氨基酸作为蛋白质的合成单位，对维持人类正常生理功能具有重要作用。然而，有多种代谢必需的氨基酸是人体自身不能合成的，其来源很大程度上依赖于外界食物的供给^[1]。微生物发酵法是目前生产氨基酸的主流方法，因此氨基酸高产菌的选育成为当前的研究热点。

诱变育种是获得高产氨基酸菌的传统育种方法，但该方法具有很大的盲目性和随机性，往往很难获得稳定的高产菌株。氨基酸的生物合成是通过细胞内的代谢网络进行的，该代谢网络是由众多的酶催化相互关联的一系列化学反应以及特异性的膜转运系统构成^[2]。因此，为了提高氨基酸的产量，科研工作者借助于基因克隆与表达技术提出了多种代谢工程改造策略，包括增加氨基酸生物合成的相关基因表达量^[3]、解除终产物对关键限速酶的反馈抑制^{[4, 5]}、解除或降低阻遏蛋白对其合成途径中的各基因的阻遏作用^[6]、更换表达调控元件^[7]、积累NADPH池^[8]、增加氨基酸转运蛋白转运能力^{[9, 10]}等手段理性设计细胞代谢途径对其进行遗传修饰，从而筛选高产氨基酸的菌株^[11]。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)以其安全性高、遗传背景较清楚且基因组尺度代谢网络模型^{[12, 13]}(genome-scale metabolic network，GSMN)已初步构建等优势而被广泛应用于筛选高产氨基酸菌株。本文作者结合国内外研究成果，主要就C. glutamicum应用代谢工程策略指导该菌株的分子育种，提高氨基酸产量的研究工作做一综述，并对目前存在的问题进行分析。 1 代谢工程

微生物代谢工程是基因工程的一个重要分支，利用DNA重组技术修饰或引进特定的代谢反应，达到改变生物体内的代谢流并集中流向靶产物的目的，提高产物的形成和细胞的性能^[14]。代谢工程改造有赖于对分子育种技术手段的掌握，对氨基酸生物合成网络途径和相关基因表达调控机理的了解以及对产物性质的把握。

因此，对C. glutamicum的基因组特性和代谢网络特征进行分析是有必要的。据The Model SEED数据库统计显示，C. glutamicum的全基因组长度为3 309KB，包含了3 138个开放阅读框，其中3 057个基因功能被注释，根据KEGG数据库提供的C. glutamicum集成代谢网络模型可知654个功能被注释蛋白参与催化了922个代谢反应并产生879种代谢产物，这654个蛋白主要有以下几种功能：(1)参与催化EMP途径、 PPP途径、TCA循环及参与催化氨基酸代谢途径的合成酶、限速酶和相关调控蛋白等；(2)参与氨基酸的转运，如转运谷氨酸的NCgl1221蛋白^[15]、转运苏氨酸的ThrE蛋白^[16]以及转运赖氨酸和精氨酸的LysE蛋白等^[17]；(3)参与能量因子和辅助因子的代谢，如催化NAD⁺、NADPH与NADH、NADP⁺相互转化的膜绑定蛋白PntAB等^[18]。因此，实现氨基酸合成网络的增流可从全局的角度系统地合理改造氨基酸合成网络相关基因靶点，在不影响微生物的生长状态下对微生物代谢通量进行定向重置，从而提高产氨基酸菌的发酵水平。 2 代谢工程在产氨基酸菌分子育种中的应用

C. glutamicum作为一类已有50年研究历史的菌株，已被科研工作者经代谢工程改造以高产有机酸、乙醇、二元胺、类胡萝卜素以及氨基酸等^[19]。以下就近几年应用代谢工程获得高产氨基酸的C. glutamicum策略进行介绍。 2.1 氨基酸合成途径的増流

增加目的氨基酸合成途径的代谢流主要通过提高相关目的基因的表达量、解除反馈抑制及反馈阻遏等手段实现。Xu等^[20]在一株精氨酸合成途径中负调控基因发生了致死突变的基础上，通过pJC1表达载体过表达L-精氨酸合成相关的基因簇argCJBDF-argH，发现该基因簇在细胞内所催化的酶活性较原始菌株提高了1.5~2.7倍，增加精氨酸合成途径的代谢通量，使精氨酸产量较原始菌株增加了24.9%，达到了45.3g/L，实验表明，argCJBDF-argH的过表达能有效地提高了精氨酸的产量。当终产物在细胞内过量积累时，会反馈抑制氨基酸合成途径中的关键限速酶，如lysC编码的天冬氨酸激酶是赖氨酸合成途径的关键限速酶，Cremer等发现LysC蛋白的932位半胱氨酸是终产物赖氨酸的反馈抑制结合位点^[21]。因此，Becker等^[22]对LysC蛋白的932位氨基酸更换为苏氨酸，在不降低酶活的前提下解除终产物的反馈抑制，实现了赖氨酸产量零的突破，达到13.16g/L。因此，氨基酸合成途径的限速酶是代谢工程改造中的关键靶点之一。关键酶活性不仅受到终产物的反馈抑制，其编码基因的转录水平还受到阻遏蛋白等调控蛋白的调控，如Cg1486转录调节因子是IclR蛋白家族中的一员，其N端的螺旋-转角-螺旋结构功能区是启动子区域的结合基序，该处可形成二聚体或四聚体^[23]，结合于亮氨酸和色氨酸合成途径(分别为leuBCD和trpEGDCFBA)中的操纵子，从而阻遏其下游基因的转录表达^[24]。因此，Brune等^[25]通过构建C. glutamicum Δcg1486突变菌株，解除阻遏蛋白对相关操纵子的阻遏调控，使得leuB基因编码的3-异丙基苹果酸脱氢酶的酶活性和leuA基因编码的α-异丙基苹果酸合酶较原始菌株分别提高了11.8和3.3倍，有效地提高了亮氨酸的产量，最终获得亮氨酸高产菌。 2.2 旁支代谢途径的截流

氨基酸合成网络涉及到糖酵解、磷酸戊糖途径和三羧酸循环等主要代谢途径，以及相关的氨基酸代谢途径。因此，旁支代谢途径的切断，对目的氨基酸合成网络的集流是必要的。三羧酸循环是糖类、脂类、氨基酸代谢的枢纽，其中的大多数中间代谢产物都是氨基酸合成的前体物质，如α-酮戊二酸是谷氨酸族氨基酸合成的前体物质，因此切断α-酮戊二酸在三羧酸循环中的下游支路，如抑制α-酮戊二酸脱氢酶复合体(ODHC复合体)的酶活性，可实现代谢流集中涌入谷氨酸族氨基酸合成网络。ODHC是由三种酶组成的复合体，其中odhA编码的脱氢酶的活性受到OdhI的调控，当OdhI处于磷酸化状态时会激活OdhA脱氢酶，而OdhI的磷酸化状态是由PknG激酶调控。基于此，Axel等^[26]通过构建C. glutamicum ΔpknG菌株，使OdhI处于未被磷酸化状态，则OdhA处于失活状态，从而抑制ODHC复合体的活性。因此，在添加500mg/L乙胺丁醇诱导培养基中，C. glutamicum ΔpknG菌株的谷氨酸发酵量显著地提高，达到14.12g/L^[27]。此外，Lu等^[28]通过敲除乙酰鸟氨酸氨甲酰转移酶的编码基因argF、α-酮戊二酸脱氢酶的编码基因odhA，以及谷氨酸合成脯氨酸分支途径的关键基因proB，将代谢流量集中导向鸟氨酸的合成，结果显示C. glutamicum (ΔargFΔproBΔkgd)的鸟氨酸产量达到了4.78g/L，而原始菌株只产0.24g/L。以上实验结果表明，旁支支路作为目的氨基酸代谢途径的竞争支路，其截流有利于代谢流集中涌入目的氨基酸合成途径。

然而，旁支代谢途径的截流可能会抑制某些营养物质的合成，影响菌株的生长，进而影响菌株产目的氨基酸的能力。为维持菌株的正常生长，需要给缺陷型菌株补充相应的营养物质，这可能更有利于终产物的积累。Yao等^[29]通过敲除C. glutamicum的dtsR基因(编码乙酰-CoA羧化酶，参与脂肪酸的合成)，阻断了脂肪酸合成途径，积累了大量的乙酰-CoA，为谷氨酸合成提供大量的前体物质，使其谷氨酸产量达11.49g/L，比亲本提高了18.5%；但重组菌株的生长较亲本有所降低。作者发现ΔdtsR菌株为脂肪酸营养缺陷型菌株，在培养基中添加5mg/mL吐温-80后，结果显示不仅菌株生长恢复且产谷氨酸能力得到进一步提高，达到了14.67g/L。因此，实施旁支支路截流的代谢改造策略会使细胞成为营养缺陷型菌株，影响菌株生长；而通过外添加合适浓度的缺陷营养不仅能使细胞的生长恢复，而且可能能激发菌株产目的氨基酸的最大潜能。 2.3 氨基酸转运的加强

菌株经过一系列代谢工程改造后，氨基酸在胞内过量积累会抑制细胞的生长。为解除胞内过量氨基酸对细胞的毒性，细胞本身会通过改变细胞膜的通透性或者凭借相应的氨基酸转运蛋白，把胞内的氨基酸转运至胞外。因此，Petra等^[30]通过pECT18mob2thrE表达载体上调C. glutamicum的thrE基因表达量，增加ThrE转运蛋白的转运能力，促进细胞分泌苏氨酸，使苏氨酸产量达到了14.69g/L，较原始菌株提高了49%。同样，Xu等^[31]通过pJCtac穿梭质粒同时在菌株内表达了大肠杆菌的ArgO和本体的LysE两个精氨酸转运蛋白，发现该菌株的产精氨酸量较原始菌株提高了13.6%。因此，在C. glutamicum发酵生产氨基酸的过程中，如何将胞内氨基酸快捷地转运到胞外是提高目的氨基酸产率的关键之一。 2.4 能量因子和辅助因子的供给

细胞在氨基酸的转运及合成中，均涉及到能量因子的需求和辅助因子的利用，包括ATP、NADPH和NADH等。这些辅助因子在提高目的氨基酸产量上扮演着重要的角色，如在赖氨酸合成途径中，asd、dapB和ddh等基因编码的酶的催化反应都涉及到NADPH的利用。因此，增加能量因子和辅助因子的补给是有必要的。NADPH的补给主要来源于代谢途径中的脱氢酶催化产生，主要包括磷酸戊糖途径中相关的脱氢酶，如6-磷酸葡萄糖脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶等。Shi等^[32]对C. glutamicum ssp. Lactofermentum JHI3-156菌株zwf(编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶)和ppnk(编码ATP-NAD⁺激酶，转换NAD⁺为NADP⁺)基因过量表达，结果显示zwf和ppnk同时过表达的菌株合成NADPH的能力及L-异亮氨酸产量较对照菌株都获得了提高，其中L-异亮氨酸较原始菌株提升了85.9%。因此通过对这类酶的编码基因的高表达，增加细胞内NADPH的供给，以满足代谢途径中相关催化酶对辅助因子需求，最终能达到提高氨基酸的产率的目的。 3 展 望

近几年的研究结果表明，代谢工程在产氨基酸菌分子选育中应用越来越广泛。同时，产氨基酸菌的全基因组测序的完成以及基因组尺度代谢网络模型的构建能有效地了解基因与表型的相关性，从而为代谢工程改造提供修饰靶点，以最大限度地选育氨基酸高产菌提供了可能。可以相信，随着系统生物学分析手段的进一步发展及大量试验数据的积累，多尺度多层次的系统生物学方法应用于代谢工程，将为微生物高产氨基酸菌种的选育及明确阐明表型或代谢途径得到优化的分子机制提供极佳的工具，从而进一步促进氨基酸生物生产的发展。