喜马拉雅旱獭（Marmota himalayana）是青藏高原特有的野生动物，主要栖息在青藏高原区的各类草甸草原^[1]。布鲁氏菌病（布病）病原分为3个种6个生物型，菌种与宿主间有转移的现象，菌株也有变异发生^[2]。布病是自然疫源性疾病，自然条件下布鲁氏菌不但在人和一些家养动物中广泛分布，在野生动物中也存在。20世纪60年代，乌克兰等地的野生啮齿动物中，分离出大量的猪种布鲁氏菌^[3]。1995年在阿尔卑斯地区112只羚羊中有7只分离到牛种布鲁氏菌^[4]。Rhyan等^[5-6]分别在1994和2001年报道美国野牛中分离到牛种1型和2型布鲁氏菌，提示该地区野牛中存在不止1种感染源。在石渠县的喜马拉雅旱獭中进行布病血清学调查，阳性率为3.24%，未分离出布鲁氏菌^[7]。新疆地区475种野生动物材料进行布鲁氏菌培养，30 d未见布鲁氏菌生长^[8]。青海省天峻县喜马拉雅旱獭血清抗体阳性率为2.5%，未分离出布鲁氏菌^[9]。青海省哈秀地区的274份旱獭进行布病血清学调查，阳性7份，做布氏鲁菌培养，均为阴性^[10]；2016年底检测青海省青南地区245份喜马拉雅旱獭组织样品，布病抗体阳性13份，对13份样品进行布鲁氏菌培养，2017年分离出1株疑似菌株，针对这株疑似菌株初步采用微量生化管进行菌株生化鉴定。

1 材料与方法 1.1 菌株来源

3种布鲁氏菌标准菌株分别为标准疫苗株牛种菌104M、羊种菌M5、猪种菌S2；自青海省喜马拉雅旱獭分离出的菌株来自青海省黄南藏族自治州河南县区域，编号为34号。

1.2 主要仪器和试剂

恒温培养箱、生物安全柜、布氏琼脂（BD公司，批号为8241972）、细菌微量生化管（杭州滨和微生物试剂有限公司，批号为D3126）等，试剂和培养基均放置于4 ℃冰箱中保存。

1.3 方法

将3种布鲁氏菌标准菌株和34号菌株的第1代培养物，分别接种在布氏琼脂营养培养平皿上，放置在37 ℃培养箱中培养24~48 h。从不同培养皿中挑取典型单个菌落用无菌水制成1.5×10⁹的菌悬液，取1滴在洁净的载玻片上分别涂片进行革兰染色和沙黄染色，在高倍和低倍显微镜下观察染色后的细菌菌落形态、结构。随后进行布鲁氏菌单相特异性血清A、M、粗糙型（R）血清凝集试验，布鲁氏菌阳性血清凝集试验，布鲁氏菌染料抑菌试验，布鲁氏菌属噬菌体裂解试验和细菌微量管生化试验。试验操作过程均在生物安全柜中进行，加入样品的各生化管均用封口膜密封后放入37 ℃恒温箱。

1.4 诊断依据

布鲁氏菌鉴定依据《布鲁氏菌病防治手册》（1986版）^[11]。

2 结果 2.1 常规方法鉴定试验

对自喜马拉雅旱獭分离的菌株（编号34号）进行常规方法鉴定，同时用3种标准布鲁氏菌株进行对照试验，初步鉴定34号菌株为羊种布鲁氏菌。见表 1。

2.2 微量管生化试验

对34号菌株进行7种微量管生化试验，同时以3种标准布鲁氏菌株作参考对照，阴性对照是各生化管中加入无菌水，并分别在24、48和72 h观察结果。布鲁氏菌微量管生化试验显示，试验结果在24 h内观察最好，48 h后结果均受影响，会造成部分误判。从24~48 h内试验结果可以看出，牛种菌104M菌株氧化尿素、D-半乳糖，不氧化鸟氨酸、赖氨酸、山梨醇、木糖和葡萄糖酸盐。羊种菌M5菌株和34号氧化尿素，不氧化鸟氨酸、赖氨酸、D-半乳糖、山梨醇、木糖、葡萄糖酸盐。猪种菌S2菌株氧化D-半乳糖、木糖和尿素，不氧化鸟氨酸、赖氨酸、山梨醇、葡萄糖酸盐。34号菌株的微量生化试验结果接近羊种布鲁氏菌M5菌株。见表 2。

3 讨论

生化反应是细菌鉴定的重要依据，在细菌鉴定中由实验室自制培养基和生化试剂而引起的繁琐和误差，容易影响试验结果^[12]，微量生化管的应用是国内细菌鉴定方法上的改进，经济、方便、适用，在基层医院检验中广泛采用，常被用于多种常用生化培养基的质量控制^[13]。

本次试验采用的7种生化微量管是依据《布鲁氏菌病防治手册》中布鲁氏菌属分类氧化代谢试验要求，按照试剂公司配制好的试剂套餐选择的，其中木糖遇到空气性质不稳定、容易褪色；尿素管在空气中变红均会影响结果判断。生化微量管在4 ℃保存，2年内外观颜色稳定实验结果可靠^[14]，此次试验中试剂的保存适当，并在有效期内使用，试验过程迅速、生化管密封严密，对试验结果未造成影响。此次试验结果显示自喜马拉雅旱獭分离出的34号菌株的微量生化试验结果接近羊种M5菌株。

用细菌微量生化鉴定方法鉴定布鲁氏菌快速、简单，可为布鲁氏菌检验提供一个快速的辅助实验依据，但是对试验结果进行分析时，试验操作中菌悬液的浓度、生化管的使用方法、保存方法和反应时间等一系列的影响因素均应考虑。

利益冲突  无