透明质酸(hyaluronic acid，HA)，又名玻璃酸、玻尿酸，是一种广泛分布于人体和动物体内的线性大分子酸性黏多糖。1934年，美国哥伦比亚大学的Meyer教授从牛眼玻璃体中分离出透明质酸，之后Kendell等在1937 年从发酵液中提取得到透明质酸。经过多年研究，人们对透明质酸的结构、性质、功能已经有了明确认识，其在美容、保健品、临床、药品等领域都有较多应用。 1 透明质酸的分布

透明质酸在自然界中分布广泛，在体内，超过50％的透明质酸存在于皮肤、肺和肠。除此之外，在关节滑液、软骨、脐带、血管壁等组织间质中也有存在。早期研究中，透明质酸的主要来源为脐带。目前，透明质酸产品可以从动物组织，如鸡冠、眼玻璃体、脑软骨、关节液中提取，也可以由细菌，如链球菌、绿脓杆菌等发酵^[1]。发酵法生产透明质酸因成本低、原料丰富、易规模化生产、所得透明质酸的分子质量高，正逐渐取代组织提取法。近年来，国内外对透明质酸的最新研究也集中在对发酵工艺的优化以及透明质酸的衍生、降解。但目前国内发酵技术不成熟，故组织提取仍然有无法替代的作用。同时，人们也极力寻找从其他生物体中提取透明质酸。我国海洋资源数量大、廉价、易得，而鱼眼又是渔业发展过程的废弃物，如果废弃不仅浪费资源，且易形成水体富营养化，危害生态环境。但以此作为原料提取透明质酸，不仅起到废物利用、综合开发的效果，而且可降低成本，满足经济需求。 2 透明质酸的结构和性质 2.1 透明质酸的结构

透明质酸是目前所知唯一不含硫的黏多糖，是双糖单位重复排列形成的线性高分子直链多糖聚合物，每个双糖单位中D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺间由β-1，3糖苷键相连，双糖单位间则由β-1，4糖苷键相连。分子中两种单糖按1∶1的摩尔比组成^[2]。不同组织来源透明质酸的结构一致，但是糖链的长度及分子质量不同，相对分子质量一般为10⁵～10⁷，双糖单位数为300～1 100对^[3]。 2.2 透明质酸的性质

透明质酸一般是白色的无定型固体，无色无味，有强吸湿性，极易溶于水，不溶于有机溶剂。透明质酸在空间上形成200nm的刚性螺旋柱形，柱的内侧由于羟基产生强烈亲水性；同时，由于羟基的连续定向排列，在透明质酸分子链上形成高度憎水区^[4]。所以即使在浓度很低时，透明质酸也可形成三维蜂窝网状结构。透明质酸吸水能力非常强，水溶液的渗透压和黏弹性较好，亲和吸附的水分约为本身质量的1 000倍，所以它是公认的天然保湿因子^[5,6]。 3 透明质酸的制备

透明质酸的制备主要有组织提取法和发酵法。发酵法不受来源的限制，产量高、成本低，易于形成规模化工业生产，无动物来源的致病病毒污染的危险，因此逐渐成为研究的热点。但是发酵法受高设备要求、前期高投入、发酵液体积大，并含有大量菌体及其代谢物等条件的限制，分离透明质酸时的处理量和复杂程度均高于组织提取法。 3.1 组织提取法 3.1.1 陆生动物原料

组织提取法最常用的原料是鸡冠，通常直接将其绞碎之后用丙酮或乙醇处理，再用无菌水直接或加热提取即可。Dong Young Kang^[7]将冷冻鸡冠剪碎后反复多次丙酮沉淀，干燥后得到80g鸡冠干粉，并从中提取出500mg透明质酸，最终得率为0.6%。汪建等^[8]将鸡冠绞碎后选用国产粗胰酶酶解提取，并用120目滤布加硅藻土在60℃过滤，同时研究了二次酶解对透明质酸纯度及分子质量的影响，最终鸡冠透明质酸得率为0.4%～0.6%。

眼玻璃体是透明质酸的另一大来源，早期主要是以牛、羊等陆地生物的眼球为主要原料。郭育涛等^[9]以牛眼玻璃体为原料，剥除外皮，去除晶状体，获得玻璃体液。经过一系列分离纯化处理后，最终透明质酸回收率为79.5%。 3.1.2 海洋生物资源

陆生生物组织提取的透明质酸常含有一些病原菌，给产品带来安全问题。因此，目前的研究热点是利用相对安全的水生生物作为原料，其中应用最广的是鱼眼。鱼眼数量大、廉价易得，是渔业发展过程的废弃物，如果废弃不仅浪费资源，而且易造成水体富营养化，危害生态环境。因此，以鱼眼作为原料提取透明质酸，不仅起到了废物利用、综合开发的效果，而且降低了透明质酸的提取成本^[10]。秦乾安等^[11]将鱿鱼眼解冻剥出玻璃体后，投入丙酮中脱脂24h，干燥、粉碎，然后用0.2mol/L氯化钠溶液提取。经中性蛋白酶酶解后，最终透明质酸得率达85.7%、蛋白质去除率达91.1%。姚美琴等^[12]在制得鱿鱼眼透明质酸粗提液后，考察了Sevage法、等电点沉淀法、三氯乙酸法去除蛋白质的效果，所得脱蛋白质液中以等电点法所含蛋白质量最少，最终产品中蛋白质含量为3.06%、透明质酸总得率为2.96%。Amagai等^[13]对金枪鱼眼透明质酸提取液反复CPC沉淀-溶解，然后用含10%乙酸钾的95%乙醇溶液进行醇沉处理，得到了高纯度的透明质酸。Muradoa等^[14]采用超滤、透析等方法对箭鱼透明质酸提取液进行处理，获得了分子质量为2 000kDa、纯度为99.4%的透明质酸。卢佳芳^[15]则用DEAE-Sephadex A-25柱层析分离纯化鱿鱼眼透明质酸，用蒸馏水和0.95mol/L氯化钠溶液进行分步洗脱，得到两个透明质酸组分，分别占上样量5.22%和82.37%。

除了鱼眼，其他水生生物中也含有丰富的透明质酸。孙智华等^[16]研究利用泥鳅黏液提取透明质酸，结果表明，提取物中含己糖醛酸和氨基己糖，经红外光谱分析，该提取物与透明质酸标准品扫描图谱完全一致。Nicola等^[17]首次从软体动物双壳类紫贻贝中获得透明质酸，通过脱脂、酶解、阴离子交换树脂等处理后，透明质酸纯度达97%。Giji^[18]利用黄貂鱼肝提取得到分子质量为1 365kDa的透明质酸，分析结果表明其纯度高、抗氧化活性好。近年来，随着透明质酸市场需求增大，利用水生生物生产透明质酸逐渐成为合理开发海洋资源的重要课题。

除了鸡冠、鱼眼、泥鳅之外，也有人从猪皮、林蛙皮、鸡蛋壳膜^[19,20]中提取得到了透明质酸。 3.2 改性透明质酸制备

无论是组织提取法还是微生物发酵法得到的透明质酸均有稳定性差、对透明质酸酶及自由基敏感、易降解、在体内保留时间短、在水体系中缺乏力学强度等缺点，大大限制了应用，因此有必要对其进行改性，以提高其力学强度和抗降解性能^[21]。 3.2.1 交联透明质酸

透明质酸的交联是指透明质酸与带有相关官能团的交联剂发生分子间交联反应，或以交联剂为催化剂，发生分子内交联反应，得到不同交联度的分子网状结构，从而使透明质酸分子链增长、平均分子质量增大、黏弹性增强、水溶性相对减弱、机械强度提高^[22,23]。常用的交联方法有酰肼交联、二硫化物交联、聚乙二醇交联、醛交联、碳二亚胺交联等。

(1)酰肼交联：酰肼化合物作为交联剂，能使可流动的凝胶改性为脆性和机械硬度更大的凝胶，其中最常用的交联剂是己二酸二酰肼(ADH)，大量己二酸二酰肼存在时，透明质酸可生成稳定的HA-ADH衍生物。徐新等^[24]利用ADH作为交联剂，化学修饰透明质酸分子，制备了HA-ADH凝胶薄膜。交联后的薄膜在缓冲液中明显溶胀，溶解性比交联前降低，稳定性提高。

(2)碳二亚胺交联：碳二亚胺(EDC)可在酸性溶液中与透明质酸的羧基反应，先生成N-酰基脲化合物，再与不同的碳二亚胺加合，形成稳定性好、刚性强、生物密度大、抗透明质酸酶解能力高的交联衍生物^[25]。Lai等^[26]研究了EDC交联的透明质酸凝胶在鼠眼前房中的生物相容性，结果表明，与戊二醛交联的膜相比，这种凝胶膜的眼部生物相容性更好，且抗拉伸能力更高。

(3)砜交联：在室温下二乙烯基砜(DVS)与透明质酸的羟基快速交联，得到不同性质的凝胶。通过控制透明质酸的浓度、分子质量、HA/DVS值及反应介质pH可以改变凝胶的交联度。王艳果等^[27]在室温下经DVS交联得到DVS-HA 凝胶，并采用乙醇沉淀法除去残留的DVS，最后制成交联透明质酸干粉。

(4)光交联：光交联具有反应快、 重复性好、无毒性溶剂等优点，非常适合应用于透明质酸水凝胶的制备。罗春红等^[28]采用甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA) 对透明质酸进行化学改性，然后在辐射下交联成水凝胶，结果表明，通过增加透明质酸的GMA 取代度可提高水凝胶的交联密度，从而使凝胶孔径变小、力学性能提高、降解速率减慢。进一步的研究中，罗春红构建了一种自增强的双交联透明质酸水凝胶。首先用反相微乳聚合法制备不同交联密度的透明质酸微球(一次交联)，经甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)改性后引入反应功能双键，然后以GMA 改性的透明质酸分子链为基体相，改性后微球为增强相，在紫外辐射下二次交联，形成具有双交联结构的自增强透明质酸水凝胶。这种水凝胶提高了透明质酸力学强度，并延长了对蛋白质的持续释放时间^[29]。 3.2.2 非交联透明质酸

(1)酯化改性：透明质酸的酯化改性包括羟基改性和羧基改性，即透明质酸结构中的羟基与酸或酸酐类物质发生酯化反应，或羧基与醇、 酚、 环氧类物质或卤代烃反应，形成酯化衍生物。Vazquez等^[30]将透明质酸钠在阳离子交换树脂中渗透成酸，加入四丁基氢氧化铵至中性，冷冻干燥后取透明质酸，溶于无水二甲基亚砜(DMSO)，加入对氯甲基苯乙烯，反应得到酯类化合物HA-VB。该化合物可进一步在紫外线的作用下发生交联反应。

(2)接枝改性：透明质酸的接枝反应是将小分子物质或聚合物接枝到透明质酸的主链上。Oldinski等^[31,32]将透明质酸与高密度聚乙烯(HDPE) 接枝共聚，制备出一种可应用于骨组织修复中的生物材料。Palumbo等^[33]先制备低分子质量透明质酸的四丁基铵盐(HA-TBA)，然后在二甲基亚砜中与经NHS活化的聚乳酸(PLA-NHS)反应，得到接枝共聚物HA-PLA。

(3)疏水改性：透明质酸亲水性强，常以钠盐形式存在，在多数有机溶剂中难溶，因此许多疏水性物质对其进行改性或结合难度较大。Pravata等^[34]通过十六烷基溴化铵(CTA-Br)改性透明质酸钠，得到疏水性强的CTA-HA，然后在二甲基亚砜中将酰氯基封端的聚乳酸(COL-OLA)接枝到CTA-HA上，得到可降解的衍生物 CTA-HAOLA，此衍生物能进一步在水溶液中进行自组装形成水凝胶。 4 透明质酸的应用

众所周知，透明质酸由于其独特的理化性质，在化妆品、眼科、关节手术等方面已有广泛的应用。值得注意的是，透明质酸的作用与分子质量有密切的关系，使用目的不同，所选用的分子质量也不相同。高分子质量的透明质酸保湿、润滑效果较好，多用于眼科或关节手术；中等分子质量的透明质酸药物缓释作用好，常在化妆品、手术后防粘连中应用；而小分子质量的透明质酸有抗肿瘤、免疫调节、促进血管生成等作用^[35]。 4.1 高分子质量透明质酸的(HMWHA)的应用 4.1.1 治疗关节疾病

透明质酸是构成关节软骨和关节滑液的主要成分，当发生骨关节炎、类风湿关节炎、其他感染性和非感染性关节炎时，滑液中透明质酸的浓度和分子质量降低，软骨被降解、破坏，导致关节生理功能障碍^[36]。因此，在治疗关节疾病时，可以补充透明质酸来恢复滑液的润滑功能，促进关节修复，且高分子质量的透明质酸效果优于低分子质量的透明质酸。

冀晓明^[37]认为，以1%的外源性高分子质量透明质酸制剂，定期做关节内腔注射，不但可提高关节内腔透明质酸的含量，而且能够作为关节滑液，保护关节软骨，避免磨损，减缓其退变。傅利峰^[38]对比了相对分子质量为6×10⁶～7×10⁶的透明质酸制剂Synvisc(欣维可)和相对分子质量为5×10⁵～7×10⁵的透明质酸制剂Hyalgan(海尔根)对兔膝骨关节炎的疗效，结果表明，Synvisc(欣维可)治疗组膝关节软骨损伤程度低于Hyalgan(海尔根)治疗组，其保护作用更强，治疗效果更好。 4.1.2 眼科中的应用

随着分子质量的不同，透明质酸形成的网状结构也不相同。与低分子质量的透明质酸相比，高分子质量的透明质酸形成的网状结构更完整，故其黏弹性更高，亲水能力和润滑作用更好，可以稳定泪膜、防止角膜干燥、减轻眼组织摩擦，缓解干眼症。它与纤粘连结蛋白结合后，可以促进角膜上皮细胞连结及伸延，加快角膜创伤愈合^[39]。

除此之外，高分子质量的透明质酸还可预防术后粘连^[40,41]、具有药物缓释作用^[42]等。 4.2 低分子质量透明质酸(LMWHA)的应用

目前，透明质酸及其衍生物作为药物传递系统是研究的一个热点，这是基于透明质酸可以和细胞表面的某些特异性受体结合，因此将其用作药物载体可以提高药物的靶向性，同时延长药物在体内的作用时间，提高生物利用度，提高疗效。相较于高分子质量透明质酸，低分子质量透明质酸具有黏度小、可抗肿瘤、激活免疫细胞等特性，故常用来作为药物载体。 4.2.1 透明质酸纳米粒

Choi等^[43]利用透明质酸制成纳米粒，当携带肿瘤的小鼠全身给药后，透明质酸纳米粒可在血液中循环2天并选择性聚集于肿瘤部位。除此之外，还可将透明质酸纳米粒经疏水性修饰，或制成新型共聚物、接枝衍生物等，改变粒径及载药量，提高靶向性。研究显示^[44]，透明质酸纳米粒在全身给药后，一般先聚集在肝脏部位，而聚乙二醇化透明质酸纳米粒则有效减少了这种现象，同时，其在血液中的循环时间明显增加，而且它在肿瘤部位的积累效果是未修饰透明质酸纳米粒的1.6倍。 4.2.2 透明质酸修饰脂质载体

脂质体是药物传递系统中应用十分广泛的一种载体，它具有缓释性、靶向性、生物相容性。若连接上透明质酸等糖类化合物可使其更有效地到达靶点，但是所连接的透明质酸必须是低分子质量的透明质酸及其寡糖，因为高分子质量的透明质酸黏度较高，影响药物的流变学特性^[45]。

杨晓燕^[46]制备了紫杉醇纳米脂质载体(PTX-NLC)，然后采用电荷吸附法分别使相对分子质量为30万和100万的透明质酸吸附在PTX-NLC表面，获得主动靶向透明质酸修饰紫杉醇纳米脂质载体(HA-NLC)。结果显示，使用分子质量相对较低的透明质酸可制得性质更稳定的载体。考察体内药效学及药动学后发现，与紫杉醇注射液泰素相比，HA-NLC体内抑瘤效果更好，且延长了药物在体内的循环时间，降低了心肾毒性。同时，HA-NLC在瘤内的总靶向效率提升约1.4倍，具有明显的肿瘤主动靶向性。张文强^[47]先对大分子透明质酸进行降解，获得了相对分子质量为15万~20万的透明质酸，再利用反相蒸发法制备透明质酸脂质体，考察了它的渗透性能，为透明质酸以脂质体作为载体用于化妆品提供了理论依据。 4.2.3 透明质酸与药物偶联

将透明质酸的羧基、氨基和还原性末端经酰胺化、酯化后与抗肿瘤药物偶联，形成药物偶连体，可延长前药在体内的滞留时间，增强药物的水溶性和肿瘤靶向性。忻鼎垂^[48]设计的以低分子质量透明质酸为载体的新型抗癌药物紫杉醇前药体系，将亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸作为连接臂，与药物分子结合，再与分子质量为9 800Da的透明质酸连接，使原药分子质量有较大的增长，从而使水溶性受到较大的影响，紫杉醇的溶解性增加，细胞杀伤效果好，IC₅₀值低于原药紫杉醇2~3倍。Galer等^[49]在颈部鳞状细胞癌(SCCHN)小鼠肿瘤模型中使用透明质酸-紫杉醇偶联物，与单纯紫杉醇注射液相比，有效抑制了肿瘤生长，小鼠存活率提高。丁宝月等^[50]用透明质酸(MW=150 000)修饰多柔比星(DOX)与聚酰胺-胺键合物，制成载药树状聚合物纳米载体给药系统，与多柔比星溶液相比，此系统可明显增加药物细胞内摄取，同时促进多柔比星进入其作用靶点细胞核，进一步提高疗效。 4.2.4 透明质酸纳米凝胶

纳米凝胶通常是指由化学或物理交联的聚合物网络组成的水凝胶颗粒，由于负载力和稳定性较高，因此可作为一种新型药物载体。丁洁英^[51]在制备巯基化透明质酸-聚乙烯醇多层水凝胶膜载体时研究了透明质酸分子质量对巯基化修饰透明质酸的影响。结果表明，随着分子质量的增加，连接至透明质酸链的总巯基基团和二硫键含量降低，这可能是由于透明质酸分子量越大，分子链越长，游离巯基更难形成二硫键。Duceppe等^[52]采用超低分子质量的壳聚糖与透明质酸制成新型纳米凝胶。在壳聚糖分子质量为5kDa、透明质酸分子质量为64kDa，以4∶1混合时，可得到最小平均粒径为146nm的凝胶。进一步的研究发现，包裹DNA的壳聚糖-透明质酸凝胶在相同条件下的转染率可由0.7%提高到25%。 4.2.5 透明质酸微球

李丹等^[53]采用乳化-交联法制备透明质酸钠微球，通过微球不溶性骨架，降低药物释放速率，延长释药时间，提高生物利用度。梁恒伦等^[54]则认为透明质酸作为单一药物载体具有以下不足：低分子质量透明质酸易为肝脏截留、代谢，难以达到靶点组织；高分子质量透明质酸由于失去受体介导胞吞的能力，无主动靶向性。因此，梁恒伦等^[54]采用低分子质量透明质酸钠偶联壳聚糖制备了一种平均粒径为228nm的透明质酸-壳聚糖偶联微球(DTX-HACTNPs)，希望既能保留药物透明质酸的主动靶向性，又能克服其他不足。MTT法检测表明，透明质酸偶联药物微球可降低非选择性细胞毒性，并通过主动靶向性保持药物良好的抗肿瘤活性。同样，周庞虎等^[55]通过体外实验证明，透明质酸-壳聚糖微球能明显抑制体外骨关节炎软骨细胞诱导型一氧化氮合成酶的活性，避免生成过量NO，从而抑制关节软骨的破坏，保护软骨细胞。 4.2.6 透明质酸纳米乳

纳米微乳粒径小、透皮性高、载药量大，是经皮给药的良好载体。高媛媛等^[56]以分子质量为10~110K的透明质酸为载体，利用微乳法制备的包载10,11- 亚甲二氧基喜树碱(MD-CPT)的透明质酸纳米载体(HA-GMS)，与MD-CPT的乙醇溶液相比，透皮效率明显增大，提高了药效。Kong等^[57]先将透明质酸进行改性后，制备了O/W/S纳米乳，其中二氯甲烷为油相，HA-GMA为水相，吐温-80和司盘-20作为表面活性剂。该纳米乳蛋白质分散性低，分布均匀，最小粒径为39.7nm，是亲油性药物的良好载体。 4.2.7 其他应用

张进祥等^[58]的研究发现，将HMW-HA降解后的小分子透明质酸可以激活肝脏中的主要免疫细胞——枯否细胞，促进分泌促炎因子，引发炎症反应，而高分子透明质酸不具备此功能。低分子质量透明质酸还可作为内源性危险信号分子，有效地增强灭活HAV抗原的体液免疫应答，因此还可将其作为免疫佐剂使用^[59]。 5 透明质酸市场

药用透明质酸方面，膝关节骨性关节炎等疾病患者人数在2000~2010年增加了400万，使透明质酸作为黏弹性补充剂的需求迅猛增长。在加拿大，其仅2012年在骨科市场的费用就高达1 300万美元。在日本，膝关节治疗用透明质酸的市场价值在500万美元以上，而且有越来越多新的治疗方案上的需求。由于全球人口老龄化的加速及对透明质酸在医药方面研究的深入，透明质酸作为非甾体抗炎类药物等也将有助于拓展透明质酸医药市场^[60]。

透明质酸在美容业的应用也是一大热点，据报道，2009年其在真皮填充剂方面的应用已达7.59亿美元。目前，市场上已有的100多种皮肤填充剂中，一半以上都含有透明质酸。2010年美国整形美容行业治疗费用为106.77亿美元，其中注射美容治疗费用超过17%，2011年超过20%，目前仍在稳步上升。2011年，全美国统计非手术软组织填充剂产品使用分布中，透明质酸占68.9%，全球销售额高达15亿美元。

在国内，透明质酸作为骨科关节腔黏弹补充剂及眼科黏弹剂具有巨大的市场潜力。据SFDA数据统计，2005~2010 年，我国骨科关节腔黏弹补充剂市场规模由2.05亿元增长至8.93亿元，复合增长率达34.22%，预计2013~2016年，骨科用注射透明质酸的年符合增长率为27.44%，眼科黏弹剂市场规模预测2016 年将达约25.50亿元，年复合增长率将达27.91%。 6 总 结

随着生活水平提高，健康对人们越来越重要，我国的透明质酸市场开发潜力不断增大。我国海岸线长，海洋资源丰富，每年在生产加工过程中产生大量废弃物，不但浪费资源，而且对环境造成很大压力。利用廉价、易得的海洋资源提取透明质酸，不仅生产成本低，同时减轻加工废料对环境的影响，为开发高附加值产品开辟了道路。