辛德毕斯病毒（Sindbis virus，SINV）通过蚊虫等吸血媒介叮咬而传播引起人类出现发热、皮疹和关节炎等症状，更重要的是它所引起的疾病容易发展为慢性。该病最早在乌干达发现，随后在芬兰、瑞典和俄罗斯等国家多次造成人感染和疾病流行，给人类健康带来了严重危害，具有重要的公共卫生意义^[1-2]。目前，在我国不仅从多种蚊虫媒介中分离到多株SINV，而且还从发热患者血清中也分离到该病毒和检测到该病毒抗体^[3-4]，提示我国也可能存在辛徳毕斯病毒病流行。

SINV是披膜病毒科（Togavirudea）甲病毒属病毒（Alphavirus）的一种虫媒病毒^[5]，蚊虫为其主要传播媒介，鸟类为其主要动物宿主。SINV地理分布非常广泛，在非洲、亚洲、大洋洲和欧洲都有此病毒引起的疾病发生^[6-8]。病毒感染宿主和媒介种类也非常多，目前从多种蚊虫、蜱和人中分离到该病毒^[3-5]，但未见在蠓中分离到SINV的报道。本研究2013年在云南省德宏傣族景颇族自治州（德宏州）芒市采集的蠓中分离到1株阳性分离物，并对该分离物进行系统的分子生物学鉴定，明确该分离物的分类地位及与其遗传进化，为进一步开展SINV与当地人或动物疾病关系的研究和防控提供科学依据。

2013年7月在云南省德宏州芒市风平镇的牛圈和羊圈采集蠓标本，于18：00至次日07：00采用灯诱的方法（功夫小帅12 V，300 mA，武汉市吉星环保科技有限责任公司）捕获蠓。捕获的蠓放入-20 ℃冰箱约30 min，每管100只分装编号后迅速放入液氮罐中保存。

从液氮罐中取出蠓标本，在生物安全柜中把蠓倒入预冷的研磨器中，加入1 ml研磨液（MEM，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，pH值7.0~7.2）进行充分研磨，4 ℃、离心半径7 cm，8 000 r/min离心10 min。分别取150 μl研磨液上清接种长满单层的金黄地鼠肾细胞（BHK-21）和白纹伊蚊（Aedes albopictus）细胞（C6/36），分别置于37 ℃（BHK-21细胞）和28 ℃（C6/36细胞）培养箱内培养，每天观察细胞病变（cytopathic effect，CPE），连续盲传3代，每代连续观察7 d。

采用Trizol试剂（TaKaRa公司，大连）从阳性分离物细胞悬液中提取总RNA。按照试剂盒说明书用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）试剂盒（TaKaRa公司，大连）进行反转录合成第一链cDNA。

参照文献[9]以cDNA为模板先采用披膜病毒科甲病毒属、黄病毒属和布尼亚病毒属特异性引物进行PCR扩增，扩增产物测序，在美国国立生物技术信息中心（NCBI）中进行BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对，对阳性分离物进行初步鉴定。参考NCBI上MRE16（AF492770，U90536）株NS1基因序列设计2对引物MX1F、MX700F（正向引物：5'-ATTGGCGGCGTAGTACACAC-3'、5'-GAAGGCAGGACAGGAAAGTTG-3'）和MX1170R、MX1894R（反向引物：5'-CCGTTGATGACAATCCTCTG-3'、5'-ATGGTAGAGTTTGCGGTTCAC-3'）进行PCR扩增，在25 μl反应体系中分别加入0.3 μl EX Taq聚合酶、2.5 μl 10 × EX Taq Buffer、2.0 μl 2.5 mmol/L dNTP、正反向引物各0.5 μl、17.2 μl RNase-free ddH₂O、cDNA2.0 μl，反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃80 s，共35个循环；最后72 ℃10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带，送北京擎科生物科技有限公司昆明分公司进行测序。

从GenBank中下载7株SINV以及1株西方马脑炎病毒NS1基因序列，毒株具体背景信息见表 1。用DNAStar中SeqMan软件对所有测序得到的结果进行序列拼接；使用Clustal X Version 1.8及DNAStar软件中MagAlign进行病毒基因序列比对及同源性分析；利用MEGA 6.0软件完成基于Neighbour-joining（NJ）方法的系统进化树的绘制，Bootstrap值为1 000。

表 1 本实验中使用的辛德毕斯病毒毒株背景信息 Table 1 Background information of the Sindbis virus strains used in this study

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2013年7月在云南省德宏州共采集4 500多只蠓，约100只1批，分44批进行病毒分离，获得多株阳性分离物，其中1株分离物（编号：YN222）在BHK-21和C6/36细胞上均产生明显的CPE，病变特点分别为在接种BHK-21细胞24 h后细胞出现圆缩、肿胀、脱落；在接种C6/36细胞72 h后细胞折光性增强、聚集、最后脱落。见图 1。

注：A 表示BHK-21细胞对照（24 h）；B 表示接种YN222的BHK-21细胞（24 h）；C 表示C6/36细胞对照（72 h）；D 表示接种YN222的C6/36细胞（72 h）。 图 1 YN222分离株感染BHK-21、C6/36细胞后引起的细胞病变 Figure 1 Cytopathic effect of BHK-21 and C6/36 cells caused by the infection with YN222 isolate

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采用甲病毒属特异性引物对YN222进行RT-PCR扩增，结果大约在430 bp处出现明显的电泳条带，而黄病毒属和布尼亚病毒属引物扩增均为阴性。测序后获得的序列经BLAST比对发现YN222与马来西亚分离的MRE16株核苷酸同源性最高，为93.7%，初步鉴定蠓中新分离病毒（YN222）为SINV。

采用SINV NS1基因特异引物对YN222进行RT-PCR扩增，扩增阳性，测序获得YN222株NS1基因全长序列（1 605 nt，编码535 aa），将该段序列与GenBank中其他不同宿主、不同时间及地区分离的SINV进行核苷酸和氨基酸的同源性分析（表 2），结果显示蠓分离YN222株病毒与2005年在云南省勐海县采集蚊虫分离的MX10-LP、MX10-SP同源性最高，核苷酸分别为99.6%和99.5%，氨基酸同源性分别为99.4%和99.4%；其次与马来西亚蚊虫分离的MRE16株病毒核苷酸同源性为93.7%，氨基酸同源性为99.4%，与澳大利亚蚊虫分离的18953株病毒核苷酸同源性为93.5%，氨基酸同源性为99.2%；而与1987年云南省发热病人分离的YN87448核苷酸同源性仅为80.3%，氨基酸同源性仅为90.0%；与我国新疆以及欧洲、非洲等地区蚊虫和病人分离的SINV核苷酸和氨基酸同源性较低，均低于80.6%和90.9%。

表 2 YN222分离株核苷酸与氨基酸序列同源性分析 Table 2 Homology analysis of nucleotide and amino acid sequences in the YN222 isolate

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将蠓新分离病毒YN222与GenBank中下载的10株SINV和2株云南省蚊虫分离的SINV以及1株西方型马脑炎病毒（WEEV-71V-1685）的相应基因序列一起采用MEGA 6.0软件构建系统进化树（图 2），结果显示：蠓新分离病毒株YN222与12株SINV处于同一进化分支，提示蠓新分离病毒YN222是SINV；进一步分析结果显示所有12株SINV形成3个相对独立的进化分支，第1个进化分支（Paleoarctic/Ethiopian genotype）由欧洲、非洲分离株以及中国新疆XJ-160株和云南YN87448株病毒形成，第2个进化分支（Oriental/Australian genotype）由马来西亚MRE16株及澳大利亚18953株和中国云南分离的MX10-LP和SP株病毒形成，第3个进化分支（Wester/Australian genotype.）由澳大利亚西部地区分离的SW6562株病毒形成。本次研究蠓分离的YN222株病毒与云南省2005年蚊虫分离的MX10-LP、MX10-SP和马来西亚1990年蚊虫分离的MRE16株及澳大利亚18953株位于第2个进化分支（Oriental/Australian genotype）内。

注：●表示本研究分离病毒株；P/E 为Paleoarctic/Ethiopian genotype；W/A 为Wester/Australian genotype；O/A 为Oriental/Australian genotype。 图 2 YN222分离株NS1基因（1 605 bp）系统进化分析 Figure 2 Phylogenetic analysis of NS1 gene (1 605 bp) in the YN222 isolate

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在已知的虫媒病毒中SINV是分布最为广泛的病毒。该病毒不仅能引起人类发热、皮疹和关节炎，更重要的是它所引起的疾病容易发展为慢性疾病，对人类的健康造成严重危害^[1-2]，近些年来在我国很多地区健康人、发热患者血清中均查到了SINV抗体^[10]，在野兔、狐狸、犬等动物体内也检测到SINV抗体^[11]，证实了该病毒在我国多个地区存在广泛感染。本研究从云南省德宏州采集到的蠓标本中分离到1株病毒均能引起BHK-21、C6/36细胞产生明显的CPE，在BHK-21上产生CPE非常迅速，这些特点与甲病毒属病毒相似^[5]。采用甲病毒属特异性引物和SINV NS1基因特异引物扩增均为阳性，提示该蠓新分离病毒YN222可能为披膜病毒科甲病毒属病毒。序列分析结果显示蠓中新分离病毒YN222与澳大利亚东方型SINV位于同一进化分支内，核苷酸和氨基酸同源性也较高（核苷酸 > 93.7%，氨基酸 > 99.4%），提示本研究在德宏州芒市采集蠓分离的病毒YN222为澳大利亚东方型SINV，这是首次在蠓中分离到SINV。

蚊虫是SINV的主要传播媒介。目前不仅从三带喙库蚊（Culex tritaeniorhynchus）、中华按蚊（Anopheles sinensis）、埃及伊蚊（Ae. aegypti）等多种蚊虫中分离到SINV^{[3, 5, 12]}，从蜱中也分离到该病毒^[13]，提示SINV传播媒介种类比较广泛。本研究首次从蠓中分离到SINV，该病毒与2005年云南省蚊虫分离的病毒遗传进化关系最密切，核苷酸同源性也最高为99.5%和99.6%，提示蠓可能作为一种SINV潜在的传播媒介，是否参与了当地SINV的自然循环还有待进一步研究。

德宏州地处云南省西部，属于南亚热带季风气候，具有海拔低、气温高、雨量多等特点，优越的气候条件非常适合各类媒介昆虫的生长繁殖，有利于虫媒病毒病在媒介昆虫和宿主动物之间循环传播，因此虫媒病毒种类较多。有研究结果提示，云南省德宏州存在流行性乙型脑炎病毒、登革病毒^[14]、蓝舌病毒^[15]、芒市病毒^[16]、西藏环状病毒^[17]等多种与人或动物疾病相关的虫媒病毒的流行，此次从云南省德宏州芒市牛圈采集的蠓虫中分离到SINV，提示该地区存在发生该病的风险，今后应加强对该地区SINV等虫媒病毒传播媒介及相关人或动物疾病的监测，了解该地区人或动物辛徳毕斯病等虫媒病毒病的流行及危害，为人或动物相关虫媒病毒病的研究和防治提供科学依据。

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