文章信息
- 李瑶瑶,毕静,王艺红,秦云贺,张雪莲
- LI Yao-yao,BI Jing,WANG Yi-hong,QIN Yun-he,ZHANG Xue-lian
- 乙酰化修饰调控结核杆菌异柠檬酸裂合酶的研究
- Lysine-322 Acetylation Negatively Regulates Isocitrate Lyase of Mycobacterium tuberculosis
- 中国生物工程杂志,2015,35(6): 8-13
- China Biotechnology,2015,35(6): 8-13
- http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20150602
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文章历史
- 收稿日期:2015-03-13
- 修回日期:2015-04-03
乙酰化修饰是细胞内蛋白翻译后修饰的一种重要形式,广泛参与细胞生长代谢等重要生理活动[1]。研究表明赖氨酸(Lys,K)乙酰化修饰不仅存在于真核生物,而且在大肠杆菌[2],沙门氏菌[3]等原核生物中也广泛存在,是真核与原核生物共同保守的一种代谢调控机制。近期发现蛋白乙酰化修饰在人类致病菌结核杆菌中也广泛存在,并且可能影响生物膜形成及碳源代谢等重要生理功能[4, 5]。
结核杆菌的代谢是其致病性的关键决定因素,特别是当结核杆菌被巨噬细胞吞噬后,可以调节自身代谢来抵抗细胞内低氧、低pH等不利的微环境。此时结核杆菌利用脂肪酸作为碳源,启动乙醛酸循环途径。异柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase,ICL)是乙醛酸循环途径的关键代谢酶[6],且该蛋白在结核杆菌处于低氧状态和小鼠潜伏感染情况下大量上调表达[7, 8, 9],与结核杆菌致病性和潜伏感染密切相关。
本实验室前期在结核杆菌赖氨酸乙酰化修饰谱的研究中发现ICL蛋白322位点的赖氨酸存在乙酰化修饰,近期报道也证实了该结果[5]。生理条件下,蛋白质的赖氨酸残基侧链可以发生质子化,使得赖氨酸带上正电荷,而乙酰化修饰可以阻止赖氨酸残基发生质子化,进而去除赖氨酸残基侧链上的正电荷,改变其生化特性或构象,因此受乙酰化修饰的赖氨酸残基表现为中性氨基酸的特性[10]。为探索赖氨酸乙酰化修饰对蛋白功能的调控作用,通常采用将赖氨酸位点分别突变成带正电荷的精氨酸(Arg,R)来模拟该位点未被乙酰化修饰状态,以及不带电荷的谷氨酰胺(Glu,Q)来模拟位点受乙酰化修饰状态。当赖氨酸位点被突变成谷氨酰胺的蛋白功能发生更显著的活性变化时,则说明该位点的乙酰化修饰对蛋白功能有重要的调控作用[11, 12, 13]。因此本研究中将ICL Lys322分别突变成Arg和Glu,并比较突变蛋白对ICL酶活性的影响,进而判断结核杆菌ICL酶活性是否受Lys322的乙酰化修饰调控。研究结果进一步探索赖氨酸乙酰化修饰对结核杆菌的生长代谢调控作用提供基础,有助于从全新的角度研究结核杆菌的致病性。
1 材料与方法 1.1 材 料 1.1.1 菌株和质粒pET28a载体和BL21(DE3)菌株由本实验保存; pET28a-icl、pET28a-icl322R和pET28a-icl322Q为本次研究构建的表达质粒载体,抗性为Kan,重组蛋白带有His6 -tag。pET28a-icl为含有编码结核杆菌异柠檬酸裂合酶基因(icl)的原核表达质粒,可体外表达野生型ICL蛋白(ICLWT),pET28a-icl322R和pET28a-icl322Q表示体外表达ICL蛋白在322位点赖氨酸分别被定点突变为精氨酸(Arg,R)和谷氨酰胺(Glu,Q)。
1.1.2 酶和试剂赖氨酸乙酰化单克隆抗体;去乙酰化酶抑制剂NAM、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)、DL-threo-isocitrat(Sigma);premier star DNA聚合酶 (TaKaRa生物工程公司);Q5超高保真DNA聚合酶、DpnⅠ限制性核酸内切酶、T4连接酶、BamHI和HindⅢ限制性内切酶 (NEB生物公司);卡那霉素(Kan)、异丙基硫代半乳糖苷IPTG(上海生工生物工程公司);质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒(AXYGEN公司);蛋白浓度测定BCA试剂盒(上海睿安科技生物有限公司);其它化学试剂均为国产AR级产品。
1.2 方 法 1.2.1 质粒pET28a-icl的构建根据结核杆菌H37Rv菌株基因组icl编码基因序列(NC_000962),设计并合成两条引物ICL-S:5′-AAAGGATCCATGTCTGTCGTCGG CACCCCGAAG-3′(划线处为BamHI酶切位点)和ICL-A:5′-GAAAAGCTTCTAGTGGAACTGGCCCTCTTCGGTG G-3′(划线处为HindⅢ 酶切位点)(上海生工生物工程有限公司合成)。以H37Rv基因组为模板扩增icl基因,PCR反应条件如下:98℃预变性30s;98℃变性30s,60±5℃退火20s,72℃延伸 1min,30个循环;72℃延伸10min。PCR产物用1%琼脂糖电泳鉴定,PCR产物纯化按照纯化试剂盒说明书完成。pET28a质粒载体和icl纯化产物用BamHI和HindⅢ双酶切,用1%琼脂糖凝胶电泳分离并切胶回收。将回收的载体pET28a和目的基因icl片段进行连接,转化到E.coli BL21感受态细胞,在含Kan的LB平板上筛选阳性克隆,通过BamHI和HindⅢ双酶切验证并测序正确后,保留菌种备用。
1.2.2 定点突变质粒pET28a-icl322R、pET28a-icl322Q的构建根据ICL编码基因序列,针对322位点设计并合成两对定点突变引物,分别将ICL第322位密码子由AAG(Lys,K)突变为CGA(Arg,R)或CAG(Gln,Q)。突变引物序列如下:K322R-S:5′-GTTCAACTGGAAACGACACCTCGACGACGCCAC-3′和K322R-A:5′-CGTCGA GGTGTCGTTTCCAGTTGAACGATGGC-3′; K322Q-S:5′-GTTCAACTGGAAACAGCACCTCGACGACGCCACC-3′和K322Q-A:5′-CGTCGTCGAGGTGCTGTTTCCAGTTGAAC GATGGC-3′。
以 pET28a-icl为模板,分别利用K322R-S/K322R-A引物以及K322Q-S/K322Q-A引物对ICL蛋白322赖氨酸密码子进行定点突变。具体PCR反应条件为:98℃预变性30s;98℃变性30s,60±5℃退火 5min,72℃延伸 7min,18个循环;72℃延伸10min。PCR产物用3mol/L 醋酸钠(pH5.2)沉淀纯化后,经DpnⅠ37℃消化1h后转化到BL21中,Kan平板筛选挑取阳性克隆,抽提质粒,DNA测序正确的突变质粒载体分别命名为pET28a-icl322R和pET28a-icl322Q。
1.2.3 ICLWT、ICL322R和ICL322Q蛋白的表达与纯化将分别含有重组质粒pET28a-icl、pET28a-icl322R和pET28a-icl322Q 的BL21菌接种于含有50μg/mL Kan的5ml LB培养基中,37℃,180r/min培养12h。按1%比例将培养过夜的细菌转接到500ml LB培养基中(50μg/ml Kan),37℃,180r/min培养至OD600为0.6左右,加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG,于25℃180r/min诱导培养8h后,13 000r/min,离心15min,弃上清,收集菌体。
上述收集的三种菌体蛋白分别重悬于上样缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,500 mmol/L NaCl,5 mmol/L咪唑)中,冰水浴中超声后,高速离心收集上清。上清分别与预先处理好的镍亲和柱结合,然后用分别含有10mmol/L、30mmol/L、50mmol/L咪唑的缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,500mmol/L NaCl)依次洗脱杂蛋白,最终用含高浓度咪唑的洗脱缓冲液(50mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,500mmol/L NaCl,250mmol/L咪唑)洗脱并收集目的蛋白。洗脱下来的目的蛋白经透析超滤,蛋白定量后分装保存于-80℃冰箱。为防止目的蛋白在纯化过程中去乙酰化,缓冲液中均添加终浓度为10mmol/L的去乙酰化酶抑制剂NAM。
1.2.4 ICLWT、ICL322R和ICL322Q赖氨酸乙酰化水平检测等量ICL及突变体ICL322R和ICL322Q蛋白样品与上样缓冲液沸水中煮沸10min,经SDS-PAGE分离,并电转至PVDF膜。在5%的脱脂牛奶中封闭2h,加入赖氨酸乙酰化单克隆抗体(1∶3 000),37℃,孵育1h;用含0.05% tween 20 的磷酸盐缓冲液(PBST)清洗5遍,加入HRP标记的羊抗鼠抗体(1∶10 000),37℃,孵育1h,用PBST洗5遍,最后ECL显色并拍照。
1.2.5 ICLWT、ICL322R和ICL322Q异柠檬酸裂解酶活性的测定异柠檬酸裂解酶酶活性的测定按照参考文献[14]进行。反应体系包括50mmol/L MOPS-HCl(pH6.8)、5mmol/L MgCl2、0.1mmol/L NADH、7 U lactate dehydrogenase、20μmol/L蛋白混匀,25℃孵育5min之后加入1mmol/L DL-threo-isocitrate启动反应,用酶标仪检测340nm处吸收值的变化,所有样品酶活性测定均进行3次以上重复。
2 结 果 2.1 pET28a-icl、pET28a-icl322R和pET28a-icl322Q载体的构建从结核杆菌H37Rv基因组中扩增获得ICL编码基因Rv0467,基因大小为1287bp,PCR产物与预期结果一致。将PCR产物回收并克隆入原核表达质粒载体pET28a中,酶切鉴定和序列测定分析表明含结核杆菌ICL编码基因的原核表达载体pET28a-icl构建成功(图 1)。
以构建成功的pET28a-icl质粒DNA为模板,利用合成的K322R-S/K322R-A以及K322Q-S/K322Q-A两对定点突变引物分别进行PCR扩增,PCR产物用1%琼脂糖电泳鉴定,均可见单一条带的产物,大小约为6 700bp左右,与预期结果一致(图 2)。分别回收PCR产物并利用DpnⅠ消化后转化宿主菌,挑取Kan平板阳性克隆,提取DNA经序列测定,筛选正确地将原核质粒载体中编码ICL Lys322密码子AAG分别突变成编码精氨酸密码子CGA或谷氨酰胺密码子CAG的阳性质粒。
2.2 ICLWT、ICL322R及ICL322Q蛋白的表达、纯化和赖氨酸乙酰化水平检测经过IPTG诱导,转入大肠杆菌BL21表达质粒载体pET28a-icl,pET28a-icl322R和pET28a-icl322Q均可有效地表达,且在25℃诱导培养8h,蛋白均为可溶性表达。通过Ni亲和层析柱,不同浓度咪唑梯度洗脱纯化下,成功获得ICLWT,ICL322R及ICL322Q重组蛋白,电泳结果显示蛋白条带大小约为47kDa,与理论预期的重组蛋白大小相符(图 3a)。
为检测外源蛋白能否在常规大肠杆菌表达体系中进行赖氨酸的乙酰化修饰,使用赖氨酸乙酰化抗体对获得的ICLWT,ICL322R及ICL322Q三种重组蛋白进行了乙酰化修饰水平的检测,Western blot检测结果显示不管是野生型蛋白(ICLWT),还是将322赖氨酸位点突变成精氨酸(ICL322R)或谷氨酰胺(ICL322Q)的ICL突变体蛋白,都可以检测到较高水平的赖氨酸乙酰化修饰(图 3b),说明在常规大肠杆菌表达体系中,外源蛋白是可以进行赖氨酸乙酰化修饰的。由于322位点的两种突变蛋白ICL322R及ICL322Q依然可以检测到赖氨酸乙酰化修饰信号,则提示结核杆菌ICL蛋白中,除322位点外还存在其他的赖氨酸乙酰化修饰位点。
2.3 ICL 酶活性的测定为确定Lys322位点对ICL蛋白的活性影响,测定了ICLWT,ICL322R及ICL322Q三种重组蛋白的异柠檬酸裂合酶活性,结果发现:与ICLWT相比,ICL322R突变体蛋白酶活性下降了近50%,而ICL322Q突变体蛋白的酶活性则下降了70%左右(图 4),说明不管该位点被突变成带有正电荷的精氨酸(模拟Lys322未被乙酰化修饰状态),还是被突变成不带电荷的谷氨酰胺(模拟Lys322受乙酰化修饰状态),均会下调ICL蛋白的活性,说明该位点可能是影响ICL酶活性的重要位点。对比ICLWT,模拟Lys322受乙酰化修饰状态突变体蛋白ICL322Q的异柠檬酸裂合酶的活性显著下降,则说明Lys322乙酰化修饰负向调控ICL的酶活性。
3 讨 论长期以来,对于蛋白质的乙酰化修饰这种翻译后修饰现象的研究主要集中在组蛋白和一些与转录相关的蛋白质上。然而一些报道表明蛋白质的乙酰化修饰不止在转录方面,特别是自2006年以来,多个团队都鉴定到真核生物有大量乙酰化修饰的蛋白质,且这些乙酰化修饰蛋白参与细胞生理调控的各个方面,包括中心代谢、蛋白质合成和降解、细胞形态以及细胞周期等。这种可逆的赖氨酸ε-氨基基团的乙酰化修饰不仅存在于真核生物,随着研究的深入,发现原核生物中也同样存在大量的乙酰化修饰现象,在蛋白质功能和生理过程起着至关重要的作用。
结核杆菌不同于很多其他原核生物,可以在巨噬细胞内生存。面对无游离氧的缺氧环境,结核杆菌通过调整并降低自身代谢水平,关闭其氧呼吸代谢,启动乙醛酸旁路获取能量。研究表明乙醛酸旁路关键酶-异柠檬酸裂解酶(ICL)是结核杆菌在低氧条件下,第一个上调表达的酶[9],酶活性随结核杆菌H37Rv株培养时间的增长而不断上升[6],在添加了乙酸或棕榈酸后,结核杆菌ICL的表达和活性均升高[7],且ICL的水平还与其对氧的利用率有直接关系。因此,ICL是结核杆菌在宿主中由急性向持续感染过渡的关键因素。结核杆菌乙酰化修饰谱的研究显示结核杆菌的ICL Lys322为乙酰化修饰位点,因此初步探索乙酰化修饰对ICL蛋白功能的调控作用对研究结核杆菌代谢及潜伏感染具有重要意义。
然而在原核表达体系中进行翻译后的修饰研究,存在一个重要问题,由于大肠杆菌中不存在内质网和高尔基体,因此外源蛋白很难有效进行糖基化、二硫键形成等翻译后的加工。那么赖氨酸的乙酰化修饰是否在大肠杆菌表达体系中得到有效完成,直接关系到未来乙酰化修饰对蛋白功能调控研究工作的开展。本研究发现不管是野生型ICL,还是对已知乙酰化位点进行突变的蛋白均可检测到比较强的赖氨酸乙酰化修饰信号,表明在大肠杆菌表达体系中外源蛋白可以进行赖氨酸的乙酰化修饰。但值得注意的是,由于两种突变体蛋白也检测到较高水平的蛋白赖氨酸乙酰化信号,可以推测ICL蛋白还存在其他赖氨酸乙酰化修饰位点。
研究中通过将ICL Lys322突变成精氨酸,类似于未发生乙酰化修饰的带正电荷的赖氨酸残基,同时将Lys322突变成谷氨酰胺,类似于发生乙酰化修饰后不带电荷的赖氨酸。结果显示不管是突变成带正电荷还是不带电荷的氨基酸残基,都会明显降低ICL酶活性,说明不管该位点是正电荷还是不带电荷的氨基酸残基都会影响到酶活性,提示Lys322可能属于影响ICL活性的重要位点。对于本研究中带正电荷的ICL322R活性的下降,也不能排除在其他赖氨酸位点乙酰化修饰的协同作用下,加剧了ICL322R蛋白酶活性的降低。当然,由于生理状态下蛋白赖氨酸位点被乙酰化修饰后,处于不带电荷状态。因此很多研究均表明当重要的乙酰化位点被突变成谷氨酰胺,该位点完全呈现出类似生理情况下赖氨酸受乙酰化修饰时不带电荷的状态下,蛋白活性都会呈现出正向或负向的显著变化[11, 12]。在本研究中,模拟赖氨酸乙酰化修饰的突变体蛋白ICL322Q酶活性比野生型ICL呈现显著的下降,说明Lys322位点的乙酰化修饰可以负向调控ICL酶活性。
综合本研究结果,尽管在原核表达体系中外源蛋白可以进行赖氨酸乙酰化修饰,但如果蛋白存在多个乙酰化修饰赖氨酸位点,则很难判断是哪一个赖氨酸位点发生了乙酰化修饰?每个位点受乙酰化修饰的程度如何?完成乙酰化修饰蛋白量与表达蛋白总量的比例如何也无法定量确定。因此,若想更深入地探索赖氨酸乙酰化修饰对结核杆菌ICL功能的调控作用,不仅需进一步获得其他可能存在乙酰化修饰的赖氨酸位点对蛋白功能的影响,还需要寻找解决针对单一赖氨酸残基乙酰化修饰的检测方法,比如获得体外定点乙酰化修饰的蛋白或获得能检测单一位点赖氨酸残基乙酰化修饰的抗体。
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