鼠疫是由鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）引起的人兽共患型传染病，在历史上曾经给人类造成巨大的灾难，在我国已查明有12种典型的鼠疫自然疫源地，内蒙古高原长爪沙鼠（Mongolian unguiculatus）鼠疫疫源地位于北纬37°24′，东经106°31′~114°50′之间^[1]，分布于内蒙古自治区（内蒙古），河北省、陕西省、宁夏回族自治区（宁夏）的29个县（市、旗），疫源地面积达139 912 km²，由相对独立的乌兰察布高原和鄂尔多斯高原两部分组成，近年来该疫源地动物疫情异常活跃，在多个地区连年流行。研究该疫源地鼠疫菌株的基因型，可以在疫情发生时进行流行病学调查，同时也为研究鼠疫菌株遗传进化规律奠定基础，为进一步防控疫情提供科学依据。成簇的规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是一类结构特殊的重复序列，由21~47 bp的同向重复序列（direct repeat，DR）和将它们隔离开来的间区序列（space）组成，广泛存在于原核生物基因组中^[2]，CRISPR的同向重复序列通常是保守的，间区序列即使在同一细菌中，不同的分离株其重复数量和种类也可能各不相同，所以可以作为靶标对鼠疫菌进行分型。鼠疫菌基因组中共存在3个CRISPR位点，本研究拟对分离自内蒙古高原长爪沙鼠鼠疫疫源地不同地区的鼠疫菌株进行基因型别鉴定并分析进化关系。

实验所用33株鼠疫菌均来自内蒙古高原长爪沙鼠鼠疫疫源地，其中21株分离自河北省康保县，其余12株鼠疫菌株DNA由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所鼠疫室提供，其中5株来自于内蒙古鄂托克旗和杭锦后旗，5株来自内蒙古乌拉特前旗，2株来自宁夏银川市，各菌株分离地点和宿主均具有良好的代表性。

PCR扩增仪（杭州博日科技股份有限公司），高速台式离心机（德国Eppendorf公司），水平电泳仪（北京市六一生物技术有限公司），凝胶成像仪〔基因科技（上海）股份有限公司〕。

DNA提取试剂盒购自Qiagen，PCR扩增试剂购自北京全式金生物技术有限公司，DL500 Marker购自宝生物工程（大连）有限公司，100 bp Marker购自北京赛百盛基因技术有限公司，琼脂糖购自西班牙Biowest。

3对引物序列分别为YPa-L：5' -AAT TTT TGC TCC CCA AAT AGC AT-3'，YPa-R：5'-TTT TCC CCA TTA GCG AAA TAA GTA-3'；YPb-L：5'-ATA TCC TGC TTA CCG AGG GT-3'，YPb-R：5'-AAT CAG CCA CGC TCT GTC TA-3'和YPc-L：5'-GCC AAG GGA TTA GTG AGT TAA-3'，YPc-R：5'-TTT ACG CAT TTT GCG CCA TTG-3'，由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，按照说明书进行稀释使用。

冻干菌株经营养琼脂培养基28 ℃ 24~48 h复苏，分离培养，然后用Qiagen DNA提取试剂盒，依照说明书提取鼠疫菌株DNA。

反应体系：2×PCR Supermix 15 μl，正、反向引物均为0.5 μl，超纯水13 μl，模板1 μl。扩增条件：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 40 s；退火58 ℃ 40 s；延伸72 ℃ 40 s，共30个循环；再延伸72 ℃ 5 min。

取扩增产物6 μl，Marker 6 μl，2%琼脂糖凝胶，150 V，20 min电泳后，经凝胶成像仪分析，对于扩增条带不清晰，或未出条带的菌株进行重复实验。

将PCR反应产物送北京睿博兴科生物技术有限公司进行双向测序，然后把拼接后的序列资料与美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库检索比对，得到DR序列与spacer序列，将序列与文献最新报道的CRISPR数据库比对，最后结果用Excel 2007软件整理保存，根据Cui等^[3]提出的命名方法和序列资料将间区序列命名和分型。最后用Bionumerics 7.6软件制作聚类图，分析其进化关系。

33株鼠疫菌共发现9种spacer，包括4种YPa，2种YPb，3种YPc，未出现新的间区序列。其中分离自河北省康保县、内蒙古乌拉特前旗及宁夏银川市的菌株在3个位点的间区序列一致，分别为a1-a2-a3、b1-b2、c1-c2-c3，而a56存在于内蒙古杭锦后旗和鄂托克旗的菌种中。见表 1。

表 1 长爪沙鼠鼠疫疫源地鼠疫菌间区规律聚积短回文重复序列（CRISPR）及分型结果 Table 1 Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) and genotyping results of Yersinia pestis strains in Mongolian unguiculatus plague foci

表选项

根据3个位点上的间区序列阵列，33株被测菌株CRISPR分为1个基因簇（Cb2），2个基因型（1和2'），2'为1个新的基因型，其间区序列阵列a1-a2-a3-a56为未报道过的新组合，聚类分析见图 1。

注：No表示菌株编号；Key表示软件输入序号；Location表示位点；YP表示间区位点。 图 1 33株鼠疫菌成簇的规律间隔短回文重复序列分型聚类分析结果 Figure 1 Results of the cluster analysis of 33 Yersinia pestis strains based on clustered regularly interspaced short palindromic repeat

图选项

内蒙古高原长爪沙鼠鼠疫疫源地的鼠疫菌由于世代存于内蒙古荒漠草原这一特定的生态系里，在漫长的进化过程中受环境条件的选择作用，形成了与其他型鼠疫菌在许多方面的差别，因而构成了该型鼠疫菌的特性。按照对甘油、硝酸盐、阿拉伯糖的代谢能力的生物分型标准和纪树立等^[4]的生态分型标准，该疫源地菌株属于中世纪生物型和鄂尔多斯高原生态型B群，这与既往研究结果相符^[5-6]，虽然这些研究结果在鼠疫的防控工作中发挥了重要的作用，但是基因组的差别是表型进化的遗传基础，表型一致的菌株其基因型未必相同，仅从表型无法判断鼠疫菌的亲缘关系和微进化差异。

CRISPR是一种特殊结构的重复序列，由同向重复序列和spacer构成，其间区序列的排布具有种群对应关系，而且研究发现CRISPR能够通过获得噬菌体上的部分序列作为新的spacer，来获得对该噬菌体的免疫能力^[7-8]，因此分析CRISPR位点的spacer阵列，就可以得到原核生物的进化历史。Cui等^[3]利用CRISPR技术将中国12块鼠疫疫源地的105株鼠疫菌分成11类49个基因型，每个基因型都存在于特定的地理位置中。本研究选用来自内蒙古长爪沙鼠鼠疫疫源地不同地区的菌株进行CRISPR分型，结果显示均为Cb2基因簇，这与中世纪生物型和B群鄂尔多斯高原生态型相符，但是来自于杭锦后旗和鄂托克旗的菌株在YPa间区序列中多一个a56，间区阵列为a1-a2-a3-a56，与文献中发表的基因2型间区阵列a1-a2-a3-a57不同，是一个新的基因2'型，而来自乌兰特前旗、康保和银川的菌株均为基因1型，相同的基因簇不同的基因型说明在这块鼠疫疫源地中鼠疫菌一直在稳定遗传的基础上存在一些微进化，这一推断与本作者之前所完成菌株差异区段（DFR）分型研究结果相符^[9-10]，来自于杭锦旗和鄂托克旗的菌株显示为G11型，而其他为G17和G20型。对于a56和a57间区序列的确认还需要进一步扩大菌株范围和数量进行实验。

内蒙古长爪沙鼠鼠疫疫源地按地理位置，分成以黄河为界的北部乌兰察布高原中温型荒漠草原和南部鄂尔多斯暖温型荒漠草原两块独立的鼠疫自然疫源地，乌拉特前旗在地理上属于乌兰察布高原，而鄂托克旗和杭锦旗属于鄂尔多斯高原地区，微生态的不同导致鼠疫菌在该地的微进化，可以假设中世纪型鼠疫菌先传到鄂尔多斯地区，然后基因进化失去a56或a57而进化为乌兰察布地区、康保和银川地区的菌株，用DFR分型也能看到这样的进化特征，如鄂尔多斯地区G11正是失去了DFR18和DFR12区段而分化为G17和G20型。

利益冲突  无