中国生物工程杂志  2015, Vol. 35 Issue (1): 54-60

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唐德平, 毛爱红, 王芳, 张虹, 王黎, 廖世奇
TANG De-ping, MAO Ai-hong, WANG Fang, ZHANG Hong, WANG Li, LIAO Shi-qi
适配体介导脂质体靶向递送siRNA的研究
Targeted Delivery of siRNA Mediated by Aptamer Modified Liposome
中国生物工程杂志, 2015, 35(1): 54-60
China Biotechnology, 2015, 35(1): 54-60
http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20150108

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收稿日期：2014-06-27
修回日期：2014-08-11
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唐德平, 毛爱红, 王芳, 张虹, 王黎, 廖世奇. 适配体介导脂质体靶向递送siRNA的研究[J]. 中国生物工程杂志, 2015, 35(1): 54-60.
TANG De-ping, MAO Ai-hong, WANG Fang, ZHANG Hong, WANG Li, LIAO Shi-qi. Targeted Delivery of siRNA Mediated by Aptamer Modified Liposome[J]. China Biotechnology, 2015, 35(1): 54-60.
适配体介导脂质体靶向递送siRNA的研究
唐德平1, 毛爱红2 , 王芳2, 张虹2, 王黎2, 廖世奇2    
1. 兰州交通大学化学与生物工程学院 兰州 730070;
2. 甘肃省医学科学研究院 兰州 730050
收稿日期:2014-06-27; 修订日期：2014-08-11;
基金项目：甘肃省中青年基金(1107RJYA033),兰州交通大学校青年基金(2013012)资助项目.
通讯作者, 电子信箱: maoaih@aliyun.com
摘要：为探讨适配体介导的脂质体靶向递送siRNA的可行性,采用前列腺癌细胞膜表面抗原(PSMA)的适配体A10-3.2与脂质体结合,构建适配体-脂质体靶向递送体系(Apt -LP),并利用Apt-LP递送pEGFP-N1质粒和Bcl2 siRNA到前列腺癌细胞LNCaP(PSMA+)和PC-3(PSMA-),转染48h后,用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达,qPCR检测 Bcl2 mRNA表达,蛋白印记法检测Bcl2蛋白表达,Hoechst 33258核染法分析体外抗肿瘤活性。结果显示:与脂质体递送体系相比,Apt-LP显著提高递送pEGFP-N1质粒和Bcl2 siRNA到靶细胞LNCaP(PSMA+)的效率;显著提高Bcl2 siRNA 诱导的靶细胞LNCaP(PSMA+) Bcl2 基因沉默效应,更有效的诱导靶细胞LNCaP(PSMA+)凋亡。结果表明:Apt -LP是一种有效的siRNA靶向递送体系,具有潜在的临床应用价值。
关键词： 适配体     siRNA     脂质体     靶向递送    
Targeted Delivery of siRNA Mediated by Aptamer Modified Liposome
TANG De-ping1, MAO Ai-hong2 , WANG Fang2, ZHANG Hong2, WANG Li2, LIAO Shi-qi2    
1. The School of Chemical & Biological Engineering, Lanzhou Jiaotong University, Lanzhou 730070, China;
2. Institute of Gansu Medical Science Research, Lanzhou 730050, China
Abstract:To investigate the efficiency of siRNA using aptamer-conjugated liposome(Apt-LP),A10-3.2 was used as a PSMA-targeting ligand in the design of a liposome-based siRNA delivery system to prostate cancer cells. The sequence of the aptamer used in this study is modified with 3'- Cholesterol and with 2'- Fluor pyrimidines. The cholesterol tag immobilizes the aptamer on the liposome surface by inserting into the hydrophobic lipid membrane. Liposome was conjugated to aptamer and used as a vehicle for siRNA target delivery. GFP expression assays of pEGFP - N1 against LNCaP (PSMA+) and PC-3 (PSMA-) cells demonstrated that the transfection efficiency of the synthesized Apt-LP complex was higher than that of the liposome. In addition, gene knock down assay of Apt-LP-siRNA complex in LNCaP (PSMA+) and PC-3 (PSMA-) cells showed that Bcl2 gene silencing effect significantly higher than that of LP-siRNA complex and more effectively induced apoptosis of LNCaP cells. These results suggest that the Apt - LP is a kind of effective siRNA targeting delivery system, has potential clinical application.
Key words: Aptamer     siRNA     Liposome     Targeted delivery    

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种由小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默现象[1]。RNAi在阐明基因功能、鉴定药物靶点、开发靶向治疗药物等方面具有广泛应用。自2004年第一个siRNA类治疗药物进入临床试验以来，现已证明与基因相关的疾病都可能成为siRNA潜在的靶点，如恶性肿瘤、病毒感染、遗传疾病、代谢紊乱等，siRNA类治疗药物在临床上有着广泛的应用前景[2]。但siRNA存在血液稳定性差，半衰期短，易降解等缺陷，siRNA特异、有效递送是siRNA类药物广泛应用的主要障碍之一[3]。

核酸适配体(aptamer)是一类可形成特异三维结构的DNA或RNA寡核苷酸分子，可与其靶分子高亲和力、高特异性结合。适配体具有分子量小、免疫原性低，可体外合成、改造与标记，被广泛研究用于临床检测、诊断及药物靶向递送[3]。目前，已有多种细胞表面膜蛋白特异的适配体被开发应用于药物靶向递送[4]。 A10适配体可与前列腺癌细胞膜表面抗原(prostate-specific membrane antigen,PSMA)的胞外域特异性结合[5]，已被研究用于将化疗药物、siRNA靶向递送到前列腺癌细胞[6, 7, 8, 9, 10, 11, 12]。但A10适配体是含有71碱基的RNA分子，化学合成较为困难，限制了其在药物靶向递送中的应用。适配体A10-3.2是A10适配体从71到39碱基的截短体，更易化学合成，活性与特异性更高，是A10适配体的优化形式[13,14]。

为探讨PSMA特异性适配体介导的脂质体靶向递送siRNA的可行性，本研究将适配体A10-3.2的3′-末端连接胆固醇使其具有亲脂性，构建适配体-脂质体靶向递送体系，递送pEGFP-N1质粒和Bcl2 siRNA到前列腺癌细胞LNCaP(PSMA+)和PC-3(PSMA-)，验证该体系靶向递送siRNA的可行性。 1 材料与方法 1.1 材 料

前列腺癌细胞系LNCaP(PSMA+)和PC-3(PSMA-) 购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源研究中心； PSMA特异性适配体A10-3.2、Bcl2 siRNA、CON siRNA和Bcl2、GADPH引物由TaKaRa合成，序列见表 1；Lipofectamine 2000购自Invitrogen，RPMI 1640、Ham’s F12-K培养基、胎牛血清购自Gibco公司；鼠抗人Bcl2单克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体、HRP-山羊抗鼠IgG购自 Santa Cruz生物技术有限公司；TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 和One Step SYBR PrimeScript Plus RT-PCR kit购自TaKaRa；RIPA细胞裂解液购自碧云天生物技术公司；Hochest 33258，PSMF购自Sigma公司；无内毒素质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

表1 TaKaRa合成的RNA/DNA序列 Table 1 RNA/DNA sequences
NameSequences
AptamerA10-3.25′-GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUU
ACGUCACUCCU-Cholesterol with 2′- Fluor pyrimidines
Bcl2 siRNAsense5′-AAGUGAAGUCAACAUGCCUGC-3′
antisense5′-GCAGGCAUGUUGACUUCACUU-3′
CON siRNAsense5′-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3′
antisense5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAUU-3′
Bcl2 PrimerF5′-ATGTGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3′
R5′-ACAGTTCCACAAAGGCATCC-3′
GAPDH PrimerF5′-TCGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′
R5′-CGCCCAATACGACCAAATCC-3′
表选项
1.2 方 法 1.2.1 细胞培养

LNCaP(PSMA+)和PC3(PSMA-)分别培养在含10%胎牛血清的RPMI 1640和Ham’s F12-K培养基中，培养条件：37℃,5% CO2。 1.2.2 pEGFP-N1质粒转化与提取

pEGFP-N1质粒转化：pEGFP-N1质粒10μl 加入到200μl的感受态大肠杆菌DH5α中，混匀，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴5min后涂布含有氨苄青霉素的LB培养板，37℃正置1h后反置培养16h，挑取阳性克隆、扩增、按无内毒素质粒提取试剂盒说明书提取质粒，酶切电泳鉴定。 1.2.3 适配体-脂质体- pEGFP-N1靶向递送体系的构建

将提取好的pEGFP-N1质粒(1 000ng/μl)和脂质体各5μl分别稀释到250μl 转染培养基中，室温静置5min。将脂质体稀释液加入到pEGFP-N1质粒稀释液中，混合均匀，室温静置15min，形成脂质体-pEGFP-N1质粒复合物。将胆固醇修饰的PSMA适配体A10-3.2 与脂质体- pEGFP-N1复合物按摩尔比10∶1混合，37℃孵育1h，形成适配体-脂质体- pEGFP-N1质粒(Apt-LP-pEGFP-N1)复合物。 1.2.4 适配体-脂质体-siRNA靶向递送体系的构建

将Bcl-2 siRNA(20pmol/μl) 与Lipofectamine 2000按Invitrogen说明书推荐的比例进行混合，室温静置30min，形成脂质体-siRNA复合物。将胆固醇化的PSMA适配体A10-3.2 与脂质体-siRNA复合物按摩尔比10∶1混合，37℃孵育1h，形成适配体-脂质体-siRNA(Apt-LP- siRNA)复合物。 1.2.5 适配体-脂质体- pEGFP-N1质粒转染实验

LNCaP和PC-3分别接种于6孔细胞培养板中，接种细胞密度为1×105个/ml，当细胞融合度为60%左右时，去除培养基，PBS洗3次，分别加入适配体-脂质体(Apt-LP)，脂质体- pEGFP-N1质粒(LP- pEGFP-N1)复合物，适配体-脂质体- pEGFP-N1质粒(Apt-LP- pEGFP-N1)复合物，37℃，5% CO2培养箱内共孵育6h，PBS洗细胞2次，换成含10%胎牛血清的相应培养基，继续培养48h，荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况。以绿色荧光蛋白表达量表示转染效率，每组设三个平行。 1.2.6 适配体-脂质体-siRNA复合物转染实验

同1.2.5 ，PBS洗后的细胞中加入适配体-脂质体- Bcl2 siRNA复合物(Apt-LP-Bcl2 siRNA)、适配体-脂质体(Apt-LP)，适配体-脂质体-Con siRNA (Apt-LP-Con siRNA)，脂质体-Bcl2 siRNA (LP-Bcl2 siRNA)分别转染LNCaP(PSMA+)和PC-3(PSMA-)细胞6h后，PBS洗细胞2次，换成含10%胎牛血清的相应培养基，37℃，5% CO2条件下继续培养48h后，qRT-PCR检测Bcl2 mRNA表达水平，Western blot分析Bcl2蛋白表达水平。以未转染的LNCaP和PC-3为对照组(untreated)，每组设三个平行。 1.2.7 qRT-PCR检测Bcl-2 mRNA表达水平

总RNA提取：参照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒；Bcl2 mRNA表达水平的检测：qRT-PCR操作按One Step SYBR PrimeScript Plus RT-PCR kit试剂盒说明进行，以GAPDH为内参，反应条件如下： 42℃，5min，95℃，10s；95℃ 5 s，55℃，30 s，72℃，30s(40个循环)。Bcl2、GAPDH引物见表 1。 1.2.8 Western blot 分析Bcl-2 蛋白表达水平

取变性后的蛋白裂解液(蛋白含量约为20μg)进行SDS-PAGE电泳(分离胶为10%、浓缩胶4%、恒压80V电泳3h)；冰浴，转PVDF膜(恒流150mA，2h)；含5%奶粉的PBST室温封闭3h；加入鼠抗人Bcl2单克隆抗体(1∶1 000)，4℃，摇床震荡，孵育过夜；PBST洗膜3次，加入HRP-山羊抗鼠IgG二抗(1∶1 000)，室温孵育2h；PBST洗膜3次，加反应底物，显色成像，以β-actin为内参。 1.2.9 适配体-脂质体- Bcl2 siRNA 体外抗肿瘤效应分析

适配体-脂质体- Bcl2 siRNA复合物(Apt-LP-Bcl2 siRNA)、适配体-脂质体(Apt-LP)、适配体-脂质体-Con siRNA (Apt-LP-Con siRNA)、脂质体-Bcl2 siRNA(LP-Bcl2 siRNA)分别与LNCaP和PC-3细胞在37℃，5% CO2培养箱内共孵育6h，PBS洗细胞2次，换成含10%胎牛血清的完全培养基，继续培养48h后，加入1ml 4%多聚甲醛室温固定30min，PBS洗涤2次，加Hoechst 33258 染液(50ng/ ml)400μl，避光染色30min，荧光显微镜观察细胞凋亡。以未转染的LNCaP 和PC-3为对照组(untreated)。 2 结 果 2.1 适配体-脂质体靶向递送体系的递送效率分析

为验证适配体-脂质体的递送效率，以绿色荧光蛋白为报告基因，利用A10-3.2-脂质体靶向递送体系递送pEGFP-N1质粒到LNCaP 和PC-3细胞，48h后，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况(图 1A)。在LNCaP(PSMA+)细胞中，适配体-脂质体靶向递送体系递送效率(89.2%)显著高于单独的脂质体递送(56.8%)，而在PC-3 (PSMA-)细胞中，适配体-脂质体体系递送效率(59.2 %)与单独脂质体的递送效率(56.6%)无显著差别(图 1B)。表明：适配体可以特异性提高脂质体-pEGFP-N1质粒转染靶细胞的效率，而不能提高脂质体-pEGFP-N1质粒转染非靶细胞的效率。

图 1 适配体-脂质体递送pEGFP-N1质粒效率分析 Fig. 1 The cellular uptake of Apt-LP-pEGFP-N1 in LNCaP(PSMA+)and PC-3(PSMA-)cells by fluorescence microscopyA Fluorescence microscopy images (10×) B The percent of green fluorescence protein expression cells
图选项
2.2 适配体-脂质体Bcl2 siRNA诱导靶基因沉默效应分析

为检验适配体-脂质体递送siRNA及诱导靶基因的沉默效应，将适配体-脂质体- Bcl2 siRNA复合物、适配体-脂质体(Apt-LP)、适配体-脂质体-Con siRNA (Apt-LP-Con siRNA)、脂质体-Bcl2 siRNA(LP-Bcl2 siRNA)分别转染LNCaP和PC-3细胞系，以未转染的LNCaP 和PC3为对照组(untreated)。37℃，5% CO2条件下培养48h后，提取总RNA，实时定量PCR分析Bcl-2 mRNA 的表达水平(图 2A)，Western blot 分析Bcl2 蛋白表达水平(图 2B)。结果表明：与对照转染非靶siRNA(Apt-LP-Con siRNA)相比，LNCaP 和PC-3细胞系通过脂质体或适配体-脂质体转染Bcl2 siRNA后，Bcl2 mRNA及蛋白表达水平受到显著抑制；表明Bcl2 siRNA能够有效沉默Bcl2基因的表达。与单独脂质体转染Bcl2siRNA相比，Apt-LP- Bcl2 siRNA转染LNCaP(PSMA+)细胞后，显著抑制Bcl2 mRNA及蛋白表达水平，而Apt-LP- Bcl2 siRNA转染PC-3(PSMA-)细胞后，Bcl2 mRNA及蛋白表达水平无显著变化。表明适配体能特异性的提高脂质体-Bcl2 siRNA转染靶细胞的效率。

图 2 适配体-脂质体递送Bcl2 siRNA诱导的靶基因沉默效应分析Fig. 2 Apt-LP-siRNA mediated gene silencing (A)Bcl2 mRNA expression was analyzed by qRT-PCR at 48 h post-transfection of Bcl-2 siRNA. GAPDH as a reference gene (B)Bcl2 knocks down following LP-siRNA or Apt-LP-siRNA complexes delivery to LNCaP cells and processed for immunoblotting with anti-Bcl2 antibodies at 48 post-transfection. β-actin as a loading control
图选项
2.3 适配体-脂质体-Bcl2 siRNA 体外抗肿瘤效应

为检验适配体-脂质体-Bcl2 siRNA体外抗肿瘤效应，采用了Hoechst 33258核染法分析适配体-脂质体-Bcl2 siRNA诱导的细胞凋亡(图 3)。与转染对照非靶siRNA(Apt-LP-Con siRNA)相比，LNCaP和PC-3细胞系通过脂质体或适配体-脂质体转染Bcl2 siRNA后，均有细胞凋亡发生(图 3A)，表明Bcl2 siRNA能够有效诱导前列腺癌细胞凋亡。与单独脂质体转染Bcl2 siRNA相比，Apt-LP- Bcl2 siRNA转染高表达PSMA的LNCaP(PSMA+)细胞后，LNCaP(PSMA+)发生细胞凋亡的现象更加明显(图 3A)，其结果与Apt-LP- Bcl2 siRNA 具有更高的Bcl2基因沉默效率相一致。而在低表达PSMA的PC-3(PSMA-)细胞系，靶向递送的Apt-LP- Bcl2 siRNA和非靶向递送的LP-Bcl2 siRNA，Bcl2 siRNA诱导的细胞凋亡无显著差异(图 3B)。表明适配体能特异性的提高脂质体-Bcl2 siRNA诱导靶细胞凋亡的比率。

图 3 适配体-脂质体递送Bcl-2 siRNA体外诱导细胞凋亡分析Fig. 3 The apoptosis of LNCaP(PSMA+)and PC-3(PSMA-)cells treated with LP-siRNA or Apt-LP-siRNA complexesA The nuclear morphological changes by Hoechst staining were assessed. Control cells normally contained single round nuclei B The apoptotic rate of cell population was calculated as the ratio of apoptotic cells to total cells counted 100. The red arrows represent the apoptotic body
图选项
3 讨 论

PSMA是一种特异表达于前列腺上皮的膜蛋白，PSMA能够选择性吞噬PSMA配基，利用此特性可将外源功能性物质通过PSMA定向转入前列腺癌细胞内发挥作用[15]。PSMA适配体A9和A10可结合在纳米颗粒或多聚体体表面形成靶向递送复合物，高特异性地与细胞表面PSMA结合，靶向递送药物、毒素、纳米颗粒、siRNA、microRNA到LNCaP细胞[6, 7, 12, 16, 17, 18, 19]；适配体也可直接与修饰或未修饰的siRNA嵌合，形成aptamer-siRNA嵌合体，Chu等[5, 12]利用抗生蛋白链菌素作为载体，将生物素化的siRNA和生物素化的PSMA适配体A9连接到载体蛋白，形成A9-抗生蛋白链菌素-siRNA复合物，此复合物能够在30分钟内进入细胞，并产生由siRNA介导的基因沉默，其靶基因抑制效应与转染质粒相当，但并不清楚复合物入胞后如何解离并发挥作用。McNamara等[10]将PSMA适配子A10与PlK-1和Bcl2基因的siRNA嵌合，形成A10 aptamer-siRNA嵌合体，该嵌合体可多次给药且被很好耐受，但由于该嵌合体转录产物的三维空间结构较难控制，无法得到普遍应用。

脂质体是一类较好的递送siRNA的载体。siRNA与脂类分子连接或包裹到脂质体中，能保护siRNA不被RNase降解，并提高siRNA膜通透性，从而促进细胞摄取。阳离子脂质体Transfectam和98N12-5作为递送载体已被成功应用于临床药物递送[2]。2009年，Cao等[20]成功构建了适配体功能化脂质体 (Apt-LP)递送化疗药物顺铂到乳腺癌细胞。本文利用A10-3.2作为靶向配基构建了适配子(A10-3.2) -脂质体-siRNA，可靶向递送siRNA到LNCaP细胞，与单纯的脂质体转染相比，转染效率提高，基因沉默效率增强，更有效的诱导靶细胞凋亡。表明适配子-脂质体是一种有效的药物靶向递送体系，具有潜在的临床应用价值。

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