布鲁氏菌病（布病）是由布鲁氏菌侵犯机体后引发的传染-变态反应性的人畜共患传染病，也是自然疫源性疾病。我国将其列为二类动物疫病，主要通过消化道、呼吸道、生殖道等传播，布病已经严重危害人类及家畜的健康^[1-3]。很多野生动物都能感染布鲁氏菌，包括喜马拉雅旱獭（Marmota himalayana）^[4]。青海省自20世纪80年代就调查过喜马拉雅旱獭感染布病的情况，调查结果表明针对布病抗体的血清学检查结果阳性，阳性率达到2.50%，但未分离到布鲁氏菌。本试验将2016年在青海省全省范围内收集的245份喜马拉雅旱獭全血，分离血清进行布病虎红平板凝集试验和试管凝集试验，把试验结果均阳性的7份全血利用血培养法进行细菌培养，分离纯化出1株疑似布鲁氏菌，提取DNA，制备模板后利用BCSP31-PCR和AMOS-PCR 2种方法进行属种鉴定。

恒温金属浴购自艾卡（广州）仪器设备有限公司，水平电泳仪DYCP-32C购自中国六一生物科技有限公司，超纯水仪SMART-N购自力新仪器（上海）有限公司，凝胶成像分析系统GeIDCCXR+IR+lmager购自美国伯乐公司，恒温混匀仪ThermoMixer C、生物安全高速离心机、各量程移液器均购自德国艾本德股份公司。

2×Taq PCR Master Mix、5×TBE、Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、灭菌去离子水、纯水、琼脂糖均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

2 ml离心管、各量程枪头、封口膜。

2016年收集的245份青海省喜马拉雅旱獭全血作为检测样本。

经虎红平板凝集试验和试管凝集试验检测均为阳性的血清所对应的全血注入双向培养瓶中，置于37 ℃培养箱中培养。选取单个疑似布鲁氏菌菌落接种于布氏琼脂平板上，37 ℃培养18~24 h，取培养物制备模板，同时进行涂片镜检、噬菌体裂解试验。

布鲁氏菌疫苗株S2、M5作为阳性对照菌株，大肠埃希菌、鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）弱毒株EV₇₆作为阴性对照菌株。

将分离自喜马拉雅旱獭全血的疑似布鲁氏菌培养18~24 h后，勾取适量菌放入加有灭菌去离子水的2 ml离心管，研磨制成菌悬液，8 000×g离心5 min，弃去上清液，利用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒按操作流程提取核酸。取模板总量的1/10做无菌实验，无菌实验结果阴性后方可拿出实验室用于其他实验。同时制备对照菌株的模板并做无菌实验，方法同上。

采用布鲁氏菌属特异性基因BCSP31作为种属基因，按照参考文献[5]提供的B4和B5引物序列合成引物，B4和B5引物序列及产物大小见表 1。

表 1 布鲁氏菌BCSP31-PCR引物序列 Table 1 BCSP31-PCR primer sequence of Brucella

表选项

采用参考文献[6]提供的布鲁氏菌属IS711插入序列为基础建立的AMOS-PCR法鉴别布鲁氏菌种/型，引物序列见表 2。

表 2 布鲁氏菌AMOS-PCR引物序列 Table 2 AMOS-PCR primer sequence of Brucella

表选项

采用25 μl反应体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μl，primer B4/B5各1 μl，模板1 μl，ddH₂O 9.5 μl。反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，扩增30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物在4 ℃保存。

采用25 μl反应体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μl，primer A、M、O、S各0.4 μl，primer IS711 1 μl，模板1 μl，ddH₂O 8.9 μl。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，扩增35个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物在4 ℃保存。

噬菌体裂解试验、BCSP31-PCR、AMOS-PCR的结果判定按照布鲁氏菌病诊断标准（WS 269-2019）^[7]进行判断。

经虎红平板凝集试验、试管凝集试验检测均阳性的全血共7份，其中试管凝集试验布病抗体阳性滴度在1∶50~1∶1 600。

分离出1株疑似布鲁氏菌（待测菌株），镜下观察，待测菌株的形态及染色特征为革兰阴性小杆菌，培养特性与布鲁氏菌相同^[7]。

待测菌株噬菌体裂解试验BK₂裂解，Tb不裂解，可与单相特异性血清A、M凝集，确定为羊种生物Ⅲ型布鲁氏菌^[7]。

将提取的大肠埃希菌、EV₇₆、S2、M5和待测菌株的核酸作为模板进行BCSP31-PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，待测菌株、阳性对照菌株S2、M5均在223 bp处出现特异条带，空白对照、阴性对照菌株大肠埃希菌、EV₇₆未出现条带，待测菌株属于布鲁氏菌属。见图 1。

注：M表示DNA分子质量标准；1空白对照；2大肠埃希菌；3鼠疫菌弱毒株EV76；4布鲁氏菌疫苗株S2；5布鲁氏菌疫苗株M5；6待测菌株。 图 1 不同菌株BCSP31-PCR扩增结果 Figure 1 BCSP3l-PCR amplification results of different strains

图选项

将提取的大肠埃希菌、EV₇₆、S2、M5、待测菌株的核酸作为模板进行AMOS-PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，待测菌株在731 bp处出现特异条带，待测菌株为羊种布鲁氏菌。见图 2。

注：M表示DNA分子质量标准；1空白对照；2大肠埃希菌；3鼠疫菌弱毒株EV76；4布鲁氏菌疫苗株S2；5布鲁氏菌疫苗株M5；6待测菌株。 图 2 不同菌株AMOS-PCR扩增结果 Figure 2 AMOS-PCR amplification results of different strains

图选项

布鲁氏菌是布病的病原体，属革兰阴性小杆菌，可以感染多种家养和野生的动物。受布病影响较大的有牛、羊、鹿等，它们与我国畜牧业的发展戚戚相关，此外还包括马鹿、狐狸、野兔、黄鼠、旱獭等野生动物^[4]，甚至是海洋哺乳动物环斑海豹和海象等^[8]。随着研究的深入，越来越多的野生动物体内分离出了布鲁氏菌。青海省自1983首次从野生岩羊中分离到3株布鲁氏菌后，又陆续从野生岩羊中分离出5株布鲁氏菌^[9]，从藏绵羊中分出1株布鲁氏菌^[10]。贵州省也从山羊中分离到布鲁氏菌^[11]。青海省全境属于青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地，对于喜马拉雅旱獭的研究自20世纪50代至今从未停止过，但仅从喜马拉雅旱獭血清中检测到布病抗体阳性，未分离到布鲁氏菌。

本实验利用2016年随机抽取的245份喜马拉雅旱獭全血，经虎红平板凝集试验和试管凝集试验筛查出7份布病抗体阳性全血，利用血培养的方法从这7份血液中分离出1株布鲁氏菌，并通过PCR技术鉴定出该株菌是羊种布鲁氏菌，与噬菌体裂解试验结果一致。PCR技术较之传统布病检测技术，特异性强、耗时短、操作简单^[12-13]，可用于布鲁氏菌的快速鉴定，而且与噬菌体裂解试验等传统布鲁氏菌鉴定方法的符合率非常高^[6]，在国内外的应用很广泛^[13-16]。BCSP31-PCR的引物是针对布鲁氏菌特异性的外膜蛋白BCSP31设计的引物序列，可在属的水平上鉴定布鲁氏菌属。AMOS-PCR则是根据布鲁氏菌插入序列IS711在不同种布鲁氏菌上位置的不同设计的引物，根据IS711基因在每一种布鲁氏菌拷贝数的不同，在不同的布鲁氏菌中能够得到不同的扩增片段，可以鉴定出牛种生物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型布鲁氏菌，羊种、猪Ⅰ型、绵羊附睾种。这2种PCR方法都是鉴别布鲁氏菌最常用的方法，操作简单，结果可靠。

研究表明，海洋哺乳动物海象布病的感染率为8.47%^[8]。1991年新疆野生动物布病感染情况调查结果旱獭感染率为0.92%^[4]，而青海省2016年随机抽取的245份喜马拉雅旱獭全血，经检测布病感染率为2.86%（7/245）。虽然很多动物都能感染布病，但布病在不同物种之间的传播机制还有待研究。Nielsen等^[8]认为环斑海豹感染布病的机制可能是随机发生的散发性感染，可能在发现布病抗体阳性地区发生了有限的动物流行病，而海象可能和环斑海豹是同一途径感染的布病。喜马拉雅旱獭感染布病机制，是否和海象一样是偶然感染，即一种动物流行病在另一种物种中散发性感染，这还需要我们进一步的研究。值得注意的是喜马拉雅旱獭作为鼠疫菌的保菌宿主，如果其既带有鼠疫菌又带有布鲁氏菌，在传播鼠疫的同时也会传播布病，那么专业技术人员在检测鼠疫样本的同时还要做好预防布病的准备，否则有感染布病和鼠疫的双重风险。

利益冲突  无