浓缩后分装，－80℃保存备用。

以5mmol/L Tris-HCl缓冲液(含50mmol/L NaCl，pH 8.0)稀释蛋白浓度为20mg/ml，用Crystal screen Ⅰ和Ⅱ、PEGⅠ和Ⅱ试剂盒以悬滴气相扩散法行晶体初筛，池液200μl，将1μl母液与1μl SP0306蛋白混合后加样于硅化处理的玻片上，用凡士林封板，在20℃恒温条件下进行晶体生长。蛋白结晶形成后，挑选晶体送至上海同步辐射光源中心，进行X射线衍射并收集衍射数据。

保守结构域分析显示该蛋白拥有2个磷酸转移酶系统(phosphotransferase system，PTS)结构域和2个PTS调控结构域(PTS regulation domain，PRD)。

挑选阳性克隆经菌液PCR鉴定正确后,提取重组质粒经双酶切鉴定，能够获得1 970bp大小的酶切产物(图 1)，经测序鉴定插入序列与GenBank中肺炎链球菌TIGR4菌株的sp0306基因序列完全相同 (图 2)。

图 1 PET28a-sp0306重组表达质粒双酶切鉴定 Fig. 1 Identification of the recombinant plasmid PET28a-sp0306 M:Marker; 1: Recombinant plasmid PET28a-sp0306 digested by BamHⅠand XhoⅠ

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图 2 PET28a-sp0306原核表达质粒测序图 Fig. 2 DNA Sequencing for the expression plasmid of PET28a-sp0306

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含PET28a-sp0306重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)表达菌，经IPTG诱导后破菌分析，可见主要以可溶形式表达SP0306重组蛋白，分子量约为76kDa，与预期结果相符，经Ni-NTA亲和纯化后，获得了纯度较高的目的蛋白(图 3)。

图 3 重组蛋白SP0306的SDS-PAGE电泳图 Fig. 3 SDS-PAGE analysis of SP0306 recombined protein M:Maker；1:Whole cell lysates of E.coli BL21-PET28a-sp0306 induced by IPTG；2:Supernatant of E.coli BL21-PET28a-sp0306 after ultrasonication;3:Sediment of E.coli BL21-PET28a-sp0306 after ultrasonication;4:Flow through from Ni-NTA column；5:Elution fraction using imidazole 20mmol/L;6:Elution fraction using imidazole 50mmol/L;7:Elution fraction using imidazole 300mmol/L

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以DEAE离子交换层析进一步对SP0306蛋白进行纯化，从层析图谱上可见一个低洗脱峰(图 4a)，收集该洗脱峰处的蛋白行SDS-PAGE分析，SP0306蛋白纯度达到了预期要求(图 4b)，可用于后续晶体生长。

图 4 阴离子交换层析图及SP0306蛋白SDS-PAGE电泳图 Fig. 4 DEAE chromatography purification for SP0306 protein (a) DEAE Chromatography picture of SP0306 recombined protein (b)SDS-PAGE analysis of SP0306 recombined protein after DEAE Chromatography M:Marker；1~8:Purified SP0306 protein eluted with NaCl of different concentration

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SP0306蛋白在20℃条件下生长后，在多种条件中出现了大小不一的方形晶体,其中在0.1mol/L MES pH6.5，20%PEG3350条件下获得了质量较好的长棒状晶体，挑取晶体行SDS-PAGE电泳，结果显示其分子量大小与SP0306蛋白相符，提示生长的晶体为SP0306蛋白结晶而成(图 5)。筛选合格SP0306蛋白晶体行X射线衍射实验，晶体衍射能力达到了3.5Å(图 6)。

图 5 SP0306蛋白晶体及SDS-PAGE分析 Fig. 5 Crystal picture and SDS-PAGE anlysis of SP0306 crystal (a)Crystal picture of SP0306 protein (b)SDS-PAGE anlysis of SP0306 crystal M:Protein molecular weight marker;1:Crystals of SP0306

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图 6 SP0306 蛋白晶体X射线衍射图 Fig. 6 The X-ray diffractogram of SP0306 protein crystal

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在许多细菌生长和致病过程中，自身会激活许多转录因子，以调控下游基因的表达，从而利于细菌适应宿主局部微环境及致病过程。如霍乱弧菌可通过转录因子ToxR和ToxT调控部分毒力基因的高表达以对宿主建立感染^[4]。在肺炎链球菌中，转录因子SP0927 敲除后能够显著减弱肺炎链球菌毒力，主要是由于sp0927基因敲除后会下调许多毒力因子的表达^[3]。此外，肺炎链球菌在感染过程中会根据感染部位局部微环境的需要，通过转录因子的调控使细菌呈现透明型和不透明型细菌形态的转换，其中透明型菌株表达更多的磷壁酸、胆碱结合蛋白A、lytA，而荚膜多糖、pspA表达量减少，从而让细菌更容易在鼻咽部位定植；但当细菌侵袭进入宿主体内后，细菌形态则会转变为荚膜多糖表达量多的不透明型菌株，其具有更强的抗吞噬能力，因而在系统感染中表现出更强的毒力^{[5, 6]}。由此可见，转录因子在肺炎链球菌感染致病过程中发挥着重要作用。但目前许多转录因子在肺炎链球菌生长、致病过程中的具体调控机制尚不明了，其中主要的原因可能是转录因子表达时间短，表达水平较低，给研究带来了一定的困难。

本文所研究的肺炎链球菌sp0306基因是一种假想的转录因子，其编码产物SPD0306蛋白由657个氨基酸组成，生物信息学分析显示该蛋白拥有2个保守的PTS结构域和2个PRD结构域。该家族蛋白主要调控细菌碳水化合物代谢相关基因的表达，如大肠杆菌BglG蛋白和精细芽孢杆菌LicT蛋白，它们调控糖转运和代谢相关基因的表达，在细菌生长、致病过程中发挥着重要作用^{[7, 8]}。虽然BglG蛋白与LicT蛋白间序列和功能相似，但转录调控的方式确有明显差别。BglG必须通过PRD2结构域去磷酸化才能形成有活性的二聚体，而LicT发挥功能则需要PRD1结构域去磷酸化而PRD2结构域磷酸化^[9]。目前，关于SP0306蛋白的具体转录调控机制尚不清楚。由于蛋白质的三维结构分析有助于预测蛋白的功能，因此，本研究拟对SP0306蛋白进行原核表达、纯化及晶体生长，以便解析出其三维结构。通过原核表达系统，获得了表达量较大的SP0306蛋白。但在纯化过程中发现该蛋白极不稳定，很容易沉淀。通过系列条件摸索，发现将缓冲液的pH提高至8.0后，SP0306蛋白的稳定性会得到显著提高。通过Ni柱亲和纯化以及DEAE纯化后，得到了纯度较高的目的蛋白用于晶体培养，并成功培养出来质量较好的蛋白晶体。X射线衍射数据显示SP0306蛋白晶体衍射能力达到3.5Å，但由于该序列结构同源性极低，无法通过分子置换获得相位来建立结构模型，因此，我们拟下一步进行SP0306蛋白硒代晶体的培养，以最终解析出其蛋白三维结构。