中国媒介生物学及控制杂志  2021, Vol. 32 Issue (4): 498-502

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何于雯, 李楠, 孟锦昕, 王静林
HE Yu-wen, LI Nan, MENG Jin-xin, WANG Jing-lin
云南省芒市采集蠓中辛德毕斯病毒的分离与鉴定
Isolation and identification of Sindbis virus from midges collected in Mangshi, Yunnan province, China
中国媒介生物学及控制杂志, 2021, 32(4): 498-502
Chin J Vector Biol & Control, 2021, 32(4): 498-502
10.11853/j.issn.1003.8280.2021.04.023

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收稿日期: 2021-02-24
云南省芒市采集蠓中辛德毕斯病毒的分离与鉴定
何于雯 , 李楠 , 孟锦昕 , 王静林     
云南省畜牧兽医科学院, 云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室, 云南昆明 650224
摘要: 目的 了解云南省德宏傣族景颇族自治州(德宏州)芒市蠓携带虫媒病毒情况,为虫媒病毒的研究和防控提供科学依据。方法 2013年7月在德宏州芒市郊区牛和羊的养殖场中采用灯诱方法收集蠓标本。对采集到的蠓进行研磨离心,上清分别接种金黄地鼠肾细胞(BHK-21)和白纹伊蚊细胞(C6/36)进行病毒分离。阳性分离物分别采用甲病毒属、黄病毒属和布尼亚病毒属特异引物进行初步鉴定;采用辛德毕斯病毒(SINV)NS1基因特异性引物对阳性分离物进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增并进行测序及序列分析。结果 共采集到4 500余只蠓,分44批进行病毒分离,获得1株阳性分离物(编号:YN222)接种在BHK-21细胞24 h后迅速产生明显细胞病变,接种在C6/36细胞72 h后产生明显的细胞病变。甲病毒属引物RT-PCR扩增阳性,而黄病毒属和布尼亚病毒属引物扩增均为阴性。甲病毒属引物扩增阳性产物测序后BLAST结果显示YN222株分离物与MRE16株SINV核苷酸同源性最高为93.7%。采用MRE16株NS1基因特异性引物进行RT-PCR扩增结果为阳性,测序获得1 605 nt序列。系统进化分析结果显示,蠓新分离病毒YN222与澳大利亚东方型SINV位于同一进化分支内,核苷酸和氨基酸同源性较高,核苷酸在93.7%~99.6%,氨基酸为99.4%。结论 在云南省德宏州采集蠓中分离的病毒YN222为澳大利亚东方型SINV,这是首次在蠓中分离到SINV。
关键词: 辛德毕斯病毒        分离    鉴定    系统进化分析    
Isolation and identification of Sindbis virus from midges collected in Mangshi, Yunnan province, China
HE Yu-wen , LI Nan , MENG Jin-xin , WANG Jing-lin     
Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Diseases Laboratory, Yunnan Animal Science and Veterinary Institute, Kunming, Yunnan 650224, China
Abstract: Objective To investigate the status of arboviruses carried by midges in Mangshi, Dehong Dai and Jingpo autonomous prefecture (Dehong prefecture), Yunnan province, China, and to provide a scientific basis for the research and control on arboviruses. Methods The light-trap method was used to collect specimens of midges from cattle and sheep farms in suburbs of Mangshi, Dehong prefecture in July 2013. The collected Culicoides midges were ground and centrifuged, and the supernatants were inoculated with baby hamster kidney-21 (BHK-21) and Aedes albopictus C6/36 cells separately for virus isolation. The specific primers for Alphavirus, Flavivirus, and Bunya virus were used to preliminarily identify the positive isolates, and the specific primers for Sindbis virus (SINV) NS1 gene were used to perform the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), sequencing, and sequence analysis. Results A total of 4 500 midges were collected, which were divided into 44 batches for virus isolation. One positive isolate (serial number: YN222) was obtained, which produced obvious cytopathic effect in 24 hours after inoculation of BHK-21 cells, and in 72 hours after inoculation of C6/36 cells. The RT-PCR amplification showed a positive result by using the primers for Alphavirus, whereas showed negative results by using those for Flavivirus and Bunya virus, suggesting that the isolate YN222 was from the genus Alphavirus. The BLAST sequence analysis after the amplification of positive products using the primers for Alphavirus showed that the isolate YN222 had a nucleotide homology of up to 93.7% with SINV MRE16 strain. The RT-PCR amplification showed a positive result by using the specific primers for NS1 gene of MRE16 strain, and a 1 605-nt sequence was obtained via sequencing. The phylogenetic analysis showed that the newly isolated virus YN222 from midges was in the same evolutionary branch as the Oriental-Australian type of SINV, with a high homology in nucleotides (93.7%-99.6%) and amino acids (99.4%). Conclusion The virus YN222 isolated from midges collected in Dehong prefecture of Yunnan province is Oriental-Australian type of SINV. This is the first time that SINV has been isolated from Ceratopogonidae.
Key words: Sindbis virus    Midges    Isolation    Identification    Phylogenetic analysis    

辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)通过蚊虫等吸血媒介叮咬而传播引起人类出现发热、皮疹和关节炎等症状,更重要的是它所引起的疾病容易发展为慢性。该病最早在乌干达发现,随后在芬兰、瑞典和俄罗斯等国家多次造成人感染和疾病流行,给人类健康带来了严重危害,具有重要的公共卫生意义[1-2]。目前,在我国不仅从多种蚊虫媒介中分离到多株SINV,而且还从发热患者血清中也分离到该病毒和检测到该病毒抗体[3-4],提示我国也可能存在辛徳毕斯病毒病流行。

SINV是披膜病毒科(Togavirudea)甲病毒属病毒(Alphavirus)的一种虫媒病毒[5],蚊虫为其主要传播媒介,鸟类为其主要动物宿主。SINV地理分布非常广泛,在非洲、亚洲、大洋洲和欧洲都有此病毒引起的疾病发生[6-8]。病毒感染宿主和媒介种类也非常多,目前从多种蚊虫、蜱和人中分离到该病毒[3-5],但未见在蠓中分离到SINV的报道。本研究2013年在云南省德宏傣族景颇族自治州(德宏州)芒市采集的蠓中分离到1株阳性分离物,并对该分离物进行系统的分子生物学鉴定,明确该分离物的分类地位及与其遗传进化,为进一步开展SINV与当地人或动物疾病关系的研究和防控提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 蠓标本采集

2013年7月在云南省德宏州芒市风平镇的牛圈和羊圈采集蠓标本,于18:00至次日07:00采用灯诱的方法(功夫小帅12 V,300 mA,武汉市吉星环保科技有限责任公司)捕获蠓。捕获的蠓放入-20 ℃冰箱约30 min,每管100只分装编号后迅速放入液氮罐中保存。

1.2 蠓标本研磨及病毒分离

从液氮罐中取出蠓标本,在生物安全柜中把蠓倒入预冷的研磨器中,加入1 ml研磨液(MEM,100 U/ml青霉素,100 μg/ml链霉素,pH值7.0~7.2)进行充分研磨,4 ℃、离心半径7 cm,8 000 r/min离心10 min。分别取150 μl研磨液上清接种长满单层的金黄地鼠肾细胞(BHK-21)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)细胞(C6/36),分别置于37 ℃(BHK-21细胞)和28 ℃(C6/36细胞)培养箱内培养,每天观察细胞病变(cytopathic effect,CPE),连续盲传3代,每代连续观察7 d。

1.3 RNA提取及cDNA合成

采用Trizol试剂(TaKaRa公司,大连)从阳性分离物细胞悬液中提取总RNA。按照试剂盒说明书用Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)试剂盒(TaKaRa公司,大连)进行反转录合成第一链cDNA。

1.4 病毒分子生物学鉴定

参照文献[9]以cDNA为模板先采用披膜病毒科甲病毒属、黄病毒属和布尼亚病毒属特异性引物进行PCR扩增,扩增产物测序,在美国国立生物技术信息中心(NCBI)中进行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对,对阳性分离物进行初步鉴定。参考NCBI上MRE16(AF492770,U90536)株NS1基因序列设计2对引物MX1F、MX700F(正向引物:5'-ATTGGCGGCGTAGTACACAC-3'、5'-GAAGGCAGGACAGGAAAGTTG-3')和MX1170R、MX1894R(反向引物:5'-CCGTTGATGACAATCCTCTG-3'、5'-ATGGTAGAGTTTGCGGTTCAC-3')进行PCR扩增,在25 μl反应体系中分别加入0.3 μl EX Taq聚合酶、2.5 μl 10 × EX Taq Buffer、2.0 μl 2.5 mmol/L dNTP、正反向引物各0.5 μl、17.2 μl RNase-free ddH2O、cDNA2.0 μl,反应程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃30 s,50 ℃30 s,72 ℃80 s,共35个循环;最后72 ℃10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带,送北京擎科生物科技有限公司昆明分公司进行测序。

1.5 基因序列分析

从GenBank中下载7株SINV以及1株西方马脑炎病毒NS1基因序列,毒株具体背景信息见表 1。用DNAStar中SeqMan软件对所有测序得到的结果进行序列拼接;使用Clustal X Version 1.8及DNAStar软件中MagAlign进行病毒基因序列比对及同源性分析;利用MEGA 6.0软件完成基于Neighbour-joining(NJ)方法的系统进化树的绘制,Bootstrap值为1 000。

表 1 本实验中使用的辛德毕斯病毒毒株背景信息 Table 1 Background information of the Sindbis virus strains used in this study
2 结果 2.1 病毒分离

2013年7月在云南省德宏州共采集4 500多只蠓,约100只1批,分44批进行病毒分离,获得多株阳性分离物,其中1株分离物(编号:YN222)在BHK-21和C6/36细胞上均产生明显的CPE,病变特点分别为在接种BHK-21细胞24 h后细胞出现圆缩、肿胀、脱落;在接种C6/36细胞72 h后细胞折光性增强、聚集、最后脱落。见图 1

注:A 表示BHK-21细胞对照(24 h);B 表示接种YN222的BHK-21细胞(24 h);C 表示C6/36细胞对照(72 h);D 表示接种YN222的C6/36细胞(72 h)。 图 1 YN222分离株感染BHK-21、C6/36细胞后引起的细胞病变 Figure 1 Cytopathic effect of BHK-21 and C6/36 cells caused by the infection with YN222 isolate
2.2 病毒初步鉴定

采用甲病毒属特异性引物对YN222进行RT-PCR扩增,结果大约在430 bp处出现明显的电泳条带,而黄病毒属和布尼亚病毒属引物扩增均为阴性。测序后获得的序列经BLAST比对发现YN222与马来西亚分离的MRE16株核苷酸同源性最高,为93.7%,初步鉴定蠓中新分离病毒(YN222)为SINV。

2.3 蠓虫分离病毒NS1基因序列核苷酸和氨基酸同源性分析

采用SINV NS1基因特异引物对YN222进行RT-PCR扩增,扩增阳性,测序获得YN222株NS1基因全长序列(1 605 nt,编码535 aa),将该段序列与GenBank中其他不同宿主、不同时间及地区分离的SINV进行核苷酸和氨基酸的同源性分析(表 2),结果显示蠓分离YN222株病毒与2005年在云南省勐海县采集蚊虫分离的MX10-LP、MX10-SP同源性最高,核苷酸分别为99.6%和99.5%,氨基酸同源性分别为99.4%和99.4%;其次与马来西亚蚊虫分离的MRE16株病毒核苷酸同源性为93.7%,氨基酸同源性为99.4%,与澳大利亚蚊虫分离的18953株病毒核苷酸同源性为93.5%,氨基酸同源性为99.2%;而与1987年云南省发热病人分离的YN87448核苷酸同源性仅为80.3%,氨基酸同源性仅为90.0%;与我国新疆以及欧洲、非洲等地区蚊虫和病人分离的SINV核苷酸和氨基酸同源性较低,均低于80.6%和90.9%。

表 2 YN222分离株核苷酸与氨基酸序列同源性分析 Table 2 Homology analysis of nucleotide and amino acid sequences in the YN222 isolate
2.4 YN222分离株NS1基因系统进化分析

将蠓新分离病毒YN222与GenBank中下载的10株SINV和2株云南省蚊虫分离的SINV以及1株西方型马脑炎病毒(WEEV-71V-1685)的相应基因序列一起采用MEGA 6.0软件构建系统进化树(图 2),结果显示:蠓新分离病毒株YN222与12株SINV处于同一进化分支,提示蠓新分离病毒YN222是SINV;进一步分析结果显示所有12株SINV形成3个相对独立的进化分支,第1个进化分支(Paleoarctic/Ethiopian genotype)由欧洲、非洲分离株以及中国新疆XJ-160株和云南YN87448株病毒形成,第2个进化分支(Oriental/Australian genotype)由马来西亚MRE16株及澳大利亚18953株和中国云南分离的MX10-LP和SP株病毒形成,第3个进化分支(Wester/Australian genotype.)由澳大利亚西部地区分离的SW6562株病毒形成。本次研究蠓分离的YN222株病毒与云南省2005年蚊虫分离的MX10-LP、MX10-SP和马来西亚1990年蚊虫分离的MRE16株及澳大利亚18953株位于第2个进化分支(Oriental/Australian genotype)内。

注:●表示本研究分离病毒株;P/E 为Paleoarctic/Ethiopian genotype;W/A 为Wester/Australian genotype;O/A 为Oriental/Australian genotype。 图 2 YN222分离株NS1基因(1 605 bp)系统进化分析 Figure 2 Phylogenetic analysis of NS1 gene (1 605 bp) in the YN222 isolate
3 讨论

在已知的虫媒病毒中SINV是分布最为广泛的病毒。该病毒不仅能引起人类发热、皮疹和关节炎,更重要的是它所引起的疾病容易发展为慢性疾病,对人类的健康造成严重危害[1-2],近些年来在我国很多地区健康人、发热患者血清中均查到了SINV抗体[10],在野兔、狐狸、犬等动物体内也检测到SINV抗体[11],证实了该病毒在我国多个地区存在广泛感染。本研究从云南省德宏州采集到的蠓标本中分离到1株病毒均能引起BHK-21、C6/36细胞产生明显的CPE,在BHK-21上产生CPE非常迅速,这些特点与甲病毒属病毒相似[5]。采用甲病毒属特异性引物和SINV NS1基因特异引物扩增均为阳性,提示该蠓新分离病毒YN222可能为披膜病毒科甲病毒属病毒。序列分析结果显示蠓中新分离病毒YN222与澳大利亚东方型SINV位于同一进化分支内,核苷酸和氨基酸同源性也较高(核苷酸 > 93.7%,氨基酸 > 99.4%),提示本研究在德宏州芒市采集蠓分离的病毒YN222为澳大利亚东方型SINV,这是首次在蠓中分离到SINV。

蚊虫是SINV的主要传播媒介。目前不仅从三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)、中华按蚊(Anopheles sinensis)、埃及伊蚊(Ae. aegypti)等多种蚊虫中分离到SINV[3, 5, 12],从蜱中也分离到该病毒[13],提示SINV传播媒介种类比较广泛。本研究首次从蠓中分离到SINV,该病毒与2005年云南省蚊虫分离的病毒遗传进化关系最密切,核苷酸同源性也最高为99.5%和99.6%,提示蠓可能作为一种SINV潜在的传播媒介,是否参与了当地SINV的自然循环还有待进一步研究。

德宏州地处云南省西部,属于南亚热带季风气候,具有海拔低、气温高、雨量多等特点,优越的气候条件非常适合各类媒介昆虫的生长繁殖,有利于虫媒病毒病在媒介昆虫和宿主动物之间循环传播,因此虫媒病毒种类较多。有研究结果提示,云南省德宏州存在流行性乙型脑炎病毒、登革病毒[14]、蓝舌病毒[15]、芒市病毒[16]、西藏环状病毒[17]等多种与人或动物疾病相关的虫媒病毒的流行,此次从云南省德宏州芒市牛圈采集的蠓虫中分离到SINV,提示该地区存在发生该病的风险,今后应加强对该地区SINV等虫媒病毒传播媒介及相关人或动物疾病的监测,了解该地区人或动物辛徳毕斯病等虫媒病毒病的流行及危害,为人或动物相关虫媒病毒病的研究和防治提供科学依据。

利益冲突  无

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