蜱是一类体外吸血寄生虫，属于节肢动物门，蛛形纲，寄螨总目，蜱总科，蜱目。世界已知蜱类有3科：软蜱科、硬蜱科和纳蜱科，18属近900种。我国已发现的蜱约有125种，其中软蜱有14种，硬蜱约有110种。蜱可携带细菌、病毒、螺旋体、立克次体等多种病原微生物，是仅次于蚊虫的第二大病原体传播媒介^[1]。正常情况下宿主体内有周密而复杂的凝血系统，一旦宿主皮肤或者血管受损就会启动内外源性凝血系统以阻止血液流失。但蜱为了实现在长达2周甚至更长时间内从其宿主体内源源不断地吸血，在吸血的同时会通过其唾液腺向宿主体内分泌并释放一些抗凝血的分子以干扰宿主血液凝固。这些抗凝血物质多为丝氨酸蛋白酶抑制剂，主要存在于蜱的唾液腺、唾液、卵以及淋巴细胞中^[2]。蜱唾液腺中的丝氨酸蛋白酶抑制剂可分为4组，分别为Kunitz型蛋白酶抑制剂、Kazal型蛋白酶抑制剂、富含半胱氨酸的胰蛋白酶抑制剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin^[3]。其中含有Kunitz型结构的蛋白酶抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂的主要类型，含有1个或者多个Kunitz结构域，在抗凝血、抗炎症和抗肿瘤中发挥着重要作用。蜱中已发现的含Kunitz结构域的分子有Amblyomin-X、Boophilin和Ixolaris等。现对蜱源Kunitz型蛋白酶抑制剂及其在抗凝血功能方面的相关研究综述如下。

Kunitz型蛋白酶抑制分子是丝氨酸蛋白酶抑制剂的家族成员之一。每个Kunitz结构域大约含有60个氨基酸残基，通过3对典型的链内二硫键形成稳定的空间结构。位于其P1活性位点的氨基酸（通常为精氨酸或赖氨酸）常充分暴露以便与其所抑制的蛋白酶结合。不同的丝氨酸蛋白酶抑制剂拥有1个或者多个Kunitz结构域^[4]。人们早在1898年就发现蜱的唾液腺中存在抗凝血的物质，直到1990年才从毛白钝缘蜱（Ornithodoros moubata）^[5]的唾液腺中分离到第1个含Kunitz结构域的蜱源抗凝血分子-蜱抗凝血肽。牛胰蛋白酶抑制剂（BPTI）是最为典型且已被深入研究的Kunitz型蛋白酶抑制剂，于1930和1936年分别被Kraut和Kunitz发现^[6]。而Kunitz型蛋白酶抑制分子可以含有1个Kunitz结构域（如BPTI）、2个Kunitz结构域〔如微小扇头蜱（Rhipicephalus microplus）的Boophilin^[7]〕或3个Kunitz结构域〔如组织因子途径抑制分子（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）〕。具有Kunitz结构的抑制分子可以抑制凝血因子的活性，尤其是抑制FⅩ、FⅢ-FⅦa复合物的活性，有的还可以抑制血小板聚集。通常，与抗凝血相关的大部分蜱源Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制分子都与TFPI同源^[8-9]。

凝血途径分为内源性凝血途径和外源性凝血途径。其中外源性凝血途径是指因血管内皮细胞受损，由内皮细胞释放的组织因子与FⅦ形成TF-FⅦa复合物之后激活FⅨ和FⅩ，FⅩa启动共同凝血途径、FⅨ激活内源性凝血途径，引发级联放大效应促进血液凝固形成血凝块，以阻止血液流失^[10]。促凝物质、抗凝物质和纤维蛋白溶解酶共同维持体内的平衡状态，如果某一种物质增多或是减少便会引发血栓或者出血。而组织因子抑制剂是一类抑制组织因子通路的物质。TFPI是含有2个或者3个Kunitz结构域的丝氨酸蛋白酶抑制剂。TFPI有4种亚型，分为TFPIα、TFPIβ、TFPIɣ和TFPIδ。α亚型和β亚型存在于所有动物体内，具有抗凝血功能。TFPIɣ仅存在于鼠体内，TFPIδ仅由人体内产生。由于本文着重介绍的是蜱，TFPIɣ和TFPIδ不产生于蜱体内，故对这2种亚型不做重点介绍。TFPIα具有K1、K2和K3三个Kunitz结构域，可以作用于FⅩa、TF-FⅦa复合物和凝血酶原酶。TFPIα在抑制FⅩa时，K1和K2都会发挥作用，K2与FⅩa结合，但还需K3、C末端和外源蛋白S共同作用于FⅩa。TFPIα抑制TF-FⅦa复合物时包括两步，首先是K2与FⅩa结合，然后K1与TF-FⅦa复合物结合从而抑制外源性凝血途径^[11]。TFPIα抑制凝血酶原酶时需要血小板或者是FⅩa活化的FⅤa的酸性结构，FⅤa的酸性末端与K2通过与FⅩa结合从而抑制凝血酶原酶。此过程只能抑制凝血酶原，一旦凝血酶原被活化将失去抑制作用。TFPIβ具有K1、K2两个Kunitz结构域和另一个特殊结构—糖基磷脂酰肌醇（GPI），GPI可以识别并且将TFPIβ锚定于内皮细胞表面，这种亚型只抑制FⅩa和TF-FⅦa复合物。TFPIβ在抑制FⅩa时，通过GPI识别并锚定于血管内皮细胞，K1和K2与FⅩa结合从而抑制其活性。TFPIβ抑制TF-FⅦa复合物时，TFPIβ直接增强抗组织因子的活性来抑制TF-FⅦa复合物。虽然TFPIα与TFPIβ都可以抑制FⅩa和TF-FⅦa复合物，但TFPIβ比TFPIα抑制凝血更直接而快速。但是TFPIα在体内的量要远远多于TFPIβ，被激活的量也要多于TFPIβ。如果体内TFPI缺乏第1个Kunitz结构域，K1就会出现消耗性凝血功能障碍。在血小板中主要是以TFPIα亚型为主，缺乏TFPIα时血栓的体积会增加但不会对止血时间产生影响。若TFPI增加就会导致严重出血倾向，尤其是对于血友病A或者血友病B的患者^[12]。所以TFPIα与TFPIβ在所有动物体内的凝血作用各有优势并且都是不可或缺的。

大部分研究表明，蜱的唾液腺分泌物中含有大量的含Kunitz结构域的蛋白酶抑制剂。蜱源Kunitz型蛋白酶抑制剂是蛋白酶抑制剂的第2大家族，其功能多样，可抑制血液凝固、血小板聚集、胰蛋白酶、离子通路等。其中抑制凝血的Kunitz结构物质有肩突硬蜱（Ixodes scapularis）的Ixolaris^[13]、微小扇头蜱的Boophilin、毛白钝缘蜱的Ornithodorin和塞氏钝缘蜱（O. savignyi）的Savvignin^[14]等。

Ixolaris是Narasimhan等^[15]在肩突硬蜱唾液腺中发现的凝血抑制分子，Ixolaris有2个紧邻的Kunitz结构域（K1、K2），具有高度的特异性，不与胰蛋白酶或者糜蛋白酶相结合。Ixolaris抑制FⅩa，先与FⅩa的肝素结合位点结合使得FⅩa的结合位点暴露，K1与FⅩa外露的位点相结合方式，虽然不像TFPI的K1与FⅩa典型的结合位点相契合，但是Ixolaris比TFPI的反应更迅速。Ixolaris抑制FⅩa时，像TFPI一样分两步抑制TF-FⅦa/FⅩa复合物，首先K2与FⅩa或者FⅩ结合，然后K1与TF-FⅦa复合物结合。但与TFPI不同的是Ixolaris不需要活化FⅩ，它对FⅩa或者FⅩ具有相同的亲和力^{[11, 16-17]}。并且Ixolaris/FⅩ与TF-FⅦa结合非常灵敏，即便体内有少量的Ixolaris与FⅩ结合也有明显的抗凝血作用。毛白钝缘蜱的Ornithodorin、塞氏钝缘蜱的Savvignin和陌湖锐缘蜱（Argas monolakensis）的Monobin抑制凝血酶的方式，同样不遵循典型的Kunitz抑制机制，而是通过N末端的氨基酸序列完成的，C末端的氨基酸序列则与凝血酶的纤维蛋白原的外泌体Ⅰ结合。同时Decrem等^[18]发现蓖子硬蜱（I. ricinus）中的重组接触相抑制剂（Ir-CPI）含1个Kunitz结构域能与接触相因子FⅫa、FⅪa和激肽释放酶（Kallikrein）特异性反应，并延长活化部分凝血活酶时间（aPTT）。FⅪ和FⅫ也是血栓形成的靶点，Ir-CPI能够在体内抑制血栓的形成而不影响体内的出血和凝血因子的活性。长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）的Haemaphysalin也含单个Kunitz结构域，其干扰接触相因子FⅫ与前缓激肽酶相互作用^[19]。亚洲璃眼蜱（Hyalomma asiaticum）唾液腺释放的HA11是一种能够抑制血液凝固的含Kunitz结构域的新型蛋白质^[20]。褐黄血蜱（H. flava）在吸血的过程中会通过唾液腺向宿主体内释放热休克同源蛋白70（HSC70），而He等^[21]进一步研究发现重组HSC70是一种抗凝血剂，其抗凝血活性可能与对凝血酶的抑制和纤维蛋白原向纤维蛋白的转化有关。Boophilin是从微小扇头蜱的唾液腺中发现的含有2个Kunitz结构域（K1、K2）的凝血酶抑制分子。Assumpção等^[22]在微小扇头蜱的中肠中也发现了Boophilin，它是一种具有体外抗凝血和抗血栓活性的蛋白酶抑制剂。Boophilin还可使组织蛋白酶G和纤溶酶诱导的血小板聚集失效，并部分影响弹性蛋白酶介导的TFPI的裂解。通过酰胺溶性分析和表面等离子体共振实验，证实Boophilin是一种典型的非竞争性凝血酶抑制分子。Boophilin的N末端有典型的反应环，在抑制凝血酶时，其N末端首先插入到凝血酶的活性位点，其C末端的Kunitz结构随后与凝血酶的识别位点-I（ExositeI）结合从而抑制凝血，故其作用机制依赖于识别位点-I和催化位点。除此之外，Boophilin还可作用于FⅪa影响FⅪ的活化。一些研究表明，Boophilin还可能抑制FⅤ-FⅩa复合物，通过N末端活性位点环结合于MzT（凝血酶的中间产物），K1结构域与FⅩa的活性位点相结合，K2结合于MzT的外结合区域，从而增强对凝血途径的抑制作用^[23]。可见，蜱源Kunitz型凝血酶抑制剂不仅存在蜱的唾液腺中，也存在于蜱的中肠。尽管其结构相似，但作用机制存在差异。通过对以上Kunitz型凝血抑制分子的介绍可以发现，不同蜱的Kunitz型凝血抑制分子的作用靶点各异，它们都会干扰内源性凝血通路和外源性凝血通路，多数会以FⅩ为靶点。与TFPI型抑制剂典型的结合方式相比，多数蜱源Kunitz型凝血抑制分子（如Ixolaris，Boophilin）与其抑制蛋白通过不典型方式结合。

从附尾扇头蜱（Rh. appendiculatus）中提取的蛋白酶抑制剂是一种有效的β-类胰蛋白酶抑制剂，但与其他含有Kunitz结构的蛋白酶抑制剂不同，它对尿激酶、凝血酶、FⅩa、FⅫa、弹性蛋白酶和糜蛋白酶都起不到抑制作用。在肩突硬蜱的唾液腺中发现的1种含Kunitz结构域的丝氨酸蛋白酶抑制剂，与人的皮肤的胰酶具有高度的亲和力，主要抑制胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、人皮肤的胰酶（HSTb）、纤溶酶和基质酶^[24]。Blisnick等^[25]证明，篦子硬蜱（I. ricinus）的丝氨酸蛋白酶抑制剂IrSPI对组织因子途径诱导的凝血、纤溶、内皮细胞血管生成或凋亡没有影响，但该蛋白表现出免疫调节活性，特别是IrSPI可抑制CD4⁺ T淋巴细胞的增殖和巨噬细胞促炎细胞因子的分泌。卡延花蜱（Amblyomma cajennense）的Amblyomin-X是一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的重组蛋白，结构与TFPI相似，可以非竞争性地抑制FⅩa和凝血酶原酶的活性，还能促进肿瘤细胞的毒性反应，并且可以影响血管内皮生长因子A诱导血管的生成过程^[26]，Amblyomin-X不仅可以作为化疗的药物而且可以改善化疗患者的高凝状态^[27-28]。

Kunitz型蛋白酶抑制分子是自然界广泛分布的蛋白质之一，它不仅存在于动物体内，还存在于植物体内。从胰腺中提取的BPTI，能抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、溶血纤维蛋白酶等多种酶的活性，已用于急性胰腺炎的治疗、心脏外科手术体外循环、脑血管疾病的防治等^[29]。从大豆中提取的Kunitz型蛋白酶抑制剂能抑制人卵巢癌细胞系HRA细胞中尿激酶纤维蛋白溶酶原激活因子的上调^[30]。蜱源Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂一般被作为研发抗蜱疫苗的候选抗原，用于预防宿主被蜱感染^[31-32]。蜱源Kunitz型抗凝血分子有许多种类，对凝血途径也有明显的抑制作用。但大部分蜱源抗凝血物质的作用机制尚待明确。期待在今后的研究中能发现更多的蜱源Kunitz型抗凝血物质，并在药理水平上研究蜱与宿主之间相互作用的机制。蜱源Kunitz型蛋白质分子不仅可以用于研发抗凝药物，其在抗血栓、抗纤维蛋白溶解、抗炎症、抑制免疫功能和抗肿瘤等方面都具有良好的研究前景。

利益冲突  无