环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase，EC 2.4.1 .19 )是α-淀粉酶家族的重要成员，能催化环化、耦合、歧化和水解这四种反应^[1]。环化反应生产环糊精是其特征反应，CGTase催化淀粉的α-糖苷键断裂，供体的一部分被分离出来作为受体形成CD。耦合反应是环化反应的逆反应，CD环的α-糖苷键断裂，得到的低聚麦芽糖转移到受体底物上。歧化反应是直链低聚麦芽糖的一个α-糖苷键断链，然后把它的一部分转移到受体底物上。水解反应是水分子作为受体，催化底物水解，形成低聚糖。在CGTase的四种反应中，环化、耦合、歧化是转糖基作用，活性较高；水解作用的活性通常较低，并且控制CGTase的水解活性将有利于环糊精的生产，工业生产中主要是利用CGTase的转糖基作用。

环糊精因其独特的理化性质不仅用于食品行业，在医药、化妆品、环境保护等诸多领域也有着非常广泛的应用，其工业化生产将具有重要意义。目前，世界上生产CD的国家主要有匈牙利的Cyclolab、法国的Csestar、德国的Wacker Biochem以及日本的Ensuiko Suger，但是由于工业化制备环糊精的过程影响因素众多并且难以把握，在其工业生产中仍存在很大问题，例如原料转化率一般在50%~60%、CGTase热稳定性差、糖基供体价格昂贵、筛选的CGTase产生菌酶活一般低于50 U/ml等。随着对其作用机制、分子结构及3D结构的研究深入，人们已经发现50多个不同CGTase晶体结构，为分离获取具备特殊性质从而更好地满足工业生产的CGTase菌株提供基础^[2]。研究人员对CGTase的研究集中在筛选高效、高专一性的CGTase，在此基础上进行分子改造、异源表达、固定化等，期望得到更适于工业应用的优势酶。本文介绍了新发现的CGTase及新性状和新用途，对CGTase基因高效表达与分子工程策略等相关研究进展进行综述，并结合现有资源与技术指出当前研究的不足，对CGTase未来的研究指出方向。 1 新CGTase的性质和应用 1.1 新CGTase的性质

自然界中产CGTase的微生物主要为Bacillus、Paenibacillus、Klebsiella、Thermoanaerobacterium、Thermoanaerobacter等^[3]。不同来源的CGTase，由于宿主的蛋白质合成、修饰和转运过程各自不同，其性质差别很大。已发现的CGTase仍不能达到工业化生产的条件，人们仍需努力探索，筛选出性状新和特性优的CGTase。最近研究人员利用基因改造和异源表达策略发现新CGTase基因序列及它们表现出的一些新性质。Lee等^[4]在Pyrococcus furiosus中发现新CGTase基因序列，然后把该基因转入Escherichia coli表达，得到热稳定性高的CGTase(最适温度：90℃)；Go等^[5]从Alkalophilic Bacillus sp. BL-31分离得到的新β-CGTase，具有专一性强的分子间类黄酮转糖基作用；Atanasov等^[6]、Kitayska等^[7]从Bacillus pseudalcaliphilus 8SB分离得到一种新CGTase,可高收率转化淀粉为β-CD和γ-CD^[6,7]。 1.2 CGTase的应用

CGTase作为一种生物催化剂，不只生产α，β，γ-CD，在其他领域也有应用。Jemli等^[8]报道在面包烘焙前加入CGTase不仅能显著增加成品面包的体积，而且减轻面包在贮藏过程中的硬化。另外，CGTase也可用于食品添加剂和功能性成分的改性。早在上世纪90年代，人们就利用了CGTase耦合与歧化活性，将葡萄糖基连接至橘皮苷上。自此，CGTase的转糖基活性的研究越来越多。利用CGTase转糖基的活性得到葡萄糖基，不仅去除了本身的涩味，其溶解性也增加，现已成为一种成功的商品甜味剂。另外芦丁经CGTase糖基化后得到的芦丁衍生物葡萄糖基芦丁，水溶性和稳定性都得到提高^[9]。近年来，人们还利用CGTase成功地合成了表面活性较强且无毒副作用的烷基糖苷，它是一种性能优良、可生物降解的洗涤剂，若能工业化生产，在一定程度上能够缓解环境污染问题，必定会有巨大的应用潜力。另外，利用CGTase的水解活性处理淀粉会产生特殊的极限糊精，该物质能改善纸张的表面上胶与涂层性能，已应用于工业化。 2 基因改造改善CGTase的性质

自首次成功获得Bacillus macerans中的CGTase基因片段以来，已有30多个CGTase基因片段得到证实，同时蛋白质工程的发展给分子生物学的研究指出新的方向。目前，工业生产环糊精遇到的最主要困难是原料利用率低，要解决这个问题要从两个方面考虑，一是从自然中筛选高转化率的CGTase，但是该方法所需时间久，效率较低。另一个方法就是改造已有的CGTase基因，人工选育出能高效转化原料的酶。此外，利用基因改造也可以改善CGTase的其他特性，例如热稳定性、水解活性等。 2.1 定点突变改善CGTase性质

在对CGTase进行详细结构分析的基础上，通过定点突变的方法获取强专一性、稳定性和水解活性高的CGTase。通常会先分析底物-酶结合物的晶体结构，找出关键作用位点，再利用基因改造的方法替换关键位点的氨基酸，再分析相应产物的变化，筛选出优势突变体。所选的突变对象主要是在保守性较差的亚位点处，如活性区域-3亚位点(47位赖氨酸残基)，-7亚位点(146～152位氨基酸残基)以及环化中心位点(195位酪氨酸残基)等。迄今为止，定点改造CGTase基因已经得到了一些优势突变酶，但是这些酶仍不能都应用于工业化生产中，对其改造工作仍需进一步研究。 2.2 定点突变提高CGTase产物特异性

CGTase催化淀粉生成环糊精，多以α-、β-、γ-CD三种混合物的形式存在，对CD的产率和后提取工艺皆造成不利影响。因此，对CGTase基因进行改造，提高催化产物的专一性对其工业化生产至关重要。Li等^[10]用Arg、Pro、Thr、Ser和Gly取代B. circulans STB01 CGTase钙结合位点I(CaI)附近的Ala31，得到的A31R、A31P和A31T 三种突变体产β-CD特异性增加。尤其是突变体A31R，β-CD的产量增加了26%。另外将CGTase195位Tyr进行突变得Y1951，在大肠杆菌BL21中异源表达，和野生酶相比，突变酶Y1951的催化产物中，α-CD的含量由68%降为30%，β-CD由22.2%提高为33.3%，而γ-CD含量提高了4倍由8.9%提高为36.7%，达1.1g/L，并且发现，突变酶Y1951比野生酶具有更好的pH稳定性,具有生产制备γ-CD的潜力^[11]。一系列的研究表明钙结合位点I(CaI)、环化中心、-3亚位点、-7亚位点等活性较高的位点的突变更有可能得到产物特异性高并符合工业生产的优势菌。 2.3 定点突变提高CGTase底物特异性

V_C不稳定，易丧失生理活性。人们利用CGTase的转糖基作用，将葡萄糖基转接于L-抗坏血酸的C₂上，得到稳定的V_C衍生物2-O-葡萄糖基-L -抗坏血酸(AA-2G)，在体内可发挥V_C的多种生理功能，但常用的糖基供体α-CD价格昂贵、β-CD溶解性不好，限制了AA-2G的生产。因此，人们需要找到AA-2G合成中价格低廉的糖基供体代替α-CD和β-CD。Yamamoto等^[12]研究发现，对CGTase赖氨酸47突变处理，得到突变型K47F(Lys-Phe)、K47P(Lys-Pro)、K47Y((Lys-Tyr)，它们利用麦芽糖糊精生产AA-2G的产率较野生型分别提高了17.1%、32.9%、21.1%，优化转化条件后，K47P产AA-2G最高达1.12 g/L，是野生型CGTase的1.32倍(0.85 g/L)。另外，许乔艳等^[13]对Paenibacillus macerans CGTase的+1亚位点附近的氨基酸残基进行定点饱和突变得到3个优势突变体L194N(Leu→Asp)、A230D(Gla→Asp)、H233E(His→Glu)，既提高了其对麦芽糊精的底物特异性，又提高合成AA-2G的效率。研究发现突变体底物特异性的改善可能与CGTase第194位、230位和233位的氨基酸残基的亲水性及与底物分子间的作用力的改变有关。 2.4 定点突变提高CGTase水解活性

尽管CGTase是α-淀粉酶的一种，但其水解活性较其环化活性低得多。Veen等^[14]发现CGTase中Phe(183、259)的疏水作用限制该酶的水解活性，通过改变某些残基的极性得到的CGTase突变型F183S、F183N、F259N、和F259S，它们的水解活性增加，转糖基活性降低。特别是一些像F183S/F259N的双突变体，水解活性是环化活性的15倍。由B.stearothermophilus ET1 所获得的CGTase突变菌株 A230v，酶的水解活性比野生型菌株提高了90倍。未来我们可以利用筛选出的这些高水解活性的菌株，代替一些水解酶，发挥特定的水解作用。 2.5 定点突变提高CGTase的热稳定性

工业生产环糊精是在50～60℃温度下进行的，因此在这个过程中要求使用的CGTase在50℃仍具有良好的稳定性。酶的热稳定性取决于氨基酸组成、外部的金属离子、辅助因子等因素^[15]。增加工业用酶的热稳定性可以从以下几方面实现:使用更加耐热酶取代，诱变筛选嗜热菌，化学改性、基因改造或固定化改造现有的酶，或使用聚羟基化合物^[16]。有研究表明，从Thermococcus sp.中获取的CGTase热稳定性高，根据相应的基因片段，研究者对Bacillus circulans 25l 来源的CGTase基因进行目的性改造后，酶的热稳定性显著提高，这可能与酶的B 区域表面形成新盐桥有关^[17]。此外，Li等^[18]联合使用聚乙二醇1000与纳米二氧化硅溶胶来提高β-CGTase的稳定性。分析发现二氧化硅溶胶有助于加强聚乙二醇1000保护β-CGTase的二级和三级结构的能力，为提高CGTase和相关酶的热稳定性提供了一种有效的方法。 3 CGTase异源表达

在遗传工程方法选育菌种方面，基因高表达是筛选菌种的一个重要标准，基因高表达的关键之一是选择最佳的宿主。随着对CGTase研究加深，对CGTase需求量加大，迫切需要CGTase基因高表达。Wang等^[19]把cgt整合到质粒PYD1上，然后把该质粒转入到Saccharomyces cerevisiae，发现该基因可稳定高表达，得CDs、葡萄糖、麦芽糖。 3.1 异源表达结合基因改造改善CGTase的特性

早在1989，人们已经发现由重组体E. coli和重组体B. subtilis培养得到的CGTase的收率分别是野生型菌株的20和300倍。不同来源的CGTase，由于宿主的蛋白质合成、修饰和转运过程各自不同，其性质差别很大。研究人员利用这个特点把同一CGTase基因序列在不同微生物中表达，观察得到的CGTase特性。除了发现一些CGTase的表达率和分泌率提高外，CGTase的特性也得到改善。Ayadi等^[20]把Bacillus stearothermophilus的淀粉酶和B. subtilis.脂肪酶的信号肽整合到Aenibacillus pabuli US132 CGTase基因上在E.coli表达，CGTase表达率提高又能分泌到胞外，一定程度上达到了工业用酶的要求。并且人们为得到更优的CGTase，已经开始从转录和翻译系统探究。Liu等^[21]研究发现经密码子优化的α-CGTase基因在E. coli BL21(DE3)表达时，胞外α-CGTase活性是野生型菌株的3.26倍。当该基因在B. megaterium表达时，其产α-CGTase的活性可达到48.9 U/ml，较亲本菌株表达量提高98倍。 3.2 异源表达改善CGTase的特性

Jeang等^[22]发现，B. macerans CGTase基因分别在E. coli和B. subtilis表达，CGTase活性和特性不同。E. coli表达出的CGTase，α-CD耦合活性相同，β-CD耦合活性提高了14倍。Charoensakdi等^[23]发现Paenibacillus sp. T16 CGTase基因在E. coli JM109表达，得到的CGTase可承受pH的范围增大，耐热性提高，动力学参数K_m减小。并且有人发现同时使用淀粉异构酶和α-CGTase，经优化培养，CD的产量可达84.6%(w/w)。 3.3 优化培养条件改善CGTase的特性

Wang^[24]等从Bacillus clarkii 7364分离出γ-CGTase，发现培养基溶剂和pH、底物、培养温度、酶用量等均影响γ-CD的产量。在底物为15%(w/v)马铃薯淀粉和环十二酮条件下，γ-CD的收率达到50.4%(w/w)。若在pH7.0、50℃下同时运用突变体A223K和Thermobifida fusca.的淀粉异构酶，10 h后γ-CD产量达72.5%(w/w)，提高了22.1%。这些优化方法为γ-CD的工业化生产提供基础。Ng等^[25]运用Bacillus cereus CGTase的双水相系统(ATPS)转化萃取CDs，在7.7%(w/w)聚乙二醇(PEG)20 000和10.3%(w/w)葡萄聚糖T500体积比为4的条件下，CDs产率达到13.7 mg/ml(4.77 mg/ml α-CD，5.02 mg/ml β-CD，3.91 mg/ml γ-CD)。该结果表明，ATPS在CGTase转化萃取CD中具有巨大的应用潜力。 4 其它改造CGTase的方法

epPCR是以一定的频率向目的基因中随机引入突变，以获得蛋白质分子的随机突变体。用epPCR处理CGTase的基因，得到多种CGTase突变体，经筛选得优势突变体。该方法是基因改造的一种方法，已用于CGTase的改造^[26]。Kelly等^[27]运用epPCR 处理CGTase的基因，得到的突变株S77P和W239R，二者CGTase的环化活性不变，水解活性降低15倍。

不同微生物的CGTase同一区域的功能可能有差异，因此把不同微生物来源的CGTase各区域组合成为新的嵌合酶，该酶可能显示出不同的活性。例如，Han等^[28]把Alkalimonas amylolytica α-淀粉酶整合到P. macerans CGTase上构建两种嵌合酶，第一种CBM_Amy接到CGTase的C末端，另一种CBM_Amy取代CGTase的E区。这两种嵌合酶对可溶性淀粉利用率提高，并且未来很有可能是一种廉价且易得的AA-2G的糖基供体。

除了基因改造的方法改善CGTase特性外，也可运用物理化学的技术处理CGTase。例如，可用一些与特定氨基酸残基发生反应的试剂修饰酶，再通过产物的变化表征，判定CGTase的关键氨基酸残基，分析每个氨基酸残基对应的催化功能。此外，通过该方法可以在维持CGTase活性的情况下改变酶的晶体结构，使得它可应用于一些极端的反应环境，并得到一些新型环糊精产物。例如，Kaulpiboon等^[29]利用分子印迹的技术对分别来源于Paenibacillus sp. A11和B. macerans CGTase改造，使之具备了新γ-CGTase功能。工业上利用酶的固定化技术将CGTase固定化到一些特殊的小颗粒上，这样不仅可以重复利用酶，减少成本，并且酶的稳定性也大大提高。 5 总结和展望

近年来，随着对分子生物学研究的加深，基因改造和异源表达技术日趋成熟，并且在有些领域已经有巨大的成果。在CGTase研究中，人们得到了一些耐受性好、稳定性高的新CGTase，并且在一些微生物中CGTase的表达率、分泌率以及CGTase的原料转化率也得到很大提高，但是在一定程度上仍不能满足工业用酶的要求。面临的首要问题就是原料转化率较低，一直局限在50%~60%。近几年国内外在CGTase研究方向上也表现出一些局限性，比如研究对象主要集中在芽孢杆菌属，另外以胞外酶的研究为主，对胞内酶的研究甚少。在今后的研究中可以借鉴近几年筛选目的菌株的经验，着眼于耐碱性、耐热性、高产、专一性等有利工业应用的优势性能，发掘出更为优质的CGTase菌株。此外除了采用基因改造、异源表达技术改造CGTase外，可以采用基因组和全基因组测序的手段，对CGTase和类CGTase的蛋白进行生物信息学分析，并且有必要对系统上游和下游进行改造优化，并进行CGTase的固定化研究，提高CGTase的表达率和CGTase的原料转化率。