文章信息
- 沈平, 李昂, 章秋艳, 李文龙, 宋贵文
- SHEN Ping, LI Ang, ZHANG Qiu-yan, LI Wen-long, SONG Gui-wen
- 农业生物技术专栏转基因产品标准物质概述
- Overview for Genetically Modified Organisms Detection Reference Materials in China
- 中国生物工程杂志, 2015, 35(4): 107-111
- China Biotechnology, 2015, 35(4): 107-111
- http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20150416
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文章历史
- 收稿日期:2015-01-16
- 修回日期:2015-03-05
2. 上海交通大学 上海 200240;
3. 农业部环境保护科研监测所 天津 300191
2. SHANGHAI Jiao Tong University, Shanghai 200240, China;
3. Agro-Environmental Protection Institute, Ministry of Agriculture, Tianjin 300191, China
当今世界人类面临着许多共同关注的问题:如食品安全、医疗保健的质量,这些问题的解决需要分析测量获得必要信息。因此,对于测量精确性与准确性,以及测量结果互认的要求越来越高,需要使用标准物质保证测量结果的质量和溯源性。开展转基因产品标准物质的研制可以满足转基因安全检测和安全管理的需求。
1 转基因产品标准物质及其作用 1.1 标准物质的定义和基本特性在JJF 1001-2011 《通用计量术语及定义》中,对标准物质和有证标准物质的定义如下:
标准物质是具有足够均匀和稳定的特定特性的物质,该特性的建立适合于其在测量或标称特性检查中的预期用途。
证标准物质(certified reference material,CRM)是附有由权威机构发布的文件,提供使用有效程序获得的具有不确定度和溯源性的一个或多个特性量值的标准物质。
标准物质基本特性是以特性量值的均匀性、稳定性、准确性等特性为主要特征,附有特定的证书,具有与被测量物质相近的组成和特性,并可批量生产。
1.2 转基因产品标准物质的定义和作用转基因产品标准物质(GMO-Reference Material,GMO-RM)是具有一种或多种足够均匀和很好地确定了的特性(转基因成分和含量,含量以含转基因样品的重量与样品总重量百分比、或含转基因靶序列拷贝数与单倍体基因组拷贝数比),在转基因产品检测中用以校准测量装置、评价测量方法或给材料赋值的一种材料或物质。
为推进转基因产品检测标准化,保证转基因检测结果的可比性,更好地开展转基因产品的追踪溯源,转基因产品标准物质是定性与定量检测不可缺少的物质基础。在转基因生物安全监管中,转基因产品标准物质将发挥十分重要的作用。原则上,每个批准商业化的转基因转化体都必须研制配有对应的标准物质,保障转基因产品的检测、监测和溯源。同时,应用可靠的标准物质可有效提高检测结果可比性、有效性和溯源性,减低全球转基因农产品贸易因为转基因含量测定差异引起的纠纷等。
2 转基因产品标准物质种类及其优缺点转基因产品检测可以使用核酸类标准物质或蛋白类标准物质,蛋白质类转基因产品标准物质的研制进展缓慢。国际上研制转基因产品标准物质的单位较少,主要有欧盟联合研究中心下属的标准物质与测量研究所(IRMM)、美国油脂化学家协会(AOCS)、日本国立食品综合研究所(National Food Research Institute,NFRI),德国的SIGMA公司也生产少量转基因产品标准物质。目前,市场上在售的有证标准物质主要由IRMM和AOCS生产,此外,SIGMA公司生产的用于油菜籽 GT73、GS40/90、MS8xRf3 和 Oxy235 定性检测的GMO 标准品套装也在销售。
核酸类转基因标准物质主要包括3种形式:基体标准物质(matrix reference material)、基因组DNA标准物质(genomic DNA reference material)、质粒DNA标准物质(plasmid DNA reference material)。标准物质产品具有较高的经济附加值。用于制备转基因产品检测标准物质的候选物出售价格为每克粉末50 欧元,或10 μg DNA 100 欧元。有证粉末标准物质的售价为每克55欧元,有证DNA标准物质销售价格为10μg 175美元。在售的转基因标准物质主要有161种,涵盖转化体55个,详见表 1。
国家或地区 | 品种 | 转化体数量(个) | 标准物质种类及数量(个) | 标准物质总数(个) | 合计 | |||
种子标准物质 | 基因组DNA标准物质 | 种子粉末标准物质 | 质粒DNA标准物质 | |||||
欧盟 | 大豆 | 4 | 21 | 1 | 22 | 108 | ||
玉米 | 12 | 59 | 3 | 62 | ||||
甜菜 | 1 | 2 | 2 | |||||
棉花 | 4 | 10 | 10 | |||||
土豆 | 3 | 12 | 12 | |||||
美国 | 油菜 | 8 | 2 | 8 | 10 | 45 | ||
棉花 | 6 | 3 | 5 | 8 | ||||
玉米 | 6 | 2 | 7 | 9 | ||||
大豆 | 6 | 4 | 7 | 11 | ||||
土豆 | 1 | 3 | 3 | |||||
水稻 | 1 | 2 | 2 | |||||
甜菜 | 1 | 2 | 2 | |||||
中国 | 水稻 | 2 | 8 | 8 | 8 | |||
合计 | 55 | 161 |
基体标准物质是与被测样品具有相同或相近基体的实物,是给被测物质赋值的最有效的一类标准物质。转基因产品基体标准物质由原始材料制备而成。一般情况下,基体标准物质由纯合的转基因种子材料和遗传背景相似的非转基因种子材料按特定的质量比例混合配置而成。目前,研制的基体标准物质主要有种子标准物质和种子粉末标准物质。基体标准物质制备主要包括:候选物的种植与鉴定;候选物研磨、颗粒粒径分布、含水量分析;转基因和非转基因候选物DNA抽提效率比较;称重和配比混合并分装;均匀性和稳定性测试;定值;试用评价。
基体标准物质的优点在于它更接近转基因检测过程中实际样品的状态,减少基体效应(matrix effect)带来的检测误差[1],此外基体标准物质还可用于蛋白检测。而以浓度梯度形式存在的基体标准物质与以纯品形式存在的基体标准物质也各有利弊。IRMM生产的浓度梯度形式的标准物质可用相对定量法直接用于转基因检测,使用简便,但因其浓度最高为10%,无法用相对定量法检测10%以上的转基因样品。AOCS生产的纯品形式的标准物质则应用于绝对定量法,使用也比较简便。
种子颗粒形态的标准物质优点在于易于制备,基体效应小,且能用于蛋白检测法。但存在进出口的问题,且在使用过程中需要用户自己研磨。因此目前种子颗粒形态的标准物质也仅AOCS-0304这一例。之后因冷冻研磨技术的提高,几乎都制备成种子粉末[2]。
2.2 基因组DNA标准物质转基因产品基因组DNA标准物质是从转基因产品和非转基因产品的组织(如种子、叶片)中提取的基因组DNA,制备用于转基因产品定性和定量检测的标准物质。根据来源主要分为种子基因组DNA和叶片基因组DNA两种。基因组DNA标准物质的制备主要包括:候选物的种植与鉴定;基因组DNA提取与纯化;均匀性和稳定性测试;定值;试用评价。
基因组DNA形态的标准物质最大的优点在于,在荧光定量PCR法检测时使用简便[3],且易于制备,若抽成干粉状能稳定储存很长时间。缺点在于基因组DNA无法用于蛋白检测,且标准物质与检测样品DNA质量的差异会给结果带来误差。
2.3 质粒DNA标准物质质粒DNA标准物质最早由比利时科学家Isabel Taverniers提出。质粒DNA标准物质是指一种含有转基因检测外源目的基因和内标准基因的特异性序列片段的线性化或环状质粒DNA分子。其含有的外源目的基因和内标准基因(endogenous reference gene,指具有物种特异性、拷贝数恒定、不显示等位基因变化的保守DNA序列)序列的比值一般是1。质粒DNA标准物质的制备主要包括:质粒分子构建;质粒DNA的繁殖、质粒DNA的提取和纯化;可替代性分析;均匀性和稳定性测试;定值;试用评价。
质粒DNA标准物质的主要优点是可以通过微生物进行大量培养,DNA易于扩增,可提供无限稳定量的标准物质,且纯度高;同一个质粒DNA可以同时包含多个检测靶标片段,高效经济[4]。此外,在缺少转基因植物候选物的情况下,只要有检测的靶标序列和检测方法,就可以构建质粒DNA标准物质,对非法转基因作物进行监测[5]。质粒DNA标准物质最大的缺陷在于质粒DNA与待检样品的DNA标准物质在使用过程中易造成实验室污染。
3 我国转基因产品标准物质研制早在2006年,大连出入境检验检疫局就制备了转基因大豆GTS 40-3-2种子粉末2种二级有证标准物质(量值分别为2.67%±0.15%和3.15%±0.16%),现已停产。随着我国转基因作物研发和监管工作的开展,特别是2008年转基因生物新品种培育重大专项启动后,对转基因标准物质的需求更加迫切。因此,国家启动了转基因产品检测标准物质研制工作,目前,已初步建立了转基因产品标准物质研制技术体系,制备了转基因水稻TT51-1等17个转化体的基体标准物质和科丰6号等18个转化体的质粒DNA标准物质以及双抗玉米12-5等4个转化体的基因组DNA标准物质,为转基因生物安全性评价和监测提供了有利的技术支撑。
3.1 初步建立了转基因产品检测标准物质研制技术体系转基因产品检测标准物质制备涉及标准物质候选物的繁殖鉴定、制备、定值等关键技术环节,在借鉴美国、欧盟等国家和地区的转基因产品检测标准物质研制经验的基础上,建立了一套集标准物质候选物繁殖鉴定、制备、定值、试用和评价及质量控制于一体的规范化转基因产品检测标准物质研制技术体系,包括:“候选物的繁殖鉴定技术规范”,将典型性、转化体纯度和纯合度作为标准物质候选物的关键技术参数,指定了这些参数的鉴定方法及其评判标准;“基体标准物质制备技术规范”,规定了影响标准物质加工质量的候选物含水量、研磨颗粒粒径等技术参数,确定了均匀性、稳定性等关键技术参数的检验方法和评价标准;“基体标准物质定值技术规范”,依据实时荧光定量PCR技术的特点,规定了转基因基体标准物质由多个实验室合作定值,在实验室资质、技术要求、组织要求及数据处理统计方面做了详细的要求,规范了基体标准物质定值的整体流程;“质粒DNA标准物质制备技术规范”,制定了“内标准基因序列+间隔序列+转化体特异性序列”的质粒DNA标准物质构建策略,指定了质粒DNA标准物质加工、特异性、灵敏度、可替代性、均匀性、稳定性等关键技术参数的检验方法和评价标准,以及定值的策略、方法和定值准确性评判标准,确定了质粒DNA标准物质菌种培养程序及其保存条件、批量生产技术及保存条件的关键技术参数。“标准物质试用评价技术规范”,确定了试用与评价机构、人员的选择要求,规定了基于定性和定量PCR方法的标准物质试用评价内容及其结果评价标准。
3.2 制备了一批转基因产品标准物质2008~2014年,我国研制了17种(转化体个数)转基因作物的基体标准物质,包括:转基因水稻TT51-1、克螟稻、科丰6号、G6H1、4-114-72、PA110-15等6种,转基因玉米T25、MIR604、NK603、MON810、MON863、TC1507、12-5、BVLA430101等8种,转基因大豆MON89788、GTS40-3-2等2种,转基因棉花A26-5;研制了18种(转化体个数)转基因作物的质粒DNA标准物质,包括转基因水稻TT51-1、克螟稻、科丰6号等3种,转基因玉米T25、MIR604、NK603、MON810、MON863、TC1507、Bt11等7种,转基因大豆MON89788、GTS40-3-2等2种,转基因棉花MON1445、MON15985、MON88913等3种,转基因油菜Topas19/2、T45、Oxy235等3种;研制了4种(转化体个数)转基因作物的基因组DNA标准物质,包括转基因水稻TT51-1、G6H1、G281等3种,转基因玉米12-5。8种转基因作物(转基因水稻TT51-1、Bt63、转基因玉米NK603、MON810、MON863、TC1507,转基因大豆MON89788、转基因油菜T45)已申请有证标准物质。2种转基因作物(转基因水稻Bt63、转基因玉米NK603)已经获得证书。
转基因标准物质研制体系的建立及标准物质的制备,填补了国内在转基因产品检测标准物质领域的空白。在国际上首次提出“内标准基因序列+间隔序列+转化体特异性序列”的质粒DNA标准物质构建策略,标准物质均匀性、稳定性、量值等关键技术参数的要求与国际接轨。
4 转基因产品标准物质研制展望1983年世界上首例转基因烟草问世,1986年首批转基因植物被批准进入田间试验,1994年-转基因耐储藏番茄在美国被批准投放市场。转基因作物的研发只有30多年的历史,转基因标准的研制更是一个较新的课题,其研制和应用只有10多年历史。目前国际上相关的研究机构不多,标准物质的研制和使用尚存在一些空白和争议,还应在以下几个方面加强研究。
4.1 转基因产品标准物质量值的表达含义虽然目前已有60多个国家颁布了转基因作物标识阈值,但是不同国家的阈值含义不同。转基因量值以质量(转基因样品质量/全部样品质量)为单位,还是颗粒数(转基因种子颗粒数/全部种子颗粒数)为单位,或以基因拷贝数(外源片段拷贝数/植物单倍体基因组拷贝数)为单位,在实际应用中差异很大,尚未取得共识。
4.2 转基因标准物质的形态核酸类标准物质有基体、基因组DNA和质粒DNA这几种不同的形态,但使用不同形态的标准物质对相同样品进行PCR检测时,测出的转基因质量分数存在差异。这种差异可能由标准物质与检测样品的基质差异、PCR扩增效率的差异等因素所致。但待测样品中的转基因质量分数真值到底是多少,哪种形态的标准物质更符合实际检测需求,更能准确评估实际检测样品中的转基因质量分数,尚无法得知。
4.3 转基因蛋白质标准物质随着转基因新技术的应用,转基因核酸检测技术的弱点将凸显,以抗原、抗体为基础的免疫学蛋白质检测将在追溯传递体系中发挥重要作用,加强转基因蛋白质检测标准物质的研制具有重要意义。国际上,美国国家标准和技术研究院(National institute of standards and technology,NIST)、世界卫生组织(World Health Organization,WTO)、英国国家生物制品检定所(National Institute for Biological Standards and Control,NIBSC)等机构较早开展了蛋白质标准物质的研制,NIST研制了一系列蛋白质标准物质,如重组肌钙蛋白等。IRMM研制了人血清蛋白等蛋白质标准物质。中国卫生部等单位研制了糖化血红蛋白等蛋白标准物质,主要应用在医药领域。迄今,国际上还没有关于转基因生物蛋白标准物质研制的报道,在实际检测中主要使用一些实验室内部制备的标准蛋白作为参照标准品。但是,由于外源蛋白在生物体内经常会有翻译后修饰等,因此体外表达的外源蛋白和体内表达的蛋白在活性上可能会有比较大的差异。这也是转基因生物蛋白质标准物质研究的难点所在。
[1] | Corbisier P, Trapmann S, Gancberg D, et al. Quantitative determination of Roundup Ready soybean (Glycine max) extracted from highly processed flour. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2005,383 (2): 282-290. |
[2] | Broothaerts W, Corbisier P, Emons H, et al. Development of a certified reference material for genetically modified potato with altered starch composition. J Agric Food Chem, 2007,55 (12): 4728-4734. |
[3] | Burns M, Corbisier P, Wiseman G, et al. Comparison of plasmid and genomic DNA calibrants for the quantification of genetically modified ingredients. European Food Research And Technology, 2006,224 (2): 249-258. |
[4] | Lievens A, Bellocchi G, Moens W, et al. Use of pJANUS-02-001 as a calibrator plasmid for Roundup Ready soybean event GTS-40-3-2 detection: an interlaboratory trial assessment. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2010,396 (6): 2165-2173. |
[5] | Cao Y, Wu G, Wu Y, et al. Characterization of the transgenic rice event TT51-1 and construction of a reference plasmid. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011,59 (16): 8550-8559. |