胃癌(gastric cancer，GC) 是我国最常见的消化道肿瘤，全国每年新发胃癌患者40万人，死亡人数达30万人，死亡率居我国恶性肿瘤的第三位^[1]。目前为止，手术、化疗、放疗仍是胃癌的主要治疗措施，但化疗药物仍存在毒副作用和耐药性的问题，大剂量使用会增大病人痛苦^[2]，因此，研究新的抗肿瘤药物对胃癌的治疗具有重要临床意义。

重楼(Rhizoma paridis)是百合科楼属植物，别名重楼金钱，草河车，七叶一枝花等，我国主要分布在云南、四川、贵州等地。现代药理研究表明，重楼具有止血止痛、抗肿瘤、抗炎抑菌、免疫调节等功能，是中成药云南白药、季德胜蛇药片、宫血宁胶囊、鼻咽清毒颗粒等的主要组成药物。重楼的水、甲醇、乙醇提取物以及重楼皂苷复合物对人肺癌A-549、肾腺癌A-496、结肠腺癌HT-29、胰腺癌PACA-2、乳腺癌MCF-7、前列腺癌PC-3 等6种人体肿瘤细胞均有显著的抑制作用^{[3, 4, 5, 6, 7]}。

本课题组前期采用MTT法追踪重楼中抗肿瘤活性成分，从重楼醇提物中分离了重楼51种活性单体(pp01-pp51)，鉴定所有单体的分子结构，发现其中23个新化合物。进一步从51种单体中筛选出其中16种抗肿瘤效果优于化疗药物顺铂的候选单体，根据分子结构和抗肿瘤活性(IC₅₀)差异，分析构效关系，并从中选定具有代表性分子结构的新化合物pp-10为候选化合物(结构式见图 1)。目前除了本课题组以鼻咽癌CNE2细胞为研究对象采用MTT法初步筛选了这些重楼单体的抗肿瘤效果外^{[8, 9]}，尚未有这些单体的进一步抗肿瘤作用及作用机制的报道。本研究旨在探讨肿瘤单体pp-10对人胃癌BGC-823细胞的增殖抑制作用，自噬和致凋亡作用及其作用机制，为pp-10用于肿瘤治疗提供实验依据。

图 1 pp-10的化学结构 Fig. 1 The chemical structure of pp-10

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重楼单体pp-10(C₃₉H₆₂O₁₂)为本课题组库存分子。BGC-823细胞由中山大学附属肿瘤医院提供，Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、Caspase 3、Caspase 9、mTOR、p-mTOR、P-P70s6k和P70s6k一抗均购自美国Cell Signaling Technology公司，MTT购自美国Sigma公司，Hoechest 33342和结晶紫购自广州威佳公司，Annexin V-FITC试剂盒购自上海罗氏生物科技有限公司。 1.2 方 法 1.2.1 细胞培养

将BGC-823细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，置37 ℃、5%CO₂ 条件下常规培养，每3天传代一次，细胞贴壁达到70%时，以0.25%胰酶消化传代。 1.2.2 MTT法检测细胞增殖

取对数生长期的BGC-823细胞，调细胞浓度5.0×10⁹/L，取150 μl接种于96孔培养板，培养24 h。加入一定浓度的pp-10，终浓度分别为0、0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L，并设细胞对照组，DMSO试剂对照组，每组设5个复孔，培养24、48、72 h后，每孔加入10 μl MTT (5 g/L)试剂，继续孵育4 h，弃上清，再加入100 μl DMSO，多功能酶标仪(Bio-Rad)测定吸收度(A₅₇₀ nm) 值，计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率 (%) = [(A对照组－A实验组) / A对照组] ×100 %，实验重复3次。 1.2.3 克隆形成抑制实验

取对数生长期的BGC-823细胞，用含10% 小牛血清的RPMI-1640培养液稀释细胞悬液，接种于12孔培养板，每孔加入300个细胞，每组设2个复孔，设DMSO对照组、pp-10组(终浓度分别为1、2、4 μmol/L)，置37℃、5% CO₂培养箱培养7d后，结晶紫染色15min，拍照。 1.2.4 Annexin V-FITC /PI双染法检测细胞凋亡

将对数生长期的细胞消化接种到6孔板中，次日加入pp-10至所需浓度(0，2，4，8 μmol/L)，同时设DMSO对照组，药物作用48 h后，消化收集细胞，用PBS洗涤细胞2次(600 r/min离心5 min) 收集，加入500 μl Binding Buffer悬浮细胞，再加入5μl Annexin V-FITC，5 μl PI，混匀，室温避光反应15 min，用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。 1.2.5 Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白及PI3K/Akt信号通路蛋白的表达

不同浓度的pp-10对BGC-823细胞作用24 h后，消化收集，冷PBS洗涤2次，加入细胞裂解液冰上裂解15 min，12 000r/min,4℃离心15min，吸取上清，BCA法测蛋白浓度。取适量蛋白，常规制胶上样，蛋白电泳，然后转膜，封闭，用一抗稀释液4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min。将膜与HRP结合的相应二抗(1∶5000) 室温下摇荡孵育2 h，TBST洗膜，化学发光显色，暗盒中曝光，再显影和定影，用扫描仪对胶片进行扫描。 1.3 统计学处理

实验结果均3次独立实验，数据采用SPSS13.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差 (x ± s) 表示，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 重楼单体pp-10对人胃癌BGC-823细胞增殖抑制作用

MTT法显示，pp-10作用于BGC-823细胞24、48、72 h，随着作用时间的增加，相同浓度的pp-10对BGC-823细胞的增殖抑制作用随着作用时间的增加而增加；在此次检测的范围内，相同作用时间下BGC-823细胞的增殖抑制率随药物浓度的增加而逐渐升高，特别是pp-10浓度在10、20 μmol/L时，其作用更明显，见图 2。

图 2 重楼活性单体pp-10对胃癌BGC823细胞的增殖抑制作用 Fig. 2 Inhibitory effect of pp-10 on the proliferation of BGC823 cell linesMean±SD,n=3

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pp-10作用于BGC-823细胞7d，与DMSO对照组相比，实验组随着pp-10浓度增加，克隆逐渐减小，且克隆数量逐渐减少，pp-10浓度为1 μmol/L时，BGC-823细胞产生明显的克隆形成抑制作用，当浓度达到4 μmol/L，几乎无克隆细胞株形成。各组的克隆形成情况见图 3。

图 3 不同浓度的pp-10对人胃癌细胞BGC823克隆形成的作用 Fig. 3 Inhibition of cell clone formation of pp-10 on BGC-823 cell linesCells incubated with different concentration of pp-10 for 7 d,cell clone were stained with crystal violet for 15 min and took picture

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pp-10作用于BGC-823细胞24 h后，细胞对照组形态完整，未见凋亡细胞。而实验组随着pp-10作用浓度的增加，凋亡细胞百分率增加，实验组细胞可见细胞核固缩、边聚和裂解等凋亡形态学变化，见图 4白色箭头标注。

图 4 荧光显微镜检测细胞凋亡形态Fig. 4 The morphological change of BGC-823 cells detected by fluorescence microscopy after Hoechst 33342 staining

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pp-10作用于BGC-823细胞24 h之后，不同浓度的pp-10作用于BGC-823细胞的凋亡见图 5。Annexin V-FITC /PI 双染流式细胞术检测显示，pp-10作用BGC823细胞 2μmol/L时，细胞的凋亡率为9.0%，；4μmol/L时细胞的凋亡率为10.1%；8μmol/L时细胞的凋亡率为21.4%；与对照组相比有显著性差异。实验提示，pp-10能够诱导BGC-823细胞凋亡，且随着PP-10浓度的增加，BGC-823细胞的凋亡率逐渐升高。

图 5 流式细胞术检测BGC-823细胞凋亡Fig. 5 Cell apoptosis analysis detected by Annexin V-FITC /PI stainingBGC-823 cells incubated with different concentration of pp-10 for 24 h. cell apoptosis was detected using flow cytometry. * P≤0.05 compared to the control; ** P≤0.01 compared to the control(DMSO)

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细胞凋亡分为3类，分别为死亡受体介导的细胞凋亡(外源性细胞凋亡)、线粒体相关的细胞凋亡(内源性细胞凋亡)，ER stress(内质网压力)介导的细胞凋亡。其中外源性细胞凋亡途径存在Caspase 8的活化，内源性细胞凋亡存在Caspase 9的活化，ER stress介导的细胞凋亡存在ER stress相关蛋白GRP78，PDI，SERCA，Chop，p-eIF-2α，Caspase 12，XBP-1，ATF4，ATF6等表达增加。3种细胞凋亡过程最终均出现效应Caspase如Caspase3的酶切活性，并导致下游蛋白PARP的酶切降解。我们发现，pp-10作用于BGC-823细胞24 h，出现了切割的Caspase 3，以及下游PARP的酶切条带，提示细胞凋亡的发生；同时Caspase 9出现酶切条带，提示此细胞凋亡过程涉及内源性细胞凋亡通路的活化，见图 6。

图 6 Western blotting 检测caspase3、caspase9、parp蛋白表达Fig. 6 The expression of cleaved-Caspase 3,Caspase 9,PARP of BGC-823 cells detected by Western blottingBGC-823 cells were incubated with different concentration of pp-10 for 24 h,the expression level of apoptotic associated proteins as Caspase 9,Caspase 3 and PARP were determined by Western blotting

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当线粒体膜电位的下降、Bcl-2抗凋亡蛋白及促凋亡蛋白的表达及活化的失衡，以致线粒体内膜通透性转换孔(permeability transition pore,PTP)开放，细胞色素C及Smac蛋白的释放，促进内源性细胞凋亡的发生。为了进一步分析pp-10 诱导线粒体相关的细胞凋亡的发生，我们检测了Bcl-2蛋白家族典型的2个蛋白，具有抗凋亡作用的Bcl-2蛋白及具有促凋亡作用的Bax蛋白的表达。Western blotting检测显示，不同浓度的pp-10作用于BGC-823细胞24 h，随着pp-10作用浓度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达逐渐下降，促凋亡蛋白Bax表达逐渐增加，提示pp-10通过改变Bcl-2、Bax蛋白表达，诱导线粒体凋亡途径的活化，见图 7。

图 7 Western blotting检测Bcl-2、Bax蛋白表达变化Fig. 7 The expression level of Bcl-2 and Bax of BGC-823 cells detected by Western blottingBGC-823 cells were incubated with different concentration of pp-10 for 24 h,the expression of Bcl-2 and Bax was detected by Western blotting

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Bcl-2蛋白家族的表达及活化是线粒体凋亡通路的上游事件，有许多信号通路影响Bcl-2蛋白家族的表达和活化，如JNK、p38、ERK、stat3、ATM/p53、PI3K/Akt、ER stress等，为此我们检测了与细胞生存/凋亡密切相关的PI3K/Akt信号通路的活化情况。当pp-10作用于BGC-823细胞24 h，随着pp-10作用浓度的增加，PI3K/Akt信号通路中，p-Akt表达下降，Akt下游p-mTor,p-P70s6k表达下降，同时我们也检测到随着药物浓度的增加Ⅱ型LC3的量增加，P62的量减少，表明PI3K/Akt信号通路受抑制并且细胞发生了自噬，见图 8。

图 8 Western blotting检测PI3K/Akt 信号通路相关蛋白和自噬相关蛋白的表达 Fig. 8 The expression level of PI3K/Akt signaling pathway(a)The expression of PI3K/Akt signaling pathway proteins such as Akt,p-Akt,mTor,p-mTor,p70s6k,p-p70s6k were determined by Western blotting (b)The expression level of LC3，P62 BGC-823 cells were incubated with different concentration of pp-10 for 24 h

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重楼是百合科重楼属植物，中药重楼《中国药典》 2010 年版收载为七叶一枝花[Paris polyphylla Smith var．chinensis (Franch.) Hara] 和云南重楼[Paris polyphylla Smith var. yunnanensis(Franch.) Hand] 的干燥根茎。现在临床上常配伍相应的药物广泛用于多种癌症如食道癌、鼻咽癌、喉癌、胃癌、肝癌、直肠癌、肺癌、脑瘤、宫颈癌、急性白血病等的治疗，均有一定疗效。在体内、外实验研究中，发现重楼的醇提物抗肿瘤作用较强。

重楼单体pp-10是我们从重楼醇提取物的一种单体成分，属于重楼皂苷类，其化学式为 C₃₉H₆₂O₁₂(结构式见图 1)。本实验的结果显示pp-10能显著抑制BGC-823细胞增殖，均存在时间依赖关系及剂量依赖关系；随着pp-10浓度的增加，pp-10对BGC-823的克隆形成的抑制作用增加，4μmol/L时几乎没有克隆的形成；本实验通过Hoechst 33342染色、Annexin V-FITC /PI 双染色实验发现，pp-10能明显诱导BGC-823细胞凋亡和自噬，且随着药物浓度的增加，BGC-823细胞的凋亡率和自噬水平逐渐升高。

多种抗肿瘤的药物正是通过引发细胞凋亡和自噬而发挥作用，细胞凋亡分为死亡受体介导的细胞凋亡、内源性细胞凋亡途径、ER stress介导的细胞凋亡。Bcl-2蛋白家族分抗凋亡蛋白家族和促凋亡蛋白家族^{[10, 11]}，在调节细胞凋亡过程中起着非常重要的作用。Bcl-2蛋白家族中，Bcl-2蛋白易与促凋亡蛋白Bax形成Bcl-2/Bax异二聚体，抑制Bax的促凋亡作用。Bax自身可形成同型二聚体，从而使Cyto C等释放细胞质，这些被释放出来的促凋亡因子进一步引起下游Caspase的切割活化，引起细胞发生凋亡^{[12, 13]}，见图 9。本实验通过Western blotting检测到Caspase-9和Caspase-3的活化降解，证明pp-10通过内源性细胞凋亡途径诱导BGC-823细胞凋亡。并且随着药物浓度的增加，BGC-823细胞Bax的表达逐渐增加，Bcl-2蛋白的表达水平逐渐下降，进一步证明pp-10是通过线粒体相关的凋亡通路诱导BGC-823细胞凋亡。

图 9 Pp-10诱导线粒体凋亡和通过AKT/mTOR/p70s6k信号通路诱导BGC823细胞自噬模型 Fig. 9 Hypothetical model of AKT/mTOR/p70s6k signaling in pp-10-induced autophagy and mitochondria apoptosis in BGC823 cells

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近年来研究表明，PI3K是一种细胞内磷脂酰肌醇激酶，具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的活性，PI3k/Akt通路是重要的抗凋亡通路。PI3K介导的信号转导通路可以通过不同的方式调节细胞的分裂、分化、凋亡等活动^[14]。蛋白激酶Akt是PI3K信号转导途径重要的信号分子，可被PI3K激活成为具有磷酸激酶活性的p-Akt，p-Akt可以增加NF-κB的转录活性，上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平，促进肿瘤细胞的增殖和侵袭^[15]。Bcl-2定位于线粒体膜上，是 PI3k/Akt 下游的抗凋亡蛋白。p-Akt通过促进 Bad (Ser136) 的磷酸化，促使Bad与14-3-3结合，抑制 Bad 的促凋亡作用^{[16, 17]}。Akt通过磷酸化MDM2(Ser166、Ser 186)，促进MDM2核转位，通过MDM2的泛素连接酶功能，促进p53的降解，抑制p53的转录活性，抑制Bax，Noxa，Puma的表达，间接促进Bcl-2的抗凋亡功能。Akt也能磷酸化Bcl-2家族成员Bax的Ser184位点，抑制Bax的促凋亡功能^[18]。Caspase-9是线粒体凋亡通路的关键蛋白之一，活化的Akt 除了通过改变Bcl-2蛋白家族成员活性抑制线粒体细胞色素C的释放，抑制Caspase 9的活化外，还可以直接使Caspase-9 (Ser196)位点磷酸化而失活，抑制其促凋亡作用^[19]。同时，作为PI3K/Akt的下游，ｍTOR活性即成为自噬体形成、 成熟的关键^{[20, 21]}。目前普遍认为，mTOR是调节细胞生长、 增殖、 运动、存活和自噬等上游信号转导通路的汇合点^[22]。本研究发现：随着pp-10作用浓度的增加，p-Akt表达减少，Akt下游分子p-mTor表达减少，p-p70S6K表达减少，提示PI3K/Akt信号通路受到抑制。Akt的抑制能通过抑制mTOR的活性从而促进细胞自噬，另一方面，Akt的抑制能通过活化p53促进Bax的表达，并通过Bcl-2促凋亡蛋白与Bcl-2抗凋亡蛋白活性改变，促进线粒体凋亡通路的活化，导致细胞凋亡的发生。

本实验发现，重楼活性单体pp-10通过抑制PI3K/Akt信号通路，抑制人胃癌细胞BGC-823增殖，诱导细胞凋亡和自噬。我们已经从重楼中分离出16种抗肿瘤效果好于顺铂的单体，今后我们将进一步在这些单体中筛选出低毒高效的抗肿瘤单体，一方面选择某些代表性单体研究其抗肿瘤的分子机制，为pp-10用于肿瘤治疗提供实验依据。另一方面将这些单体组成重楼抗肿瘤小组分组方，研究它的抗肿瘤作用，为实现重楼的老药新用打下基础。