中国媒介生物学及控制杂志  2021, Vol. 32 Issue (4): 422-427
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蚊虫不仅骚扰吸血，还可以传播多种蚊媒病。目前已知的黄病毒属和甲病毒属等蚊媒病毒，能够引起流行性乙型脑炎(乙脑)、登革热、黄热病、寨卡病毒病和西尼罗热等多种疾病[1-2]。其中乙脑、登革热等蚊媒病曾多次引起世界大流行[3-5]。随着全球气温升高，旅游和贸易行业的迅速发展，生态环境的不断改变，新发、再发蚊媒传染病呈现流行范围扩大、发病率升高的趋势，因此进行蚊虫及蚊媒病毒的调查研究不仅可以获得蚊虫及已知蚊媒病毒的新动态，也有望发现新的病毒，为预测蚊媒疾病的流行风险[6-7]提供科学依据。
贵州省地处中国西南内陆，界于北纬24°37′~29°13′，东经103°36′~109°35′，其北部是四川省和重庆市，南部与广西壮族自治区毗邻，西边与云南省相连，湖南省在其东部，全年气候较为湿润，属于亚热带季风气候，年平均气温及降雨量为15 ℃和1 200 mm，相对湿度78%~84%，该地的自然环境、地形和潮湿气候极适宜蚊虫孳生及蚊媒病毒传播。近些年，多个研究团队在贵州省进行虫媒病毒调查时检测到盖塔病毒和多株乙脑病毒(JEV)[8-11]。2011年在贵州省部分县(市)有11人出现登革热抗体阳性/可疑阳性，平均感染率为2.08%[12]。2016年在贵州省德江县进行的蚊媒病毒调查，在多种蚊虫体内检测到JEV和版纳病毒，并且还在致倦库蚊(Culex pipiens quinquefasciatus)和骚扰阿蚊(Armigeres subalbatus)中分离出寨卡病毒[13-14]，这是我国首次在野外蚊虫中检出此病毒。基于目前的研究背景，为了解贵州省的蚊种及相关蚊媒病毒的基本情况，本研究对贵州省部分地区开展蚊种调查和病毒检测，明确当地的优势蚊种和病毒种类，为预测蚊虫传染病的流行风险提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 蚊虫标本采集2019年6月在贵州省黔东南苗族侗族自治州黎平县中潮镇和贵阳市乌当区羊昌镇开展蚊虫采集(图 1)。使用紫外诱蚊灯法于每天20：00至次日08：00在猪圈、羊圈等生境捕捉蚊虫，诱蚊灯为光催化捕杀蚊蝇器(武汉市吉星环保科技有限责任公司提供，波长360~380 nm，灯泡功率8 W，型号LTS-M02D)。将采集的蚊虫标本置于冰排上，快速进行蚊种分类鉴定。将鉴定后的蚊虫按不同时间、地点、种类分装至冻存管，三带喙库蚊(Cx. tritaeniorhynchus)和中华按蚊(Anopheles sinensis)每管50只，骚扰阿蚊每管25只，置于超低温冰箱(-80 ℃)保存，最后用固体干冰将蚊虫样本密封保存后，运输至中国疾病预防控制中心传染病预防控制所媒介生物控制室备用。
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| 图 1 2019年6月贵州省蚊虫采样点 Figure 1 Mosquito sampling points in Guizhou province in June 2019 |
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使用RNA提取试剂盒(QIAGEN，Germany公司)依据说明书提取蚊虫病毒RNA，然后将RNA置于-80 ℃冰箱保存备用。使用RNA反转录试剂盒(QIAGEN，Germany公司)制备cDNA。最后使用黄病毒属(JEV、登革病毒、寨卡病毒、黄热病毒、西尼罗病毒)和甲病毒属(辛徳毕斯病毒、基孔肯雅病毒)通用引物进行病毒鉴定，引物序列来自本实验室研究设计[15]，引物序列、扩增片段等引物信息见表 1、2。
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PCR扩增体系为25 μl，包括Mix 12.5 μl、cDNA模板1 μl、10 μmol/L的正反向引物各1 μl、ddH2O 9.5 μl。待PCR反应结束，取产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，观察有无扩增的目的条带，有条带的PCR产物送至北京擎科生物技术有限公司测序。将反馈序列在美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站的GenBank上进行BLAST分析，确定蚊虫体内病毒种类。
1.4 构建系统发育树采用MEGA 7.0软件邻接法(Neighbor-joining，NJ)构建NJ进化树，对乙脑基因核苷酸序列进行系统进化分析，Bootstrap值为1 000。在GenBank上下载不同国家、时间、宿主、基因型的乙脑E基因核苷酸序列。
2 结果 2.1 蚊虫采样情况2019年6月在贵州省2个采集点共采集蚊虫3属9种，包括中华按蚊、微小按蚊〔An. (Cellia) minimus〕、三带喙库蚊、迷走库蚊(Cx. vagans)、致倦库蚊、褐尾库蚊(Cx. fuscanus)、刺扰伊蚊(Aedes vexans)、白纹伊蚊(Ae. albopictus)和骚扰阿蚊。其中中华按蚊数量最多，占捕获总数的50.47%(13 712/27 169)；三带喙库蚊与中华按蚊相差较小，占比为45.80%(12 444/27 169)；其他蚊虫最少，仅占0.26%(70/27 169)。对比2个采样点，中潮镇的优势蚊种为三带喙库蚊，占该地捕蚊总数的70.22%(8 690/12 376)；羊昌镇优势蚊种为中华按蚊，占该地捕蚊总数的68.88%(10 189/14 793)。见表 3。
本次采集蚊虫标本563批，将蚊虫进行研磨，然后从上清液提取核酸RNA后，进行反转录，最后对黄病毒属和甲病毒属病毒基因采用通用引物扩增和测序。结果显示贵州省黎平县编号LK6110三带喙库蚊的RT-hemi-nested PCR黄病毒属通用引物扩增出阳性条带(图 2)，未发现甲病毒属扩增条带，将测序结果经BLAST比对为基因Ⅲ型JEV。
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| 注：M 表示DNA marker；1 表示阴性对照；12 表示LK6110 PCR产物；2～11 均为阴性结果。 图 2 蚊虫黄病毒属鉴定结果 Figure 2 Identification of mosquito-borne Flavivirus |
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将检测测序得到的JEV E基因核酸序列LK6110与GenBank上下载的58株JEV以及墨累谷脑炎病毒(OR156)构建E基因的系统发育树。结果显示，LK6110与基因Ⅲ型JEV同为一个进化分支，LK6110与Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ型JEV进化关系稍远，与墨累谷脑炎病毒(OR156)毒株区别较大。进化分析显示，LK6110与JEV基因Ⅲ型SA14福建省分离株进化关系较近，同源性最高为98%。见图 3。
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| 注：▲本研究检测到的流行性乙型脑炎（乙脑）病毒；JEV 表示乙脑病毒。 图 3 乙脑病毒E基因核苷酸序列系统进化分析结果 Figure 3 Phylogenetic analysis of the nucleotide sequence of the E gene in Japanese encephalitis viruses |
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贵州省地形复杂多变，常年气候湿润，雨水较多，属于亚热带季风气候，适宜蚊虫的孳生。贵州省的蚊种总计7属70多种，以中华按蚊、三带喙库蚊、淡色库蚊(Cx. pipiens pallens)、白纹伊蚊、骚扰阿蚊等为主[16]。本研究共采集蚊虫3属9种27 169只，以三带喙库蚊和中华按蚊数量较多，为本次贵州省采样地的优势蚊种。宋颂等[10] 2017年8月在贵州省采集蚊虫3属3种，以中华按蚊和骚扰阿蚊为优势蚊种，薛志静等[11]2018年8月在贵州省共采集蚊虫3属4种17 018只，骚扰阿蚊和三带喙库蚊为当地优势蚊种。上述研究结果与本次调查结果存在一定差异，原因可能是采样地点不同、采样生境不同以及骚扰阿蚊的活动高峰一般出现在7－8月[17]，但综合来看贵州省的优势蚊种主要是以三带喙库蚊和中华按蚊为主。本研究采集到的蚊虫种类相对单一，因为不同时间活动的蚊虫种类有较大差异，白天活动的蚊虫大多以伊蚊为主，夜间活动蚊虫大多以库蚊、阿蚊和按蚊为主[18-19]。而本次采集时间设定为20：00到次日08：00，并且灯诱法对于库蚊的捕获率较高，因此伊蚊数量较少，三带喙库蚊和骚扰阿蚊较多。
目前，蚊媒传染病在全世界广泛分布，据世界卫生组织2014年调查显示，全世界致死人类最多的动物就是蚊虫，死亡人数达到725 000例，可见蚊虫传染病严重威胁着人们的健康。近年来，由于全球气温升高、国际间的频繁交流将导致新旧虫媒传染病的出现以及范围扩大，蚊媒病毒的传播风险大大增加，使原来已经得到有效控制的蚊媒病又重新出现并有不同程度的流行，对我国的公共卫生安全带来极大挑战[12-22]。乙脑是我国主要流行的蚊媒病之一，Wang等[9]对1949－2005年我国不同地区135株JEV分离株进行分析，发现Ⅰ型JEV于1979年左右传入我国，Ⅰ和Ⅲ型JEV在我国流行；2006年Ye等[23]对贵州省1 382例患者进行临床诊断，其中1 210例(87.55%)确认为乙脑，并分离到2株Ⅰ型JEV，2010年Wang等[24]从贵州省乙脑患者脑脊液样本中首次分离出JEVⅠ型株，该菌株与从蚊虫中分离出的其他JEVⅠ型菌株高度相似。2019年6月本研究在贵州省黎平县中潮镇和乌当区羊昌镇采集蚊虫标本，对比薛志静等[11]2018年8月在黎平县的采样结果发现不同季节采集到的蚊虫种类区别明显；在乌当区采集蚊虫时，正值该地连续的降雨天气，采集蚊虫以中华按蚊为主，由此可知降雨对于蚊虫的生活习性可能也有较大影响。2017年宋颂等[10]在贵州省德江县分离出Ⅰ型JEV，2018年薛志静等[11]在贵州省从江县和乌当区分别分离到Ⅰ型和Ⅲ型JEV，本次样本检测出1株病毒，通过序列和系统进化分析对比，该株病毒为Ⅲ型JEV，未检出其他种类的病毒。本研究虽未检出多种病毒，但在病毒出现初期，对于蚊虫及蚊媒传染病的早期调查显得尤为重要。此次在贵州省部分地区开展的蚊虫监测，首先为蚊虫体内携带病毒信息提供了新的数据资料；其次，对比之前相同地区分离到的同种病毒，证实了该地区仍是自然疫源地；最后提示我们乙脑风险依然不容忽视。
综合以上结果，本次蚊虫调查对于预测该地蚊媒传染病的流行具有重要意义[25-26]。
利益冲突 无
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表1(Table 1)
