生物体的生命活动是通过基因的精细表达实现的，在细胞和个体的整体环境下，各阶段基因特异而精细的表达调控，使得生命体的基本单元细胞有序完成了增殖、分化、生长、凋亡及对各种理化因子的应答，并表现为个体的生长、发育、衰老、死亡等生命现象。不同组织、不同时期基因的有序表达即基因表达的时间和空间特异性，即为基因的差异表达(differential gene expression)^[1]，成为调控细胞生命活动过程的核心，因此，通过比较同一类细胞(或不同细胞)不同生理(或病理)条件下或不同生长发育阶段的基因表达差异，成为分析生命活动规律和揭示疾病发生及药物作用机理的重要手段^[2]。抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)^[3]及高通量转录组测序(RNA-seq)^[4]等技术的广泛应用，加快了基因差异表达分析速度。大量基因差异表达数据的验证分析，成为一系列生物信息学分析后，对差异表达基因进行后续研究(如基因功能分析等)的基础^[5]，不同验证方法对目标差异表达基因的筛选速度、准确性、成本有不同影响。最初基于核酸杂交原理建立了一系列基因差异表达分析方法，但诸多不足难以避免，如原位杂交虽可直接在组织或细胞标本上原位检测，解决了特殊样品难以获取问题，但不能进行定量分析^[6]，Northern bolt、液相分子杂交法虽逐渐提高了定量水平和分析通量，但无法简化繁杂的检测流程，并实现微量样品的检测分析。PCR技术^[7]发明后，RT-PCR、荧光定量PCR等方法大幅提高了检测灵敏度，使微量样品的检测分析成为可能^[8]。然而，来源较珍贵或取材难度较大样品的检测分析，仍然面临很多瓶颈问题，深入分析以往差异基因表达检测分析方法，可能会为本领域研究提供重要参考。 1 核酸分子杂交 1.1 Northern印记杂交(Northern blot)

Northern blot方法的发明是基因表达分析技术定量功能的一个重大突破，解决了原位杂交(in situ hybridization,ISH)只能对目的基因表达进行定性分析的不足^[9]。Northern blot首先通过凝胶电泳将RNA按分子量大小分离，然后将分离的RNA分子转移到硝酸纤维素滤膜等固相支持物上，固定后再与特异性探针杂交，通过检测与RNA特异杂交探针的放射性或荧光信号对特定阶段或特殊环境下特定基因的表达量做出推断。张书霞等^[10]用Northern blot比较了MD感染产生的肿瘤组织及正常组织中bcl-2基因的表达量，发现肿瘤组织中该基因表达量显著高于正常组织。杨春花等^[11]运用Northern blot对胃癌和癌旁组织的检测结果表明，uPA和uPAR的mRNA在胃癌组织中表达增强，并与胃癌侵袭、转移密切相关。

Northern blot方法使用了特异性探针，假阳性较低，无需进行RNA样品扩增，定量结果更准确。但Northern blot需要的RNA样品较多，且对RNA质量十分敏感，对实验条件要求较高；每次只能检测一个基因的表达水平，若要检测其他基因则需去掉先前的探针再进行杂交实验，费时费力，转膜和洗膜都会造成样品和探针的损失，使灵敏度下降^[12]。 1.2 液相分子杂交法

液相分子杂交法是先将探针与待检样品在溶液条件下杂交，然后进行分子分离和杂交信号检测的一种方法，分为核酸酶S1保护分析法^{[13, 14]}和基于核酸酶S1保护分析法建立的RNA酶保护分析法^[15]，提高了低丰度mRNA的检测灵敏度。这期间，虽然基于PCR技术发展了半定量RT-PCR法并受到关注，但由于技术不成熟，操作复杂且成本高，使核酸酶保护分析法得到了广泛使用^[16]。 1.2.1 核酸酶S1保护分析法(nuclease S1 protection assay)

核酸酶S1保护分析法又称S1-描图(S1-mapping)。首先利用M13噬菌体体系合成高放射性单链DNA探针，探针与待测RNA样品液相杂交形成DNA/RNA双链，经核酸酶S1处理后，未结合的单链RNA被降解，两者结合形成的双链不会被降解，然后采用聚丙烯酰胺凝胶分离，并进行放射自显影信号检测，根据相应区带的有无及强弱，判断目标RNA的有无及数量。Campbel等^[17]采用核酸酶S1保护分析法测定了血管紧张肽基因(angiotensinogen gene)在大鼠不同处理组、不同组织的表达水平。核酸酶S1保护分析法的灵敏度较Northern印记杂交法高，并且定量较准确。 1.2.2 RNA酶保护分析法(RNase protection assay,RPA)

RPA首先将单链RNA探针(标记物为³²P或生物素)与待测RNA样品液相杂交，RNA探针与目的基因结合形成RNA/RNA双链，经核糖核酸酶(RNase)处理后，未结合的单链RNA和过量的RNA探针被降解，而两者结合形成的双链却被“保护”，然后进行后续变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和标记信号检测分析。³²P标记探针可采用放射自显影或磷屏成像系统直接检测；生物素标记探针电泳后转膜，紫外线照射固定，然后酶促显色检测杂交信号，以目标基因和内参基因杂交信号强度比值为样品mRNA相对表达量^[18]。孙芸等^[19]采用多探针RPA法进行了鼠骨髓源树突状细胞(DC)细胞因子mRNA表达分析，结果在骨髓源DC中检测到了IL-13、IL-9和IL-3 mRNA；哮喘组IL-13 mRNA和IL-9 mRNA水平与对照组差异显著，而IL-3 mRNA在哮喘组和对照组组间差异不显著。刘庆辉等^[20]应用RNA酶保护分析法进行对转基因鼠中人βE-珠蛋白基因及鼠α-珠蛋白基因表达的检测表明，三个转基因鼠均表达人βE基因，表达水平分别为内源鼠α基因的79.7%、88.3%和107%，而另一组只整合单纯人βE的转基因鼠未检测到人βE基因表达。

液相分子杂交虽可同时检测多种基因表达，且灵敏度较高，适合于较低表达水平的检测，但同样需要繁琐的RNA探针制备过程，同时，聚丙烯酰胺凝胶电泳又大幅增加了检测时间和成本，检测方法仍然受到RNA初始样本量较大的困扰。 2 PCR扩增法 2.1 反转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)

PCR技术发明后，基于PCR反应发明了RT-PCR法。RT-PCR是进行转录水平基因差异表达验证的最简单方法。首先以制备的组织mRNA为模板，在反转录酶作用下体外合成cDNA链，再以cDNA为模板，通过PCR对目标基因DNA片段进行扩增，然后采用琼脂糖凝胶对目标基因表达情况进行定性检测。RT-PCR可检测到单个细胞中少于10个拷贝的特异RNA，这是杂交鉴定法所无法达到的灵敏度，RT-PCR法因此并被广泛用于mRNA表达分析，尤其被用于低丰度mRNA和对表达有无的检测分析^[21]。龙火生等^[22]运用RT-PCR方法证明猪ob基因在皮下脂肪组织中表达，而在肝脏组织中不表达。这种方法检测较为灵敏，但无法进行定量分析。 2.2 半定量RT-PCR

为实现基因表达差异的定量检测，β-肌动蛋白(β-actin)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)等持家表达基因被用作内部参照^[23]与目的基因同步进行RT-PCR检测，建立了半定量RT-PCR方法，该方法采用Total Lab等软件对不同样品的RT-PCR产物凝胶电泳条带进行灰度分析，以目的基因与内参基因的灰度比值表示mRNA的相对水平，对目标基因的表达水平做出初步推断^[24]。秦宁^[25]采用β-actin作为内参利用RT-PCR对利用数字基因表达图谱(digital gene expression profile,DGE)分析得到的8个猪骨骼差异表达基因进行了表达验证，证明这些基因的差异表达可靠性。王栋等^[26]采用半定量方法证明了细胞质异柠檬酸脱氢酶基因在杂种与纯种鸡肝脏组织间的差异表达。

RT-PCR法使RNA检测灵敏度提高了几个数量级，实现了极为微量RNA样品的分析检测，同时，半定量RT-PCR可以用于基因差异表达检测分析。但是，这种检测只是相对定量，其定量结果不够准确，而且，研究表明，很多持家基因表达并不是恒定不变，不同组织持家基因的表达也不是完全相同^[27]。另外，由于其高度的敏感性，检测分析中应尽量避免污染带来的不良影响^[28]。 3 实时荧光定量PCR

RT-PCR和半定量PCR都是在PCR扩增结束后，通过检测扩增产物对基因表达差异进行推断。而在PCR反应体系中引入荧光基团作为信号标记，则可通过检测荧光信号随PCR进程的变化，对未知模版做出实时定量推断^[29]。荧光染料和荧光探针是两类常用荧光标记。 3.1 荧光染料法

1992年Higuch等在PCR反应中加入核酸染料EB(溴化乙锭)，伴随PCR扩增，核酸染料嵌入DNA双链并释放荧光，通过测定与PCR产物同步增加的荧光信号强度，即可推断核酸扩增结果，开创了实时闭管检测荧光信号的核酸定量方法^{[30, 31]}。定量PCR检测时，每次扩增循环后，仪器自动检测反应管内的荧光强度，以前15个PCR循环的荧光信号为本底信号，将3~15个循环荧光信号标准偏差的10倍设为荧光阈值，记录每个反应管内荧光信号达设定阈值的循环数即Ct值(C代表cycle，t代表threshold)，每个模版的Ct值与该模版起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品绘制标准曲线，横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。只要获得未知样品的Ct值，就能通过标准曲线计算出样品起始拷贝数^{[32, 33]}。1998年，比EB更灵敏的非饱和菁类荧光素SYBR GreenⅠ被应用于荧光定量，通过检测SYBR GreenⅠ与双链PCR产物双螺旋小沟结合后激发的荧光进行定量分析^[34]，荧光定量PCR检测灵敏度进一步提高。张贞等^[35]采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR，以GAPDH为内参，检测36对结肠癌组织及其配对的正常结肠组织中Musashi 1 mRNA的表达情况，结果显示,在结肠癌组织中,Musashi 1 mRNA的相对表达水平显著高于正常结肠组织。胡义洁等^[36]采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR，以β-actin为内参，检测F0代保育期转双基因猪和同窝非转基因猪pGH和IGF-1的的表达差异情况，结果表明F0代转双基因猪pGH的表达量是同期非转基因猪的1.2倍,IGF-1的表达量是同期非转基因猪的1.53倍。

荧光染料定量PCR法可以实时定量监测模板DNA的PCR扩增效果，明显优于半定量PCR，且使用方便，不需要复杂设计；然而，荧光染料与非特异PCR产物(如引物二聚体)结合可产生假阳性信号，虽然可利用熔解曲线(melting curve)区分特异性和非特异性扩增^[37]，但荧光染料的非特异性影响到了该方法的推广应用。 3.2 荧光探针法 3.2.1 Taqman探针法

为解决荧光染料的假阳性问题，1996年，Heid^[38]结合Taq酶5′核酸酶活性与荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)原理，将可在两条引物间与模版特异结合的20~24bp探针引入荧光定量PCR体系，提出了Taqman探针荧光定量PCR法。在探针两端分别标记一个荧光报告基团(供体)和荧光淬灭基团(受体)，探针完整时，5′末端报告基团与3′末端淬灭基团距离较近，其荧光能量被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号，但PCR反应过程中，Taq酶的3′→5′外切酶活性将探针水解，报告基团荧光信号因远离淬灭基团而被仪器检测到，并且荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步^[39]。但探针长度较长，两端荧光基团距离较远，荧光淬灭不彻底，而且淬灭基团也会产生一定荧光，使定量结果发生偏差。为减少检测偏差，2000年美国ABI公司推出了一种新的Taqman-MGB探针^[40]，在3′末端采用了非荧光淬灭基团，降低了本底信号的干扰，同时在3′末端连接一个MGB(minor groove binder,MGB)修饰基团，通过MGB基团使探针与模版稳定结合，提高了探针Tm值。同样Tm值条件下，MGB探针可比普通Taqman探针设计得更短，荧光报告基团和淬灭基团距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，且短探针也降低了设计难度和成本^[41]。因此，Taqman探针荧光定量PCR在基因表达检测中得到了推广应用。吴珊珊等^[42]以U6为内参，运用Taqman探针实时荧光定量PCR，对肝脏疾病患者血清miR-122表达水平的检测结果显示，患者血清miR-122均不同程度增高。侯彦强等^[43]运用Taqman-MGB探针技术，以GAPDH为内参，对不同组织ECM1基因表达的检测表明，正常黏膜和腺瘤组织无明显差异，结直肠癌(淋巴结未转移)组显著高于正常黏膜和腺瘤组织组，结直肠癌(淋巴结转移)组显著高于其他三组。

Taqman探针进一步提高了定量PCR的专一性；改良后的MGB探针再一次优化了原Taqman探针荧光淬灭不彻底导致的本底信号较高的不足；但水解报告基团的Taq酶活性对定量结果影响很大；探针设计有一定难度，需要验证探针效果，且合成探针及双荧光基团标记成本很高。 3.2.2 分子信标(molecular beacons)

Tyagi等^[44]基于分子信标建立了荧光定量PCR方法。像Taqman探针一样，分子信标两端同样具有荧光报告基团和荧光淬灭基团，但其分子序列中除含有模板的互补序列外，两端还设计了一段互补序列，分子信标游离时呈发卡结构，因FRET原理不产生荧光；通过变性、复性的PCR循环，分子信标与模版结合，两端的报告基团和淬灭基团分开，产生荧光信号，而未与模版结合的分子信标则因茎环结构发生荧光淬灭^[45]。随着扩增产物的积累，荧光强度增加，从而实现了目标基因的定量检测。李军等^[46]运用分子信标法，以β-actin为内参，发展了一种快速测量正常细胞系和鼻咽癌肿瘤细胞ING1转录产物的方法。

与Taqman探针比，分子信标的发卡结构使荧光基团与淬灭基团空间上紧密集合，大大降低了荧光背景；但探针设计复杂，如果茎部结构的Tm值过高，可能会影响探针与模版的杂交。 3.2.3 双杂交探针

为避免分子信标较复杂的探针设计，Wittwer等^[47]将荧光供体基团和荧光受体基团分别标记在2条不同的探针序列上，建立了双杂交探针(FRET探针或Light cycler探针)荧光定量PCR方法。两条探针间距离1~5bp，上游探针3′末端结合荧光供体基团，下游探针5′末端结合荧光受体基团，受体受到上游探针供体荧光的激发，产生荧光，只要检测受体基团发出的荧光就可对被检测基因拷贝数进行定量推断。两探针游离时，两荧光基团距离远，激发供体基团产生的能量不能传递给受体基团，受体基团不发出荧光；探针与模版序列杂交后，供体基团与受体基团靠近发生FRET，供体基团所激发的能量传递给受体基团，后者释放可检测荧光^{[48, 49]}。模版每复制一次就有一个荧光信号释放，释放的荧光信号与PCR扩增产物同步增长。刘延菊等^[50]运用Light cycler探针实时荧光定量PCR法，以G6PDH作为内参，检测了乳腺癌、癌旁组织、乳腺腺病组织中c-erbB-2的表达，结果显示，乳腺癌组c-erbB-2的表达水平明显高于其他两组。

双杂交探针法中，只有当两个探针都与模版结合时才产生荧光，因此特异性较高，但需要设计两条探针，设计复杂且成本较高。 3.3 荧光引物LUX(light upon extension)

荧光引物法在分子探针基础上发展而来，是在引物3′末端直接标记荧光基团的一项定量技术。引物游离时，该引物可自身配对形成发卡结构使荧光淬灭；当引物与模版结合，对目标基因进行扩增时，发卡结构被打开，释放荧光，其荧光信号可在双链扩增片段上检测到，并随扩增逐渐增加^[51]。李桂民^[52]基于荧光引物LUX建立了一种HBV病毒数量实时定量PCR检测方法，结果表明，该检测方法的Ct值与HBV的DNA浓度存在很好的线性关系，并且灵敏度很高，可对最低每毫升血清中50拷贝的HBV做出准确检测。

此方法无需设计和合成探针，节省实验成本；由于没有加入特异性探针，特异性低于探针法。 4 问题与展望

对于较易获取或mRNA含量较多的样品，上述方法均可用来检测目的基因的差异表达，但Northern印记杂交法、液相分子杂交法需要较多细胞样品，不适合较难获取或含微量mRNA的细胞(如处于精子变形期的圆形精子细胞和长形精子细胞)的检测。原位杂交可直接在组织标本或细胞标本上检测目的基因，免去了获取细胞样品的过程，但仅能对目的基因进行定性分析；荧光定量PCR法可与冰冻切片和激光显微切割技术相结合，定量检测较难获取样品的基因表达^[53]；最近发展的单细胞荧光定量PCR法极大减少了细胞样品量，仅需要1~10个细胞即可完成荧光定量PCR反应^{[54, 55]}，但单细胞荧光定量PCR方法尚不成熟，还需要进行优化反应体系、选择适宜PCR佐剂(如BSA)等多方面完善，以提高扩增产量、特异性和稳定性^[56]。随着机电、生物信息及分子生物学等技术不断改进，基因差异表达验证方法会更加简洁、高效、准确，成本也将大大降低，为研究不同分化、发育时期和不同器官、组织的基因表达分析提供更有力的技术平台。