原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，而在我国肝癌死亡率高居癌症死亡率的第二位。因此，阐明肝癌的发生发展机制，进而在此基础上寻找预防和治疗性干预的新靶点显得尤为迫切。

S100蛋白家族是一类低分子质量的钙结合蛋白，它们参与调节细胞存活、分化、运动及细胞信号转导等多种成员，与肿瘤的发展、转移有关^{[1, 2]}。S100A9(calgranulin B，MRP14)是该家族中比较重要的一员，在粒细胞、单核细胞和肿瘤细胞等多种细胞中呈现高表达，与感染性疾病、免疫性疾病、炎症和恶性肿瘤等密切相关^{[3, 4]}。研究表明，S100A9在胃癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌和肝癌等多种肿瘤中高表达；S100A9不仅在肝癌细胞中高表达，而且与其不良分化有关^{[5, 6, 7, 8]}。 S100A9在人和鼠肝癌细胞中表达上调，并且可以防止肝癌细胞Hep3B免受TNF-γ诱导的凋亡的影响^[9]。然而，在肝癌微环境中的S100A9对肝癌的具体作用及机制尚不清楚。

晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end product,RAGE)是一种多配体受体，属于免疫球蛋白超家族的一员。大量研究表明，RAGE与配体结合后激活下游信号级联对肿瘤的生长及转移发挥重要作用^{[10, 11]}。在肝癌中，已证实RAGE在癌组织中异常高表达，且参与调节癌细胞的增殖、迁移、侵袭及肿瘤血管生成等，对肝癌的发展起着重要作用^{[12, 13, 14, 15]}。

已有研究发现RAGE能够与S100家族多种成员结合，包括S100A12、S100B、S100A1和S100P^{[16, 17]}。此外，新近研究发现乳腺癌中RAGE能够与S100A9结合发生相互作用促进乳腺癌细胞的恶性增殖^[18]。基于此，本课题拟研究肝癌微环境中S100A9对肝癌的细胞生物学作用并探讨该作用是否与膜上RAGE有关。 1 材料与方法 1.1 材 料 1.1.1 细胞

人肝癌细胞系HepG2与人正常肝细胞系L02(重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室保存)。 1.1.2 组织

收集重庆医科大学附属第一医院经病理学诊断为肝癌患者(10例)的癌组织及癌旁组织(距癌组织至少5cm)，待组织切除后立即放入液氮内保存备用。组织学分化：高分化2例，中分化 6 例，低分化2例。国际抗癌联盟的肿瘤、淋巴、转移(TNM)分期标准进行分期：Ⅰ期3例、Ⅱ期3例、Ⅲ期2例、Ⅳ期2例。患者手术前均未接受放射治疗、化学药物治疗或其他治疗。所有患者术前均签署知情同意书，符合医学伦理学规定。 1.1.3 细菌及质粒

大肠杆菌BL21(重庆医科大学分子医学实验室)；pGST-moluc-hS100A9、pGST-moluc(芝加哥大学医学中心分子肿瘤实验室赠送)。 1.1.4 主要试剂

DMEM/HIGH GLUCOSE培养液和胎牛血清(Hyclone公司)；MTT、DMSO、基质胶ECM (Sigma)；Millicell小室(Millipore公司)，鼠抗人S100A9抗体(sc-58706，Santa Cruz)；鼠抗人β-actin抗体 (sc-47778，Santa Cruz)；兔抗人Na,K-ATPase抗体(#3010，Cell Signaling Technology)；兔抗人RAGE抗体(sc-5563,Santa Cruz)，RAGE中和抗体(ab89911,abcam)；羊抗兔IgG/HRP标记、羊抗鼠IgG/HRP标记、SP-9002免疫组织化学染色试剂盒、DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；PVDF膜(Millipore公司)；化学发光试剂盒(Thermo公司)；Western及IP细胞裂解液(P0013)、膜蛋白提取试剂盒、苏木精-伊红染液(HE)(上海碧云天公司)；蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(美国Roche公司)；p38特异性抑制剂 (SB203580)，ERK1/2特异性抑制剂 (PD98059)(Santa Cruz)。 1.2 方 法 1.2.1 Western blot

用于分析人肝癌组织与癌旁组织中S100A9的表达，GST-S100A9的鉴定及细胞膜上RAGE的表达。将研磨后的组织用PBS洗两次，加入细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂)200μl/100mm培养皿，冰上裂解30min，4℃、12 000r/min离心20min，所得上清液即为细胞总蛋白质溶解液，用于后续S100A9的检测。根据膜蛋白提取试剂盒操作步骤进行细胞膜蛋白的提取，用于后续的膜上RAGE的检测。将以上的蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，湿转法转膜，5%牛血清白蛋白封闭1h，一抗(1∶1 000)4℃孵育过夜，二抗(1∶5 000)37℃孵育1h，按ECL试剂盒说明进行显色，GelDoc凝胶成像仪采集图像，通过Quantity One软件分析获得各条带的吸光度值。 1.2.2 免疫组织化学(IHC)

将包埋好的肝癌组织与癌旁组织切片首先进行脱蜡：在56℃ 预热的二甲苯1、2中各脱蜡20min。放入100%、90%、80%、70%乙醇中各3min水化。加入0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液抗原修复。然后在切片组织上滴加3%H₂O₂，室温孵育10min。滴加免疫组织化学试剂盒中的试剂A(封闭用山羊血清工作液)于组织上室温孵育10~15min。滴加S100A9抗体(1∶300稀释)37 ℃孵育2h，滴加试剂B(生物素化二抗工作液)37℃孵育15min，滴加试剂C(辣根酶标记链酶卵白素工作液)37℃孵育15min。滴加DAB显色液，显色约10min。然后浸泡于苏木精中复染3min，饱和碳酸锂中浸泡10s，盐酸乙醇中浸泡2s，再浸入饱和碳酸锂中10s。将复染后的切片依次放入70%、80%、90%、100%乙醇中，各放3min脱水。透明：二甲苯1、2、3，各放置5min。中性树脂封片。 1.2.3 重组蛋白的制备与鉴定

氯化钙法制备BL21感受态，取100μl/管的感受态BL21，分别加入pGST-moluc-hS100A9 和pGST-moluc进行化学转化，转入LB培养基中，37℃、180r/min培养1h，取100μl转化反应液铺于LB平板培养，37℃过夜，挑取菌落接种到含AMP 100μg/ml的LB培养基，37℃、180r/min培养过夜；取培养物1.5ml加到含AMP的300ml LB培养基中，振荡培养3h，加入 IPTG，继续振荡培养 3h，完成融合蛋白的诱导表达；离心收集细菌沉淀，加入蛋白酶抑制剂和0.1%的Triton-X 100，冰上超声裂解细菌，然后离心收集上清液，加入GS4BB，进行亲和吸附3h，离心弃上清液，然后加入洗脱液，洗脱3次，3h/次，上清液即为融合蛋白，取20μl进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色、凝胶成像仪成像，再用Western blot进一步鉴定，超微量分光光度计进行定量(具体步骤见参考文献)^[19]。 1.2.4 MTT法检测细胞存活能力

实验分组：Blank组，GST组，10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml GST-hS100A9组。取对数生长期的HepG2细胞以每孔2×10³个接种于96孔板中，在完全培养基中培养12h后，换为加有处理因素的含1% FBS的培养基继续培养1天、2天、3天、4天，到指定培养时间后，加入MTT试剂10μl，然后37℃孵育4h，再加入DMSO摇床上低速振荡10min，在酶标仪上测定各孔在492nm处的OD值，相同条件下实验重复3次。在阻断实验中，HepG2细胞预先被Anti-RAGE中和抗体(100μg/ml)处理1h，然后加入GST-S100A9。 1.2.5 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力

取对数生长期的HepG2细胞或L02细胞制成无血清的单细胞悬液，调节相同的细胞密度10⁵个/ml，取已调节好的细胞悬液400μl与GST-S100A9或GST(20μg/ml)及Anti-RAGE中和抗体(100μg/ml)混合，并接种在前一天铺上基质胶ECM的Transwell小室的上腔中，下腔中加入600μl含20% FBS的完全培养基，每组3个复孔。24h后取出小室，用湿棉签拭去微孔膜上层的细胞，PBS小心冲洗，无水乙醇固定20min后，PBS冲洗，风干后苏木精-伊红(HE)染色。于倒置显微镜下放大100倍观察并计数穿膜细胞数。相同条件下实验重复3次。 1.3 统计学分析

实验数据以均值±标准差(x±s)表示，采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析。 2 结 果 2.1 S100A9在人肝癌组织中的表达

收集人肝癌组织标本10例，Western blot检测结果显示，其中8例标本肝癌组织中S100A9表达较癌旁组织显著升高，选取5例作为代表图，Sample 1、2、4和5肝癌组织中S100A9表达较癌旁组织显著升高，具有统计学意义(P<0.01)，Sample 3肝癌组织与癌旁组织中S100A9表达无显著性差异(P>0.05)[图 1(a)]。免疫组织化学结果与Western blot结果一致，免疫组织化学结果显示，在肝癌细胞的胞浆与胞膜中S100A9的表达较正常组织显著升高[图 1(b)]。

图 1 S100A9在人肝癌组织与癌旁组织中的表达 Fig. 1 S100A9 expression in human HCC tissue and normal tissue (a) Western blot (b) Immunohistochemistry* P<0.05，** P<0.01 compared with normal tissue

图选项

如图 2(a)所示，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示GST的分子质量为26kDa、GST-S100A9为39kDa。如图 2(b)所示，Western blot显示重组蛋白GST-S100A9与S100A9抗体呈阳性反应，而GST无此条带。采用Quantity One 软件计算出GST-S100A9蛋白纯度大于90% [图 2(a)]。

图 2 重组蛋白GST-S100A9的鉴定Fig. 2 Identification of recombinant protein GST-S100A9(a) SDS-PAGE (b) Western blot

图选项

肝癌细胞HepG2被不同浓度的GST-S100A9(0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml)处理4天后，用MTT法检测细胞密度，根据酶标仪检测的OD₄₉₂值结果发现，在3天和4天时，浓度为10μg/ml和20μg/ml 的GST-S100A9处理组均促进了HepG2细胞的存活 (P<0.05和P<0.01)，而空白组、GST对照组及其他浓度处理组无显著差异(P>0.05)[图 3(a)]。肝正常细胞L02同时被不同浓度的GST-S100A9(0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml)处理4天后，用MTT法检测OD₄₉₂值发现，各组均无显著性差异(P>0.05)[图 3(b)]。

图 3 MTT法检测GST-S100A9对HepG2细胞与L02细胞存活的影响Fig. 3 Effect of GST-S100A9 on proliferation of HepG2 cells and L02 cells by MTT(a) HepG2 (b) L02 * P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001 compared with GST group

图选项

采用Transwell侵袭实验检测GST-S100A9对HepG2细胞与L02细胞侵袭的影响，GST-S100A9处理HepG2细胞24h后，穿膜细胞数较GST组增加1倍(P<0.01)，而GST组与Blank组之间无显著性差异(P>0.05)。然而，GST-S100A9处理L02细胞24h后，Transwell侵袭实验结果显示，Blank组、GST组与GST-S100A9组的穿膜细胞数均无统计学差异(P>0.05)(图 4)。

图 4 Transwell侵袭实验检测GST-S100A9对HepG2细胞与L02细胞侵袭的影响Fig. 4 Effect of GST-S100A9 on proliferation of HepG2 cells and L02 cells by Transwell invasion assay** P<0.01 compared with GST group

图选项

提取肝正常细胞L02与肝癌细胞HepG2的细胞膜总蛋白质，采用Western blot方法检测RAGE的表达，MCF-7细胞中RAGE的表达作为阳性对照。结果显示，RAGE在HepG2细胞中表达显著高于L02细胞，差异具有统计学意义(P<0.01)(图 5)。

图 5 Western blot检测RAGE的表达Fig. 5 RAGE expression detected by Western blot** P<0.01 compared with L02 group

图选项

基于RAGE在HepG2细胞的高表达及乳腺癌中与RAGE和S100A9的相互作用报道^[18]，我们研究RAGE是否参与介导S100A9对HepG2细胞促存活及促侵袭的作用。采用RAGE中和抗体来阻断S100A9与RAGE受体的结合作用，检测HepG2细胞存活及侵袭能力的变化。

MTT检测结果显示，GST-S100A9处理HepG2细胞3天和4天后，HepG2细胞的存活能力与Blank组、GST组、Anti-RAGE组相比，显著增强(P<0.05，P<0.01)。GST-S100A9与Anti-RAGE同时处理HepG2细胞3天和4天后，HepG2细胞的存活能力与GST-S100A9组相比显著降低(均P<0.05)。Blank组、GST组、Anti-RAGE组相比，HepG2细胞的存活能力无显著影响(P>0.05)[图 6(a)]。

Transwell侵袭实验结果显示，GST-S100A9处理HepG2细胞24h后，穿膜细胞数较Blank组、GST组、Anti-RAGE组显著增加(P<0.01)。GST-S100A9与Anti-RAGE同时处理HepG2细胞24h后，HepG2细胞的穿膜细胞数较GST-S100A9组显著降低(P<0.01)。Blank组、GST组、Anti-RAGE组相比，HepG2细胞的侵袭能力无显著影响(P>0.05)[图 6(b)]。

图 6 Anti-RAGE阻断S100A9对HepG2细胞促存活(a)与促侵袭(b)的作用Fig. 6 Anti-RAGE treatment abrogated the S100A9-promoted proliferation(a) and invasion(b) of HepG2 cells

图选项

在肝癌中，肿瘤微环境对肝癌的发生发展、侵袭及转移起着至关重要的作用^[20]。S100A9正是肿瘤细胞及间质细胞表达并分泌的重要分子，参与肿瘤微环境的组成。已有文献报道，S100A9在肝癌、侵袭性乳腺癌、肺腺癌、甲状腺癌宫颈癌及鼻咽癌等肿瘤中高表达，且与肿瘤的恶性程度呈正相关^{[8, 21, 22, 23, 24, 25]}。我们也发现S100A9在肝癌中高表达，与Arai等^[8]的结果一致。基于S100A9在多种肿瘤的异常表达及与肿瘤的进展密切，S100A9可能参与肿瘤的发生发展。

为阐明肝癌中S100A9的高表达是否与肝癌发生发展有关，我们使用外源性的重组S100A9蛋白(GST-S100A9)作为干预工具，探索S100A9对肝癌细胞系HepG2的生物学作用。我们发现，S100A9 (20μg/ml)可以促进肝癌细胞系HepG2的存活与侵袭。这一结果与S100A9在前列腺癌、乳腺癌及结直肠癌中的作用是一致的^{[7, 18, 26, 27]}。此外，S100A9对肝癌细胞促侵袭作用也进一步提示其可能与肝癌的转移有关。

S100A9对肝癌细胞系HepG2有作用，而对肝正常细胞系L02无作用，我们猜测其原因与S100A9的受体有关。在乳腺癌中，RAGE可作为S100A9信号转导的受体^[18]。因此，我们检测了HepG2细胞与L02细胞膜上RAGE的表达，发现HepG2细胞膜上RAGE的表达显著高于L02细胞。RAGE在肝癌细胞水平的高表达与之前Yaser等^[28]报道的关于RAGE高表达于肝癌组织是一致的。值得注意的是，采用RAGE阻断抗体及封闭RAGE活性位点后，S100A9对HepG2细胞的促存活与促侵袭作用均被逆转。该部分结果也进一步解释了S100A9对肝正常细胞无影响以及对癌细胞有作用是由于其膜RAGE表达差异所致。基于RAGE与S100A9对肝癌细胞存活及侵袭的重要作用，为将来从分子水平干预肝癌的发生及转移提供了重要的实验依据。

综上，S100A9可以促进肝癌细胞系HepG2的存活与侵袭，并且是依赖于RAGE的。