Nef蛋白是艾滋病病毒HIV的辅助蛋白，包含206个氨基酸，相对分子质量为25kDa～27kDa，对于艾滋病的发病机理至关重要^{[1, 2, 3]}。早期研究发现，Nef蛋白能够提高HIV病毒在宿主细胞内的复制及感染力^{[1, 4]}。在病毒感染的早期，Nef能通过内吞作用下调宿主细胞表面受体CD4，CD4受体的下调抑制了CD4与gp120的结合从而促进病毒释放^{[5, 6, 7]}。另外，Nef能与多种信号蛋白结合，如与Pak2的结合能影响F-actin的重排^{[8, 9]}；该蛋白高度保守的脯氨酸富集区PxxP(57-80aa)与Src家族激酶的SH3结合，从而抑制或激活它们的催化活性^{[10, 11]}。

hnRNPK是hnRNP家族的一种RNA结合蛋白，分子量为60kDa，它参与多种生物功能的调控，如信号转导、基因表达等^{[12, 13]}。该蛋白包含3个KH (K homology)区和1个蛋白质相互区KI。KH区能与DNA、RNA结合，参与染色体重塑、基因转录、RNA剪接及蛋白质翻译等过程^{[13, 14, 15]}。与Nef相似，KI区存在脯氨酸富集区，它能与含SH3结构的Scr家族激酶相互结合，包括Lck、Lyn等^{[14, 15, 16, 17]}。Yoo等^[17]发现hnRNPK能与N-WASP相互作用，调节细胞的粘附及传播。有研究表明，hnRNPK能调节多种细胞骨架相关基因的表达^{[18, 19]}，敲低hnRNPK可抑制TGF-β1引起的F-actin的极化现象^[20]。

上述hnRNPK与Nef的结构与功能特性特别是他们与细胞骨架的关系，以及Nef下调细胞表面CD4的表达的机制提示我们，hnRNPK也可能参与调节细胞表面CD4的表达。另有研究报道，hnRNPK与Nef存在相互作用，Nef通过hnRNPK增强Tat介导的HIV的转录活性^[21]，但其相互作用对宿主细胞表面CD4的表达是否有影响并不清楚。本研究通过GST-pulldown证实了两者的相互作用，并证明hnRNPK与Nef对细胞表面CD4的表达有相反的调节作用，两者之间有可能存在涉及复杂调控的非直接关系，这为进一步阐明细胞表面CD4表达水平的调节机制提供线索。

质粒pGEX-4T-1、pGEX-4T-GST-Nef、pCMV-N-Flag-Nef、pmCherry-N1、大肠杆菌E.coli DH5α、大肠杆菌E.coli BL21及HeLa-CD4细胞均由本实验室保存。

分别将pGEX-4T-1和pGEX-4T-GST-Nef转化至E.coli BL21感受态细胞，挑取阳性单克隆菌落置于含Amp的LB培养液中，37℃，200 r/min，过夜培养。次日按1∶100的比例扩大培养，至OD₆₀₀为0.6~0.8时加入终浓度为0.2 mmol/L 的IPTG，室温诱导6~8 h。离心收集菌体，用含溶菌酶及PMSF 的EBC裂解液(150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris，1%Triton，pH7.6)重悬菌体,超声破碎后，高速离心收集上清液。上清用Glutathione-Sepharose 4B 亲和层析法纯化目的蛋白。将结合有目的蛋白的GST、GST-Nef球珠重悬于EBC中，各取10 μl珠子悬液进行SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色，分析蛋白纯化情况。

37℃，5% CO₂培养HeLa-CD4，细胞汇合率达80%~90%后收集细胞，加入EBC裂解液(含1 mmol/L蛋白酶抑制剂PI、1mmol/L PMSF、10mmol/L NaF、1mmol/L Na₃VO₄)裂解，4℃高速离心20 min，收集上清，用BCA法测定蛋白浓度。各取50 μg纯化的GST、GST-Nef蛋白与1.5 mg HeLa-CD4全细胞裂解液4℃旋转孵育过夜，2500 r/min，4℃离心5 min，弃上清，珠子用EBC清洗3~5次，加入30 μl 1×SDS loading buffer 沸水煮10 min，SDS-PAGE电泳后用单克隆鼠抗hnRNPK进行Western blot检测。

根据Nef基因序列设计引物，引物序列如下：F：5′-CGGAATTCTGATGGGTGGCAAG TGGTCA-3′(下划线为EcoR Ι酶切位点)；R：5′- CGGGATCCTGGCAGTTCTTG

处于对数生长期的HeLa-CD4细胞按60%汇合率铺板于6孔板，16 h后按Invitrogen公司Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染及hnRNPK的siRNA干扰实验，hnRNPK干扰片段及干扰对照片段序列如下。

siRNA-hnRNPK 1： 5′-UAUUAAGGCUCUCCGUACATT-3′ 5′-UGUACGGAGAGCCUUAAUATT-3′

siRNA-hnRNPK 2： 5′-CCUUAUGAUCCCAACUUUUTT-3′ 5′-AAAAGUUGGGAUCAUAAGGTT-3′

siRNA-control： 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′ 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′

实验分4组：(1)转染pmCherry-N1并加siRNA-control；(2)转染pmCherry-N1并加siRNA-hnRNPK；(3)转染pmCherry-N1-Nef并加siRNA-control；(4)转染pmCherry-N1-Nef并加siRNA-hnRNPK。转染及干扰36 h后收集细胞，取部分细胞用单克隆鼠抗mCherry、hnRNPK进行Western blot检测转染及干扰效果，剩余细胞与CD4-FITC 抗体孵育后，用BD Accuri^TM C6流式细胞仪分析细胞表面CD4表达水平。该实验进行3次独立重复。

样品经SDS-PAGE电泳后电转于PVDF膜上，TBST洗膜3次，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入用5%脱脂奶粉稀释的一抗(1∶1000)，4℃过夜孵育，TBST洗膜3次，加入相应二抗室温轻摇1h，TBST洗膜3次，用ECL发光液进行显影。

分别将pGEX-4T-1和pGEX-4T-GST-Nef转化至E.coli BL21，IPTG诱导表达，收集菌体超声破碎，上清用Glutathione-Sepharose 4B亲和层析法纯化GST和GST-Nef融合蛋白，SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色法检测蛋白纯化情况。结果见图 1，泳道2、8分别表明成功诱导表达了GST和GST-Nef蛋白，GST分子量为26kDa，GST-Nef分子量约为52kDa，泳道6和泳道12表明成功纯化出GST、GST-Nef蛋白。

图 1 GST和GST-Nef蛋白的表达与纯化 Fig. 1 The Expression and purification of GST and GST-Nef 1: pGEX-GST without IPTG induction; 2: pGEX-GST with IPTG induction; 3: The pellet of cell lysates; 4:The supernatant of cell lysates; 5: The flow-through; 6: GST protein-beads after purification; M: Protein marker; 7: pGEX-GST-Nef without IPTG induction; 8: pGEX-GST-Nef with IPTG induction; 9: The pellet of cell lysates; 10:The supernatant of cell lysates; 11: The flow-through; 12: GST protein-beads after purification

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前期研究通过免疫共沉淀实验证明了Nef与hnRNPK在Jurkat细胞里存在相互作用^[21]。为了验证这一发现，我们进行GST-pulldown实验。分别取50 μg纯化于Glutathione-Sepharose 4B上的GST和GST-Nef与1.5 mg HeLa-CD4的全细胞裂解液孵育，反复洗涤后进行SDS-PAGE电泳及Western blot分析，用单克隆鼠抗hnRNPK检测GST-Nef与hnRNPK的结合情况。结果显示(图 2)，GST-Nef蛋白能够与细胞内表达的hnRNPK特异性结合，而阴性对照GST不能特异性结合hnRNPK，从而证实了Nef与hnRNPK存在相互作用。

图 2 GST-pulldown验证Nef与hnRNPK的相互作用Fig. 2 The interaction between Nef and hnRNPK determined by GST-pulldown Used 50 μg the purified GST and GST-Nef incubated with 1.5 mg whole cell lysis from HeLa-CD4 cell respectively. After sufficient cleaning the sample was subjected to SDS-PAGE electrophoresis. coomassie blue staining detected the presence of GST and GST-Nef. Western blot showed the GST-Nef could bond to hnRNPK,but not GST

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以pCMV-N-Flag-Nef为模板，PCR扩增获得的目的片段Nef经EcoR Ι和BamH Ι双酶切后，用T4 DNA连接酶将其插入到载体pmCherry-N1中，连接产物转化至E.coli DH5α，挑取3个单克隆扩大培养，抽提质粒并进行双酶切鉴定。结果(图 3a)显示，③号质粒(泳道7、8)成功将目的片段Nef插入pmCherry-N1载体中，将③号质粒送Invitrogen公司测序，测序结果表明，重组质粒序列完全正确，图 3b为部分测序结果。

图 3 重组质粒pmCherry-N1-Nef的构建Fig. 3 The construction of the recombinant plasmid pmCherry-N1-Nef (a) Identification of pmCherry-N1-Nef by dual-enzyme digestion M: DNA marker; 1: Enzyme-digested product Nef; 2: The pmCherry-N1 plasmid digested by EcoR Ι and BamH Ι; 3,5,7: pmCherry-N1-Nef plasmid from different monoclonal; 4,6,8: Dual-enzyme digestion of different pmCherry-N1-Nef recombinant plasmid (b)Partial sequencing results of pmCherry-N1-Nef plasmid

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为探究hnRNPK是否参与调节细胞表面CD4的表达，以及Nef是否通过hnRNPK调节细胞表面CD4的表达，对HeLa-CD4细胞进行转染及siRNA干扰实验，实验组别设置见方法。Western blot检测转染及干扰效果，结果(图 4a)显示，质粒pmCherry-N1 和pmCherry-N1-Nef成功转染并表达目的蛋白，另外，hnRNPK的干扰效果非常明显。流式细胞术检测细胞表面CD4表达水平，结果见图 4(b)(c)，①③组相比，Nef的表达使细胞表面CD4表达水平大约降低了75%；②④组相比表明，敲低hnRNPK的情况下，Nef的表达以同样的幅度下调细胞表面CD4表达水平；比较 ①②组说明，没有Nef时敲低hnRNPK，细胞表面CD4表达水平降低了50%；③④组相比显示，Nef存在时，hnRNPK的敲低依然使细胞表面CD4表达水平明显下降。结果表明hnRNPK参与调节细胞表面CD4的表达，其调节作用与Nef相反，二者的作用可能独立不相关，但也有可能是涉及复杂调控的非直接关系。

图 4 敲低hnRNPK或表达Nef对细胞表面CD4表达的影响Fig. 4 Analyses of the effect of hnRNPK knockdown or Nef expression on the cell surface epression of CD4 (a)Western blot analyses showing the transient expression of mCherry-Nef and the siRNA interference of hnRNPK in HeLa-CD4 cells (b) Assays of CD4 cell surface expression by flow cytometry The data was analysed by Flow-Jo software (c) Mean fluorescence intensity of cell surface CD4 of three independent experiments The unpaired T test by GraphPad Prism5 software(* P<0.05,*** P<0.001). were performed for the statistical analysis

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HIV Nef蛋白作为病毒的辅助蛋白之一，在病毒感染的早期大量合成，对病毒的复制及感染力至关重要^{[1, 2, 3]}。它能够下调宿主细胞表面受体CD4、CD28及组织相容性复合物^{[6, 22]}。其N端能结合多种信号蛋白复合物，包括Lck、Src、PKCδ、Eed等，简称Nef相关激酶复合物(NAKC)^{[23, 24]}。有研究表明，hnRNPK也是NAKC 成员之一，它通过Eed与Nef间接相互作用，导致Erk1/2的激活，进而增强Tat介导的病毒的转录活性^[21]。另有文献报道，Nef与hnRNPK都存在能与Src家族激酶相互作用的脯氨酸富集区，且两者都与F-actin细胞骨架相关^{[8, 11, 14, 20]}。这促使我们探究hnRNPK是否也参与细胞表面CD4表达的调节，且其调节机制是否与Nef的作用相关。

本研究采用GST-pulldown技术鉴定Nef与hnRNPK的相互作用。首先纯化GST和GST-Nef融合蛋白，看其能否沉淀细胞内源表达的hnRNPK，结果显示，GST-Nef能够与内源的hnRNPK结合，而阴性对照GST不能，证明Nef与hnRNPK确实存在相互作用。为了进一步研究hnRNPK是否参与调节细胞表面CD4的表达，以及Nef是否通过hnRNPK调节细胞表面CD4的表达，我们先构建了带红色荧光标签的真核表达载体pmCherry-N1-Nef，将其转染到稳定表达CD4的HeLa细胞中，并联合hnRNPK的敲低实验，采用流式细胞术分析细胞表面CD4的表达水平。结果显示，不管是否有Nef，hnRNPK的敲低都使细胞表面CD4表达水平明显下降；另一方面，不管是否敲低hnRNPK，Nef的表达都使细胞表面CD4表达水平下调约75%。这些结果表明hnRNPK参与调节细胞表面CD4的表达，其调节作用与Nef相反，本研究提示Nef不是单纯通过hnRNPK下调细胞表面CD4的表达。

在病毒感染的早期，Nef与细胞连接蛋白复合物和NBP1蛋白形成复合物，该复合物再与CD4的胞浆尾区双亮氨酸结合，然后通过内吞作用将复合物转运到溶酶体，促进CD4的降解^{[5, 6, 25]}。有研究表明，细胞受体的内吞作用依赖于细胞骨架^[26]，Nef与Pak2结合影响细胞骨架actin的重排，且Nef能调节actin调节器N-WASP的活性^{[8, 9]}。另有研究表明，hnRNPK调节多种细胞骨架相关基因的表达^{[18, 19]}，并通过作用于RNA及RNA结合蛋白调节细胞的传播及迁移^[27]，在A549细胞中敲低hnRNPK能抑制TGF-β1引起的F-actin的极化，显示hnRNPK对细胞骨架的调节作用^[20]，特别是hnRNPK能结合并抑制N-WASP 的活性^[17]。这提示我们，hnRNPK与Nef对细胞表面CD4表达的调节可能存在非直接关系，两者涉及复杂调控机制，可能通过N-WASP 及细胞骨架建立联系；另一方面，hnRNPK可能通过调节CD4的转录及翻译起调节作用，后期研究可从这两方面进行试验，以确定两者相互作用对细胞表面CD4表达的影响。

本文验证了hnRNPK与Nef的相互作用，并首次证实了hnRNPK有利于细胞表面CD4的表达，这为进一步阐明细胞表面CD4表达水平的调节机制提供线索，为抗HIV的发展提供新思路和新靶点。